全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (1): 117-123, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-10-17; 接受日期: 2008-01-07
基金项目: 国家自然科学基金(No.30370126、30470283和 30670156)、教育部留学回国人员科研启动基金(No.2005-383)、广东省
教育厅自然科学研究项目(No.Z02018)和高等学校博士学科点专项科研基金(No.20070574003)
* 通讯作者。 E-mail: lishsh@scnu.edu.cn
.技术方法.
重金属诱导拟南芥原生质体 DNA损伤的
单细胞凝胶电泳检测
聂志刚 1 , 王艳 1, 2 , 李韶山1*
1华南师范大学生命科学学院, 广东省高等学校生态与环境科学重点实验室, 广州 510631
2暨南大学理工学院, 广州 510632
摘要 以拟南芥原生质体为实验体系, 研究不同浓度的3种重金属离子对拟南芥原生质体的毒性和DNA损伤的差异。结果表
明, 用1-5 mmol.L-1的Zn2+、Cd2+ 和Cu2+分别处理的拟南芥原生质体, 2 小时内活力逐渐下降, 并表现出明显的浓度依赖性;
与相同浓度的Cd2+ 和Cu2+ 相比, Zn2+对拟南芥原生质体活力的影响程度较小, 表现出较低的毒性。单细胞凝胶电泳检测发现,
用0.1-0.8 mm ol.L-1的Zn2+、Cd2+ 和Cu2+ 分别处理拟南芥原生质体30 分钟, 以OTM值表示的原生质体DNA损伤量随重金
属离子浓度的增加而递增; 相同浓度(0.5 mmol.L-1)的3种重金属离子相比, Zn2+对原生质体的遗传毒性明显低于Cu2+ 和Cd2+。
综合原生质体活力和DNA损伤的单细胞凝胶电泳检测结果, 发现Zn2+对拟南芥原生质体的遗传毒性较低, 而Cd2+ 和Cu2+的遗
传毒性较高。本研究建立的拟南芥原生质体实验体系, 结合运用单细胞凝胶电泳技术, 能够快速、灵敏地检测重金属对植物
细胞的遗传毒性。
关键词 拟南芥, 彗星试验, DNA损伤, 重金属, 原生质体, 单细胞凝胶电泳
聂志刚 , 王艳 , 李韶山 (2009). 重金属诱导拟南芥原生质体DNA损伤的单细胞凝胶电泳检测. 植物学报 44, 117-123.
随着人类活动的不断增加和工农业的迅速发展, 重
金属在环境中的释放严重污染了农田和河流等与人类息
息相关的生态系统。重金属被植物吸收后, 通过食物链
进入动物体或人体, 影响动物的生长发育, 并严重危害人
类身体健康。
植物在受到重金属污染时通常会表现出光合作用受
到抑制、叶绿素含量降低、生物量减少、生长迟缓、
植株矮小和根系伸长受抑制直至停止, 严重时甚至导致
作物产量和品质的降低及植物体死亡。植物对重金属
的抗性及其细胞和分子机理研究, 已发展成为植物生态
学和污染生态学的前沿和热点领域。近年来的大量研
究证实, 植物适应重金属胁迫的机制包括阻止和控制重
金属离子的吸收、体内螯合解毒、体内区室化分割以
及代谢平衡等(许勤松和施国新, 2001)。研究表明, 重
金属诱导植物体产生各种活性氧自由基(Olmos et al. ,
2003; Sagi and Fluhr, 2006), 对细胞内的蛋白质分子、
DNA和脂质等生物大分子造成损害, 严重时将导致细
胞死亡。G ic hner 等(2006)报道, 在被重金属污染
的土壤中, 烟草和番茄植株叶片细胞核 DNA 损伤明
显高于对照。
单细胞凝胶电泳(s ingle cell gel elec trophoresis,
SCGE)又称彗星试验(comet assay)是近年来发展起来
的可以在细胞水平检测真核细胞 DNA 损伤的一种遗传
毒理分析技术, 具有简便、快速、灵敏、样品用量少
和无需放射性标记等特点。这一技术可以检测真核细
胞中的多种 DNA 损伤, 如单链断裂、双链断裂、碱性
不稳定位点、不完全切除修复位点和 DNA 交联等。本
实验室对动物细胞单细胞凝胶电泳技术进行改进, 使之
适合植物材料样品, 并成功获得了紫外辐射诱导植物叶
片 DNA 损伤的彗星图像和定量分析结果(Jiang et al. ,
118 植物学报 44(1) 2009
2007; 王静等, 2007)。本研究以拟南芥叶肉细胞原生
