全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (2): 149–156, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.02.002

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收稿日期: 2009-02-27; 接受日期: 2009-07-02
基金项目: 863计划(No.2007AA10Z105)、国家自然科学基金(No.30670193)和教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-05-0224)
* 通讯作者。E-mail: wangnn@nankai.edu.cn
大豆诱导型启动子驱动类受体蛋白激酶GmSARK
转基因植物分析
徐凡, 李鹏丽, 安宝燕, 苑玲玲, 孟涛, 岳慧琴, 王宁宁*
南开大学生命科学学院, 天津 300071
摘要 植物LRR型类受体蛋白激酶在植物生命活动中发挥着重要作用。前期研究发现, 大豆(Glycine max)LRR型类受体蛋
白激酶基因GmSARK可能参与调控大豆叶片的衰老过程。利用CaMV 35S启动子驱动组成型过表达GmSARK基因可导致
转基因植株出现致死表型, 据此构建了可诱导型启动子GVG驱动GmSARK基因过表达的双元表达载体, 转化野生型拟南
芥(Arabidopsis thaliana)并获得了多株转基因植株。研究结果表明, 外源施加诱导物地塞米松可引起GmSARK基因在转基
因植株中过表达, 并导致转基因植株出现叶片变黄下卷和生长受抑制等表型; 外源细胞分裂素处理可以抑制GmSARK的表
达, 但是不能逆转GmSARK过表达所引起的上述变化。
关键词 拟南芥, 细胞分裂素, GmSARK, 衰老, 大豆
徐凡, 李鹏丽, 安宝燕, 苑玲玲, 孟涛, 岳慧琴, 王宁宁 (2010). 大豆诱导型启动子驱动类受体蛋白激酶GmSARK转基因
植物分析. 植物学报 45, 149–156.
衰老是植物个体发育过程中的一个必经阶段, 受
遗传程序的严格控制。植物叶片的衰老受到内部发育
信号和外部各种环境因子的协调控制(Guo and Gan,
2005)。目前衰老程序的启动、传递、衰老进程的控
制以及内外部调控因子之间的相互作用机制等已经
成为研究热点。
植物类受体蛋白激酶(receptor-like protein kina-
ses, RLKs)是一类包含胞外域、单次跨膜域和胞内激
酶域的蛋白分子, 它们可以通过受体域与胞外信号分
子特异结合来激活胞内激酶域的自磷酸化和磷酸化
活性, 完成跨膜传递信号的功能(Stone and Walker,
1995)。现已证明, 类受体蛋白激酶在植物多种发育
过程及抗逆信号转导中发挥重要作用 (He et al.,
2000; Lee et al., 2004; Junga et al., 2004; Shpak et
al., 2004; Van der Graaff et al., 2006; 李大红等,
2008)。与衰老相关的类受体蛋白激酶已有报道, 如
豌豆 (Pisum sativum)的类受体蛋白激酶基因Pv-
SARK在叶片衰老过程中表达上调 (Hajouj et al.,
2000); 此外, 在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中大
约有610个基因的编码产物为类受体蛋白激酶。基因
芯片分析结果表明, 其中至少有25个RLKs在衰老叶
片中表达, 并有5个RLKs在衰老叶片中表达显著上
调(Guo et al., 2004; Wang et al., 2008), 但对这些
基因在叶片衰老过程中的具体功能和作用机制尚未
见深入研究。
在前期实验中 , 我们从人工诱导衰老的大豆
(Glycine max)叶片中克隆了1个受衰老上调的LRR型
类受体蛋白激酶基因GmSARK, 利用RNA干扰(RNA
interference, RNAi)技术敲除(knock-down)该基因的
表达可以明显延缓转基因大豆叶片的衰老; 而CaMV
35S启动子驱动该基因过表达则造成转基因植株早衰
和死亡, 暗示GmSARK可能作为衰老信号转导的重
要组分直接参与大豆叶片衰老的调控过程(Li et al.,
2006)。为了深入探讨GmSARK基因调控大豆叶片衰
老的分子机制, 本研究构建了可诱导型启动子GVG
驱动该基因过表达的双元表达载体, 并利用农杆菌介
导的方法转化拟南芥。通过外源施加诱导物地塞米松
(dexamethasone, DEX)观察GmSARK过表达对转基
因拟南芥幼苗生长发育的影响, 并初步检测了外源细
胞分裂素对GmSARK表达及功能的影响。
·研究论文·
150 植物学报 45(2) 2010
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料与培养条件
实验所用的植物材料为模式植物拟南芥(Arabidopsis
thaliana L.)Columbia(Col)生态型, 由本实验室保存。
生长条件: 温度为(21±1)°C, 16小时光照/8小时黑暗
(长日照)。

1.1.2 质粒与菌株
大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株用于感受态细
胞的制备。根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaci-
ens)GV3101菌株用于拟南芥的遗传转化。含有目的
基因的克隆载体为pMD-18T-GmSARK(已在前期实
验中完成)。带有可诱导型启动子GVG的双元表达载
体为pTA7002。以上菌株和载体均为本实验室保存。

1.1.3 工具酶和主要试剂
限制性内切酶、T4DNA连接酶、用于PCR的DNA聚合
酶以及DNA回收试剂盒均购自上海宝生物(TaKaRa)
公司。用于RT-PCR的DNA酶和反转录酶等购自
Promega公司。上海生物工程公司代为合成引物。诱
导剂地塞米松购自Sigma公司, 以无水乙醇为溶剂配
制贮存液, 浓度为30 mmol·L–1。潮霉素(hygromycin)
购自Roche公司。其它生化试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 表达载体的构建与鉴定
用Sal I/Sma I双酶切质粒pMD-18T-GmSARK, 回收
3 kb片段。用Spe I单酶切载体pTA7002, Klenow大片
段补平粘性末端后用Xho I单酶切, 回收12 kb片段。
利用Sal I与Xho I为同尾酶的特点用T4 DNA连接酶连
接回收的目的片段, 并转化大肠杆菌DH5α。在含有
50 mg·L–1卡那霉素的LB培养基平板上筛选转化子,
将阳性克隆命名为pGVG::GmSARK。在前期工作中,
我们还在双元表达载体pTA7002的Xho I和Spe I酶切
位点之间引入GUS报告基因的编码序列, 构建成可
诱导型启动子GVG 驱动GUS报告基因的双元表达
载体 , 命名为pGVG::GUS; 并利用双元表达载体
pCAMBIA1301的Hind III和Nco I酶切位点, 以Gm-
SARK基因的启动子替代了原载体上的CaMV 35S启
动子, 构建成GmSARK启动子驱动GUS报告基因的
双元表达载体, 命名为pGmSARK::GUS(李鹏丽等,
2006)。
提取阳性转化子质粒进行酶切鉴定(内切酶的使
用参照说明书)。大肠杆菌质粒的提取采用SDS碱裂
解法, 药品的配制及具体操作步骤参考《分子克隆实
验指南》(第3版)(Sambrook and Russell, 2002)。

1.2.2 感受态细胞的制备和细菌转化
大肠杆菌DH5α和农杆菌GV3101感受态细胞的制备
与转化采用氯化钙法, 转化分别采用热激法和冻融
法。药品的配制及具体操作步骤参考《分子克隆实验
指南》(第3版)(Sambrook and Russell, 2002)。

1.2.3 拟南芥的遗传转化
利用农杆菌介导的花苞浸泡法转化拟南芥, 获得的种
子经过30 mg·L–1潮霉素抗性筛选, 将正常生长的植
株转入土中培养并进行分子检测与鉴定。其中GV-
G::GUS 转 基 因 拟 南 芥 , 在 实 验 中 作 为 GVG::
GmSARK转基因拟南芥的载体转化和DEX诱导对照;
GmSARK::GUS转基因拟南芥, 实验中作为检测外
源细胞分裂素处理对GmSARK表达影响的实验材
料。

1.2.4 基因组DNA的提取和转基因植株的PCR检测
基因组DNA的提取参考《分子克隆实验指南》(第3版)
(Sambrook and Russell, 2002)中介绍的方法进行。
在距pTA7002载体Spe I位点下游86 bp处设计1条下
游引物 7002B(5′-GGCAATGAAACTGATGCATTG-
AACT-3′),利用基因内部引物n3R-2(5′-CCGAATAG-
CTGGGACATTTGGATAT-3′)与7002B检测拟南芥
基因组中外源片段的插入情况。PCR反应过程为 :
94°C 5分钟; 94°C 30秒, 58°C 30秒, 72°C 1分钟, 30
个循环; 72°C 10分钟。