质体为实验材料, 应用改进的植物单细胞凝胶电泳技术,
比较了锌、镉和铜 3种重金属离子对植物细胞的毒性和
对DNA损伤的影响, 以期探索重金属对植物遗传毒理效
应的检测方法和实验体系, 并为研究植物响应重金属胁
迫的细胞和分子机理提供新的证据。
1 材料与方法
1.1 植物材料的培养
所用拟南芥(Arabidopsis thaliana L. Heynh.)为哥伦比
亚生态型(Columbia-0)。将拟南芥种子置于 4°C冰箱中
2天进行低温春化处理。 培养基质由营养土与蛭石按体
积比 1∶1 混合而成。待真叶长出后, 每盆保留 3株健
壮幼苗, 用 1/2MS营养液施肥。光周期为16小时光照 /
8 小时黑暗, 光期温度 22°C, 黑暗时温度 20°C, 相对湿
度大于 75%, 光合有效辐射(photosynthetically avail-
able radiat ion, PAR)强度为 100 mmol.m-2.s-1。选取
4周龄拟南芥完全伸展的成熟叶片用于分离原生质体。
1.2 原生质体的分离
取拟南芥成熟叶片, 用锋利的刀片切成长 0.5-1 mm的
小条, 放入 5 m L 的酶解缓冲液(含 1. 5% 纤维素酶,
0.4%离析酶, 0.4 mol.L-1 甘露醇, 0.02 mol.L-1 KCl,
0.02 mol.L-1 MES (pH 5.7), 0.01 mol.L-1 CaCl2,
0.1% BSA)中, 于 22°C黑暗环境中酶解 3小时。酶解
混合物用200目滤网过滤, 将滤液转移至离心管中, 以100
× g 离心 2分钟, 除去上清液; 加入适量等渗缓冲液(0.5
mol.L-1 甘露醇, 4 mmol.L-1 MES, 20 mmol.L-1 KCl,
pH 5.7), 并轻微摇动, 悬浮原生质体, 置于冰浴备用。
1.3 重金属处理
将氯化镉(CdCl2)、硫酸锌(ZnSO4)和硫酸铜(CuSO4)分
别溶解于去离子水中, 配制成浓度为0.1 mol.L-1的重金
属离子溶液。用不同浓度的单一重金属分别处理原生
质体, 重金属离子的浓度设为 0、1、2和 5 mmol.L-1,
处理时间分别为 0、30、60、90 和 12 0 分钟。
1.4 原生质体活力的测定
取重金属处理后的原生质体悬浮液 99 mL, 加入 1 mL浓
度为 1% 的荧光染料 FDA(fluorescein diacetate, Mo-
l ecu l a r P robe 公司产品) , 使 F DA 的最终浓度为
0.01%。5分钟后在荧光显微镜(TE-2000U, Nikon,日
本)下进行观察, 发绿色荧光的为有活力的原生质体,不发
绿色荧光的为失活的原生质体。用血球计数板记录有
活力的原生质体数目。每个处理重复 3次, 细胞活力计
数取平均值。
1.5 单细胞凝胶电泳
低浓度重金属处理原生质体所使用的浓度分别为 0、
0.1、0.2、0.5和 0.8 mmol.L-1, 处理时间为 30分钟。
将处理后的原生质体以 100× g离心 2分钟, 除去上清
液, 加入适量缓冲液调整悬浮原生质体到适当的密度。
单细胞凝胶电泳和彗星图像分析方法参照本实验室已发
表的文献报道(蒋磊等, 2006; Jiang et al., 2007; 王静
等, 2007)。
2 结果与分析
成熟的拟南芥叶片经过酶解法获得的叶肉原生质体大小
均匀, 纯度高(图 1), 活力高达 93%。在原生质体悬浮
图 1 分离的拟南芥叶肉细胞原生质体
(A) 原生质体显微图像; (B) 原生质体荧光图像(0.01% FDA染色)。
Bar=10 mm
Figur e 1 Protoplas ts isolated f rom mature leaves of
Arabi dopsis thaliana
(A) Image of protoplas ts under mic roscope; (B) Fluorescent
image of protoplasts under mic roscope (s tained w ith 0.01%
FDA). Bar=10 mm
119聂志刚等: 重金属诱导拟南芥原生质体DNA损伤的单细胞凝胶电泳检测
液中加入不同浓度的单一重金属, 处理一定时间后, 用荧
光染料FDA染色5 分钟, 在荧光显微镜下计数确定原生
质体的存活率。从图 2中可以看出, 浓度为1-5 mmol.