1.2.5 RNA提取和半定量RT-PCR
拟南芥总RNA提取采用异硫氰酸胍法, 药品的配制
及具体操作步骤参考《分子克隆实验指南》(第3版)
(Sambrook and Russell, 2002)。提取的总RNA用一
徐凡等: 大豆诱导型启动子驱动类受体蛋白激酶 GmSARK 转基因植物分析 151
定量的DNA酶 (RNase free)消化并确认无基因组
DNA污染后, 用反转录酶(Promega, ImProm-IITM)
进行反转录, 操作方法参照说明书。取1 μL反转录产
物, 稀释10倍, 作为PCR反应的模板。
以拟南芥β-ATPase基因为RT-PCR反应内标 ,
内标引物为 β-ATPS(5′-GATCATGACATCTCTCG-
AGG-3′)和β-ATPR(5′-TGGTAAGGAGCAAGGAGA-
ATC-3′)。利用基因特异引物n3R-2(序列同上)和spk2-
8(5′-GATAAAGATCTGCTACAGAAGTAGA-3′)对转
基因拟南芥中外源GmSARK基因的表达情况进行检
测。PCR反应过程为: 94°C 5分钟; 94°C 30秒, 58°C
30秒, 72°C 1分钟, 33个循环; 72°C 10分钟。

1.2.6 转基因植物中GUS组织化学染色及荧光活性
测定
将苗龄 1周且发育状态相同的GVG::GUS和Gm-
SARK::GUS转基因拟南芥转入含有5 μmol·L–1 6-BA
的1/2MS蔗糖培养基及相应的mock板处理24小时
(GVG::GUS处理板与对照板中均含有10 μmol·L–1
DEX), 进行GUS组织化学染色及荧光活性测定。
GUS组织化学染色参照Blume和Grierson(1997)
的方法进行。染色时间为6小时, 将植物的染色结果
用EPSON PERFECTION 1260型扫描仪扫描成照片
保存。参照Bradford(1976)的方法测定转基因植物的
总蛋白浓度。GUS荧光活性测定采用Jefferson和
Wilson(1991)的方法进行。使用Shimadzu RF-540荧
光分光光度计(日本)测定荧光值, 根据标准曲线换算
成4-MU的产率, 最后换算成单位时间、单位蛋白的
GUS比活力(pmol 4-MU·h–1·μg–1 protein)。