L-1的 Zn2+、Cd2+ 和 Cu2+3种重金属离子都不同程度地
诱导了拟南芥叶肉原生质体的死亡; 当加入Zn2+的浓度
为1 mmol.L-1时, 与对照相比, 原生质体的死亡率较低;
而当Zn2+的浓度增加至2或5 mmol.L-1, 原生质体的存
活率随着处理时间的增加而明显降低。与 Zn 2+ 相比,
Cd2+ 和 Cu2+的处理浓度无论是 1、2或 5 mmol.L-1,
原生质体的存活率均随着处理时间的延长而急剧降低,
而且不同浓度Cd2+ 和Cu2+处理的原生质体存活率都低
于相应浓度的 Zn 2+处理的原生质体的存活率。从原生
质体存活率这一指标而言, Zn2+毒性相对较小, 而Cd2+
和 Cu 2+对原生质体的毒性则较大。
为了研究重金属对拟南芥原生质体DNA 损伤的剂
量 -效应关系, 设置了较低浓度重金属处理实验, 使原生
质体经过一定处理时间后, 仍然能够维持在较高的存活
率, 并得到经单细胞凝胶电泳(检测 DNA损伤)的彗星图
像(图 3)。不同浓度的重金属 Zn2+、Cd2+ 或 Cu2+处理
原生质体 30分钟, 经单细胞凝胶电泳检测发现, 浓度为
0.1 mmol.L-1的Zn2+几乎不能诱导原生质体细胞核DNA
的迁移, 当 Zn2+的浓度增加到 0.5或 0.8 mmol.L-1时,
尽管 DNA 损伤程度较低, 但与对照相比, 彗尾明显增
大。与相同浓度的 Zn2+处理相比, 重金属 Cd2+ 和 Cu2+
引起原生质体彗星图像拖尾极为明显(图 3)。不同浓度
重金属处理的拟南芥原生质体经单细胞凝胶电泳所形成
的彗星图像, 采用 Casp软件定量分析后, 得到 DNA损
伤指标OTM (olive tail moment)值与重金属处理浓度的
关系(图 4)。结果显示, 0.1 mmol.L-1的 Zn 2+处理的
OTM值与对照相比无显著差异, 而当重金属的浓度增加
到 0.2 mmol.L-1时, OTM 值与对照相比显著增加(P<
0.05)。重金属 Cd2+ 和 Cu2对原生质体的DNA损伤更
为明显, 达到极显著水平(P<0.01)。
同一浓度的不同重金属(Zn2+、Cd2+ 和 Cu2+)诱导
拟南芥原生质体DNA 损伤的时间进程如图 5所示。用
浓度为 0.5 mmol.L-1的 Zn2+处理原生质体 10分钟时,
OTM 值与对照相比增加不明显, 而当处理时间达到 20
分钟时, 已经可以检测出 DNA损伤, 且随着处理时间的
增加, 其OTM 值显著增加。当用相同浓度的 Cd 2+和
Cu2+处理原生质体时, 随着处理时间的增加, 二者都能
图 2 不同浓度重金属Zn2+(A)、Cd2+(B)和Cu2+(C)胁迫对拟南
芥原生质体存活率的影响
Figur e 2 Time and dose dependence of heavy metal- induced
cell death. Protoplasts w ere exposed to heavy metals Zn2+(A),
Cd2+(B) and Cu2+(C) w ith diff erent concentrations for indicated
time.
120 植物学报 44(1) 2009
诱导原生质体DNA损伤, 且比Zn2+诱导的原生质体损伤
程度大得多(图 5)。用浓度为 0.5 m mol.L-1 的 Zn 2+、
Cd2+ 和Cu2+处理拟南芥原生质体40分钟所引起的DNA
损伤量(以OTM 值表示)分别是对照的 3.15、8.05和
9.24倍。由此可见, 3种重金属离子引起拟南芥原生质
体 DNA损伤的遗传毒性大小排序为: Cu2+>Cd2+>Zn2+。
3 讨论
本实验结果表明, Zn2+、Cd2+ 和 Cu2+对拟南芥原生质
体都具有细胞毒性, 并都能够诱导 DNA损伤, 但是 3种
重金属离子产生的细胞毒性和遗传毒性存在明显差异。
无论是荧光染色后细胞活力检测还是彗星图像检测结果
都表明, Zn2+的毒性最小, Cd2+的毒性次之, Cu2+的毒
性最大。杨亚琴和贾秀英(2006)报道了 Cu2+ 、Zn2+ 和
Cd2+ 对蟾蜍(Bufobufo gargarizans )蝌蚪的毒性, 3种
重金属离子对蟾蜍蝌蚪均具有潜在的毒性效应, 毒性大
小排序为Cu2+>Cd2+>Zn2+, 与本实验结果相吻合。而
Gallego等(2007)报道了 Cu2+ 、Zn2+ 和 Cd2+对单细胞
水生生物嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)的毒性,
3种重金属离子的毒性大小排序为 Cd2+> Cu2+ >Zn2+。
结合这些研究报道和本文的实验结果可以发现, 重金属
对不同物种的毒性大小并不一致, 而是依据所选取的研
究对象不同而有所差异。
在本实验中观察到, 当用低浓度的 Zn 2+、Cd 2+ 和
Cu2+短时间(30分钟)处理原生质体时, 引起原生质体存
活率的下降较小, 但随着重金属离子浓度的增加和处理
时间的延长, 原生质体存活率下降幅度和DNA损伤量都
图 3 不同浓度重金属锌、镉和铜离子胁迫诱导的拟南芥原生质体DNA 损伤的单细胞凝胶电泳彗星图像
Figur e 3 Comet assay images of Arabidopsis protoplasts exposed to dif ferent heavy metals Zn2+, Cd2+ or Cu2+ f or 30 min
图 4 不同浓度的重金属处理对拟南芥原生质体DNA损伤的影
响(处理时间均为30分钟)
Figur e 4 Dose dependence of DNA damage in A rabidops is
protoplasts (protoplasts w ere exposed to heavy metals Zn2+,
Cu2+ or Cd2+ f or 30 min)
121聂志刚等: 重金属诱导拟南芥原生质体DNA损伤的单细胞凝胶电泳检测
急剧增加(图 3-5)。本研究所采用的单细胞凝胶电泳技
术可检测到低至0.1 mmol.L-1重金属离子处理原生质体
30分钟所引起的 DNA损伤(图4), 灵敏度显著高于细胞
活力的荧光检测法(图 4)。植物在长期的进化过程中形
成了一系列潜在的对抗重金属毒害的解毒机制。比如,
长期生长在砷污染环境中的凤尾蕨属植物蜈蚣草对砷有
超富集能力(Ma et al., 2001), 而且在细胞水平对砷也
具有较强的抗性(詹宝等, 2006)。尽管植物对低浓度重
金属具有一定的适应性或者抗性, 然而当过量的重金属
进入细胞, 打破了植物体自身的防御平衡, 则会导致细胞
DNA 等大分子物质损伤, 甚至造成细胞死亡。植物在
细胞水平响应重金属的解毒和耐受机制主要包括两方面:
(1) 通过阻止重金属穿透细胞膜, 增加重金属在细胞膜壁
上的积累, 或者通过离子外排作用将细胞中的重金属排
出细胞外, 从而降低细胞敏感部位的重金属浓度; (2) 通
过螯合作用或者液泡的区域隔离, 降低进入细胞质的重
金属毒性(Clemens, 2001; Cobbett and Goldsbrough,
2002; Tong et al. , 2004)。此外植物细胞还形成了一
系列的抗氧化酶和非酶抗氧化系统, 清除细胞内重金属
诱导产生的活性氧, 降低氧化压力, 从而减轻重金属对植
物的毒害(Schützendübel et al. , 2001)。
本研究通过酶解法获得高活力的拟南芥原生质体,
用以评价 Zn2+、Cd2+ 和 Cu2+的细胞毒性和遗传毒性。
以往有关不同重金属对于植物细胞的毒性评价主要是建
立在整株或者培养的悬浮细胞的基础上。与整株植物
或者悬浮细胞相比, 以原生质体作为研究材料具有诸多
明显的优势。例如从植物组织分离得到的原生质体保