1.2.7 转基因植物的表型观察及外源细胞分裂素处理
将同期采收的GVG::GUS(对照组 )和GVG::GmSA-
RK(实验组)转基因纯合株系种子消毒后分别铺在处
理板和假诱导对照板(mock板)上培养。处理板为含有
10 μmol•L–1 DEX的1/2 MS蔗糖培养基, 以同等体积
的无水乙醇(DEX的溶剂)替代DEX作为mock板。萌发
后4天(DAG=4)或者5天(DAG=5)对各板进行记录。
将同期采收的对照组和实验组(同上)转基因纯合
株系种子消毒后铺在1/2MS蔗糖培养基垂直板上垂
直培养, 挑选苗龄4天、正常生长且发育状态相同的
幼苗分别转入含有10 μmol·L–1DEX和10 μmol·L–1
DEX+5 μmol·L–1 6-BA的1/2MS蔗糖培养基及相应的
mock板上继续垂直培养。每天对各组培养板进行记
录。
使用EPSON PERFECTION 1260型扫描仪记录
实验结果。
2 结果与分析
2.1 GmSARK基因可诱导型双元表达载体的构建
pTA7002是一个含有GVG系统的可诱导型双元表达
载体, 外加诱导物地塞米松可以激活GVG, 并与目的
基因上游启动子区GAL4 UAS结合启动目的基因的
过表达。我们将GmSARK基因的全长cDNA引入
pTA7002的Xho I和Spe I克隆位点之间(见1.2.1节),
获得了由可诱导型启动子GVG驱动GmSARK基因全
长过表达的双元表达载体 , 命名为pGVG::GmSA-
RK(图1A)。该质粒带有潮霉素筛选标记, 用于转化过
程中转基因植株的筛选。提取阳性克隆质粒pG-
VG::GmSARK, 利用GmSARK基因内部的酶切位点
用限制性内切酶Cla I和Xho I对质粒进行双酶切, 酶
切产物经琼脂糖凝胶电泳分析, 发现质粒被Cla I和
Xho I酶切为1 kb和14 kb的2条DNA片段, 与预期结
果相一致(图1B)。使用载体和基因内部特异性引物进
行DNA序列测定, 结果正确。利用冻融法将构建的质
粒pGVG::GmSARK转入农杆菌GV3101中, 经卡那
霉素、硫酸庆大霉素和利福平筛选阳性转化子, 经过
菌裂解PCR及酶切检测鉴定后, 命名为AgroGVG::
GmSARK。
2.2 转基因植株的鉴定
利用农杆菌介导的花苞浸泡法以pGVG::GmSARK转
化拟南芥, 收获的种子经过潮霉素抗性筛选, 将正常
生长的植株转入土中培养, 依据转土时间顺序编号,
命名为S1、S2……S25。随机提取其中8株(S2、S9、
S10、S13、S15、S22、S23和S24)的基因组DNA, 以
n3R-2和7002B为引物进行PCR检测, 扩增产物经琼
脂糖凝胶电泳分析, 确定外源基因已经整合到植物基
因组中(图1C)。对T1代再次进行抗性筛选和PCR鉴定,
结果表明, 外源基因在转基因拟南芥中稳定遗传。在
前期工作中已经获得系列GVG::GUS转基因植物材
152 植物学报 45(2) 2010


图1 可诱导型双元表达载体pGVG::GmSARK的构建及其转基因拟南芥的鉴定
(A) 双元表达载体pGVG::GmSARK基本结构示意图, LB和RB分别表示T-DNA的左边界和右边界; (B)双元表达载体pGVG::
GmSARK酶切检测图 , M: DNA分子标记DL2000; 1: 未经酶切的对照质粒pGVG::GmSARK; 2: Cla I和Xho I双酶切质粒
pGVG::GmSARK; (C) GVG::GmSARK转基因拟南芥的PCR鉴定, M: DL2000分子标记; WT: 负对照(以野生型拟南芥基因组DNA
为模板); S2、S9、S10、S13、S15和S22–S24: 以抗性植株的基因组DNA为模板的PCR产物; ＋: 正对照(以pGVG::GmSARK质
粒为模板); – : 负对照(以水为模板); (D) DEX诱导后, 转基因株系S23 GmSARK的表达情况。

Figure 1 Construction of the expression vector pGVG::GmSARK and the identification of GVG::GmSARK transgenic Arabi-
dopsis thaliana
(A) Diagram of the expression vector pGVG::GmSARK, LB and RB represent the left and the right border of T-DNA, respectively;
(B) The restriction map of the expression vector pGVG::GmSARK, M: DNA molecular marker DL2000 plus; 1: The control plas-
mid DNA; 2: Cla I/Xho I double digestion of the plasmid DNA; (C) Identification of GVG::GmSARK Arabidopsis thaliana, M: DNA
molecular marker DL2000; WT: PCR amplification using genomic DNA of the wild type (WT) control as template; S2, S9, S10,
S13, S15 and S22–S24: PCR amplification using genomic DNAs of the putative GVG::GmSARK transgenic plants as templates;
＋: Positive control of the PCR amplifications using pGVG::GmSARK plasmid as template; – : Negative control of PCR amplifi-
cation using water as template; (D) DEX-inducible expression of GmSARK in the transgenic S23 seedlings


料, 以其中的G28(命名与筛选方式同上)作为GVG::
GmSARK转基因植株的载体转化和DEX诱导对照。
为了检验转基因植株中的目的基因是否依据构
建设计表达, 分别用10 μmol·L–1DEX处理苗龄4天的
GVG::GmSARK转基因植株, 并利用半定量RT-PCR
方法检测转基因植株中GmSARK的表达情况, 发现
在处理7小时后目的基因出现表达。取其中的典型株
系S23检测诱导时间对GmSARK表达水平的影响 ,
发现DEX处理24小时就可以诱导积累较大量的Gm-
SARK转录本(图1D)。后续实验选取S23作为研究
GmSARK基因功能的典型实验材料, 以GVG::GUS
转基因株系G28作为对照材料。
2.3 GmSARK的功能分析及与细胞分裂素的关系
为了研究GmSARK过表达对拟南芥生长发育的影
响, 分别在种子萌发和幼苗期对纯合转基因植株GV-
G::GmSARK和GVG::GUS进行DEX诱导处理。将消
毒的 WT、 G28 、 S9 和 S23 的种子铺在含有 10
徐凡等: 大豆诱导型启动子驱动类受体蛋白激酶 GmSARK 转基因植物分析 153
μmol·L–1DEX的1/2MS蔗糖培养基及相应的mock板
上培养。发现GmSARK过表达并不影响GVG::Gm-
SARK转基因种子的萌发, 但种子萌发后的生长受到
严重抑制, 不能形成正常的幼苗; 而作为对照的WT
与G28拟南芥种子在DEX处理后均可以正常萌发和成
苗(图2A)。若将苗龄4天、生长正常且发育状态一致的
G28与S9、S23幼苗同时转入含有10 μmol·L–1DEX的
1/2 MS蔗糖培养基及相应的mock板上垂直培养96小
时, 与对照组相比, GmSARK过表达可以导致幼苗出
现叶片变黄下卷、地上部与根的生长受到严重抑制、
植株早衰及根发生卷曲等表型(图2B)。
细胞分裂素(6-BA)在植物生长发育的多个方面
发挥重要作用 (Hwang et al., 2002; Ferreira and
Kieber, 2005; Aloni et al., 2006; 于明明等, 2009),
外源细胞分裂素已被证明能够延缓植物衰老(Gan
and Amasino, 1995, 1996, 1997)。为了研究细胞分
裂素与GmSARK介导的衰老调控路径的关系, 我们
分别通过GmSARK启动子 -GUS报告基因系统和
DEX诱导的GmSARK过表达系统, 研究了外源6-BA
处理对GmSARK基因表达和功能的影响。
将苗龄1周、幼苗发育状态相同的GVG::GUS和
GmSARK::GUS转基因拟南芥转入含有5 μmol·L–1
6-BA的1/2MS蔗糖培养基及相应的mock板处理24小
时(GVG::GUS处理板与对照板中均含有10 μmol·L–1
DEX), 进行GUS组织化学染色及荧光活性测定。通
过GUS组织化学染色和荧光活性分析表明, 外源细
胞分裂素处理可以显著抑制GmSARK::GUS的活性
(图3A, B), 暗示细胞分裂素可能是GmSARK基因表
达的负调控因子。同时, 我们还发现外源施加6-BA对
GVG::GUS的活性没有影响(图3B), 说明外源6-BA
处理对GUS酶本身的生化性质没有影响, 同时也不
影响GVG可诱导系统的启动子活性, 这进一步证明
了外源细胞分裂素处理导致GmSARK::GUS活性显
著降低反映了GmSARK启动子本身的特性。
将苗龄4天且幼苗发育状态一致的G28与S23幼
苗同时转入含有10 μmol·L–1DEX、10 μmol·L–1 D-
EX+5 μmol·L–16-BA的1/2MS蔗糖培养基及相应的
mock板上垂直培养96小时。外源6-BA处理可以使
G28产生主根生长受到抑制、莲座叶变小与叶片花青
苷积累增加等表型 ; 外源6-BA处理对DEX诱导的
S23主根生长受抑制产生了叠加效应(表1), 转基因植


图2 DEX诱导GmSARK过表达对拟南芥转基因植株生长发育
的影响
(A) DEX诱导GmSARK过表达导致转基因植株种子(S9, S23)
萌发后不能成苗; (B) DEX诱导GmSARK过表达导致转基因植
株幼苗(S9, S23)的生长受到抑制。G28: GVG::GUS转基因对
照系

Figure 2 Effects of the DEX-induced over-expression of
GmSARK gene on the growth and development of the
GVG::GmSARK transgenic Arabidopsis thaliana seedlings
(A) Effects of the DEX-induced GmSARK over-expression on
germination of the GVG::GmSARK transgenic seeds (S9,
S23); (B) Effects of the DEX-induced GmSARK over-
expression on growth of the GVG::GmSARK transgenic
seedlings (S9, S23). G28: GVG::GUS transgenic control line