持着高度的一致性和分化状态, 分离得到的叶肉细胞原
生质体通常具有高活力和均一的细胞群体特性。这些
分离得到的新鲜原生质体已被证实是一个良好的生理体
系和多功能的细胞体系, 并应用于研究一系列的植物响
应环境胁迫的分子信号机制(Uno et al., 2000; Tena et
al. , 2001; Bethke and Jones, 2001)。基于拟南芥原
生质体实验体系, 通过瞬间表达研究重金属诱导植物细
胞死亡和DNA损伤的相关基因的表达定位, 可以为进一
步阐明重金属胁迫诱导的植物细胞死亡和DNA 损伤的
机制及相关分子信号转导作用机理提供理论依据。
图 5 重金属胁迫对拟南芥原生质体DNA 损伤影响的时间进程
锌(A)、镉(B)和铜(C)离子浓度均为 0.5 mmol.L-1
Figur e 5 Time dependence of DNA damage induced by heavy
metals in A rabidops is protoplas ts
Protoplas ts w ere exposed to Zn2+ (A), Cd2+ (B) and Cu2+ (C)
respectively at concentration of 0.5 mmol.L-1.
122 植物学报 44(1) 2009
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No rma l Unive rsi ty, Gu ang zho u 5 1063 1, Chi na
2Co lle ge o f Scie nce s & Eng ine eri ng, Jin an University, Guang zho u 5 106 32, Chi na
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Arabidops is thal iana w ere used as experimental material. Three kinds of heavy metals—zinc (Zn2+), copper (Cu2+) and cadmium
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rate than w ith Cu2+ and Cd2+ exposure. DNA damage measured by s ingle-cell gel electrophoresis w as induced by Zn2+, Cu2+ and
Cd2+ at 0.1-0.8 mmol.L-1, w ith s ignif icant increases in olive tail moments in all treated samples of protoplas ts. As compared w ith
Zn2+ exposure, Cu2+ and Cd2+ exposure at a similar concentration induced more severe DNA damage in protoplasts. Heavy metal-
induced DNA damage w as dose and time dependent. Thus, the heavy metals Cu2+ and Cd2+ are more cytotox ic and genotoxic than
Zn2+. Use of s ingle-cell gel elec trophores is in the A rabidops is protoplast exper imental s ys tem is a fast and sens itive method f or
detec ting genotoxicity caused by heavy metals.
Ke y w ords Arabid opsis thal ian a, com et a ssa y, DNA da mage , hea vy meta ls, p rotopl asts, sin gle cel l g el ele ctropho resis
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* A uthor for cor respondence. E-mail: lishsh@scnu.edu.cn
(责任编辑: 白羽红)