株莲座叶略有变大(图4A), 但它并不能逆转GmSA-
RK过表达所导致的植株早衰现象, S23的莲座叶依然
呈现黄色卷曲(图4A, B)。
3 讨论
衰老是细胞、器官乃至整个植物体发育的最后阶段,
它是一个受到多种发育和环境信号调控的程序性细
154 植物学报 45(2) 2010


图3 外源细胞分裂素处理降低GmSARK::GUS转基因拟南芥中的GUS活性
(A) GUS组织化学染色; (B) GUS荧光活性测定结果。GVG::GUS: GUS荧光活性的对照系

Figure 3 Exogenous 6-BA treatment reduced GUS activity in GmSARK::GUS transgenic Arabidopsis thaliana
(A) Histochemical GUS staining; (B) Fluorometric GUS assay. GVG::GUS: GUS fluorescence activity control line


表1 外源细胞分裂素处理对转基因拟南芥根长的影响
Table 1 Exogenous 6-BA treatment altered root length of
GVG:: GmSARK transgenic Arabidopsis thaliana
G28
(DEX)∗
S23
(DEX)∗∗
G28
(DEX+6-BA)∗
S23
(DEX+6-BA)∗∗
Root
length
(mm)
54.50±
4.35
19.17±
3.24
14.50±
0.58
8.83±
0.47
∗P=8.90 E-10; ∗∗ P=1.72 E-5。G28: GVG::GUS转基因对照系;
S23: GVG::GmSARK转基因株系
∗P=8.90 E-10; ∗∗ P=1.72 E-5. G28: GVG::GUS transgenic
control line; S23: GVG::GmSARK transgenic line

胞死亡过程。虽然目前已在植物中发现多种参与叶片
衰老相关过程的类受体蛋白激酶(Hajouj et al., 2000;
Van der Graaff et al., 2006), 但经过功能验证证明直
接参与调控叶片衰老过程的RLK基因还很少。
大豆是全球范围内的一种重要经济作物。已有实
验证明, 减缓种子发育过程中植株的衰老可以有效地
提高大豆的品质和产量(Nooden and Letham, 1993),
关于大豆叶片衰老分子事件的研究备受关注(Gan
and Amasino, 1997; Lim et al., 2003)。我们前期研
究发现, 大豆LRR型类受体蛋白激酶基因GmSARK
可能通过调节叶绿体发育和叶绿素的降解, 参与叶片
衰老的调控过程(Li et al., 2006)。在本文中我们构建
了可诱导型启动子GVG驱动GmSARK基因过表达的
双元表达载体, 并获得了相应的拟南芥转基因植株。
我们发现外源施加诱导物DEX可以有效诱导GVG::
GmSARK转基因拟南芥中目的基因GmSARK过表
达, 并导致其出现生长受抑制和植株早衰等表型, 与
前期结果相吻合。同时说明所获得的转基因拟南芥可
作为深入分析GmSARK基因功能的材料, 为后续研
究奠定了基础。通过对GVG::GmSARK转基因植物的
表型分析还发现, GmSARK过表达会严重抑制转基
因植物的根系发育, 并引起主根弯曲和侧根发生减少
等表型, 拓展了对GmSARK基因功能的认识。
植物激素在植物衰老过程中发挥着重要作用, 它
能够通过诱导细胞分裂、促进生长和提高代谢活性等
来有效地延缓植物叶片的衰老 (Gan and Amasino,
1995,1996,1997)。我们前期的实验也证明, 外源施
加6-BA可以延缓大豆叶片的衰老(宋爽等, 2002)。本
研究结果显示, 外源细胞分裂素处理可以明显地抑制
GmSARK的表达, 前期序列分析发现GmSARK启动
子中有9个响应细胞分裂素信号的转录调控因子ARRs
的结合位点(李鹏丽等, 2006), 暗示外源细胞分裂素
信号可能通过特殊的ARRs来调控GmSARK基因的
表达。由此我们推测, 在大豆叶片发育与衰老过程中,
细胞分裂素可能是GmSARK基因表达的一个负调控
因子, GmSARK在细胞分裂素的下游发挥作用。同时
我们还发现 : 细胞分裂素处理并不能逆转过表达
GmSARK所引起的转基因植物生长受抑制和早衰等
表型; 但是GmSARK的过表达可以部分抵消细胞分
裂素对拟南芥莲座叶生长的抑制。这说明GmSARK
徐凡等: 大豆诱导型启动子驱动类受体蛋白激酶 GmSARK 转基因植物分析 155


图4 外源6-BA处理对转基因拟南芥植株S23幼苗期生长发育
的影响
(A) DEX诱导GmSARK过表达的转基因植株S23的表型分析;
(B) 外源6-BA处理对DEX诱导GmSARK过表达的转基因植株
S23表型的影响。G28和S23同表1。

Figure 4 Effects of exogenous 6-BA treatment on growth
and development of the GmSARK over-expressing trans-
genic Arabidopsis thaliana seedlings (S23)
(A) Phenotypic analysis of the DEX-inducible GmSARK
over-expressing transgenic seedlings (S23); (B) Effects of
exogenous 6-BA on phenotype of the GmSARK over-
expressing transgenic seedlings (S23). G28 and S23 see
Table 1.


与细胞分裂素之间并非为一对一的关系, 可能通过多
条路径协调控制植物生长发育的多个方面。其中深入
的分子机制还需要进一步的研究去验证。
参考文献
李大红, 刘卉, 杨艳丽, 甄萍萍, 梁建生 (2008). 转反义OsRA-
CK1基因增强水稻抗旱能力. 植物学通报 25, 648–655.
李鹏丽, 马媛媛, 李小平, 张丽文, 王勇, 王宁宁 (2006). 大
豆类受体蛋白激酶基因rlpk2启动子克隆及初步分析. 植物
生理与分子生物学学报 32, 315–319.
宋爽, 赵宏巍, 曹俊然, 方琳, 王勇, 朱亮基, 张韧, 王宁宁
(2002). 两个大豆类受体蛋白激酶基因的克隆及其结构和
功能的初步分析. 植物生理与分子生物学学报 28, 241–
246.
于明明, 李兴国, 张宪省 (2009). APETALA1(AP1)启动子驱
动AtIPT4在转基因拟南芥中表达导致花和花器官发育异常.
植物学报 44, 59–68.
Sambrook J, Russell D (黄培堂等译) (2002). 分子克隆实验
指南 (第3版). 北京: 科学出版社.
Aloni R, Aloni E, Langhans M, Ullrich CI (2006). Role of
cytokinin and auxin in shaping root architecture: regula-
ting vascular differentiation, lateral root initiation, root
apical dominance and root gravitropism. Ann Bot (Lon-
don) 97, 883–893.
Blume B, Grierson D (1997). Expression of ACC oxidase
promoter-gus fusions in tomato and Nicotiana plum-
baginifolia regulated by developmental and environmental
stimuli. Plant J 12, 731–746.
Bradford MM (1976). A rapid and sensitive method for the
quantitation of microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein-dye binding. J Anal Biochem 72,
248–254.
Ferreira FJ, Kieber JJ (2005). Cytokinin signaling. Curr
Opin Plant Biol 8, 518–525.
Gan SS, Amasino RM (1995). Inhibition of leaf senescence
by autoregulated production of cytokinin. Science 270,
1986–1988.
Gan SS, Amasino RM (1996). Cytokinins in plant senes-
cence: from spray and pray to clone and play. BioEssays
18, 557–565.
Gan SS, Amasino RM (1997). Making sense of senes-
cence: molecular genetic regulation and manipulation of
leaf senescence. Plant Physiol 113, 313–319.
Guo Y, Cai Z, Gan S (2004). Transcriptome of Arabidopsis
leaf senescence. Plant Cell Environ 27, 521–549.
Guo YF, Gan SS (2005). Leaf senescence: signals, execu-
tion and regulation. Curr Top Dev Biol 71, 83–112.
Hajouj T, Michelis B, Gepstein S (2000). Cloning and char-
acterization of a receptor-like protein kinase gene associ-
ated with senescence. Plant Physiol 124, 1305–1314.
He Z, Wang ZY, Li J, Zhu Q, Lamb C, Ronald P, Chory J
156 植物学报 45(2) 2010
(2000). Perception of brassinosteroids by the extracellular
domain of the receptor kinase BRI1. Science 288, 2360–
2363.
Hwang I, Chen HC, Sheen J (2002). Two-component signal
transduction pathways in Arabidopsis. Plant Physiol 129,
500–515.
Jefferson RA, Wilson KJ (1991). The GUS gene fusion
system. Plant Mol Biol Man 14, 1–33.
Junga EH, Junga HW, Lee SC, Hana SW, Heub S, Hwang
BK (2004). Identification of a novel pathogen-induced
gene encoding a leucine-rich repeat protein expressed in
phloem cells of Capsicum annuum. Biochim Biophys Acta
1676, 211–222.
Lee SC, Kima JY, Kima SH, Kima SJ, Lee K, Hana SK,
Choi HS, Jeong DH, Anb G, Kima SR (2004). Trapping
and characterization of cold-responsive genes from T-
DNA tagging lines in rice. Plant Sci 166, 69–79.
Li XP, Gan R, Li PL, Ma YY, Zhang LW, Zhang R, Wang Y,
Wang NN (2006). Identification and functional charac-
terization of a leucine-rich repeat receptor-like kinase
gene that is involved in regulation of soybean leaf se-
nescence. Plant Mol Biol 61, 829–844.
Lim PO, Woo HR, Nam HG (2003). Molecular genetics of
leaf senescence in Arabidopsis. Trends Plant Sci 8, 272–
278.
Nooden LD, Letham DS (1993). Cytokinin metabolism and
signaling in the soybean plant. Ann J Plant Physiol 20,
639–653.
Shpak ED, Berthiaume CT, Hill EJ, Torii KU (2004). Syn-
ergistic interaction of three ERECTA-family receptor-like
kinases controls Arabidopsis organ growth and flower
development by promoting cell proliferation. Development
131, 1491–1501.
Stone JM, Walker JC (1995). Plant protein kinase families
and signal transduction. Plant Physiol 108, 451–457.
Van der Graaff E, Schwacke R, Schneider A, Desimone
M, Flugge UI, Kunze R (2006). Transcription analysis of
Arabidopsis membrane transporters and hormone path-
ways during developmental and induced leaf senescence.
Plant Physiol 141, 776–792.
Wang GD, Ellendorff U, Kemp B, Mansfield JW, Forsyth
A, Mitchell K, Bastas K, Liu CM, Woods-Tör A, Zipfel
C, de Wit PJGM, Jones JDG, Tör M, Thomma BPHJ
(2008). A genome-wide functional investigation into the
roles of receptor-like proteins in Arabidopsis. Plant Phy-
siol 147, 503–517.
Analysis of Transgenic Plants Expressing Soybean Receptor-like
Kinase GmSARK Driven by an Inducible Promoter
Fan Xu, Pengli Li, Baoyan An, Lingling Yuan,Tao Meng, Huiqin Yue, Ningning Wang*
College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China
Abstract Lucine-rich-repeat receptor-like kinases (LRR-RLKs) are known to function in various signaling pathways in
plants. Our previous study suggested a role for a soybean LRR-RLK, GmSARK, in regulating leaf senescence. Because
constitutive expression of GmSARK leads to lethality, we used a dexamethasone (DEX)-inducible transcription system to
control the expression of GmSARK in Arabidopsis thaliana. Applying DEX to the transgenic plants effectively induced the
overexpression of GmSARK, thus leading to marked growth inhibition and leaf senescence. Interestingly, exogenous
cytokinin (6-BA) repressed the expression of GmSARK in the transgenic lines, yet failed to restore the severe phenotypes.
Key words Arabidopsis thaliana, cytokinin, GmSARK, senescence, soybean
Xu F, Li PL, An BY, Yuan LL, Meng T, Yue HQ, Wang NN (2010). Analysis of transgenic plants expressing soybean
receptor-like kinase GmSARK driven by an inducible promoter. Chin Bull Bot 45, 149–156.
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* Author for correspondence. E-mail: wangnn@nankai.edu.cn
(责任编辑: 孙冬花)