全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (2): 216-222, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2009.02.011
收稿日期: 2008-04-10; 接受日期: 2008-08-29
基金项目: 河南大学科技攻关项目(No.07YBGG012)
* 通讯作者。E-mail: wangdj@henu.edu.cn
.技术方法.
真空渗透法转化油菜及转化种子的筛选
王道杰*, 杨翠玲, 陆鸣
河南大学生命科学学院, 河南省植物逆境生物学重点实验室, 开封 475004
摘要 真空渗透遗传转化法首先在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中获得成功, 是一种简便、快速且无需经过组织培养阶段
即可获得大量转化植株的基因转化方法。该研究以不同遗传背景的3个甘蓝型油菜(Brassica napus)品种(系)陕3B、L45和
Mg23为材料, 对真空渗透遗传转化方法中真空渗透时间和Silwet L-77浓度与遗传转化效果的关系进行了比较, 同时对转化
种子的筛选方法进行了优化。结果表明, 卡那霉素(Km)对油菜种子的萌发影响不显著, 但对其生长发育有明显的抑制作用。
不同油菜品种对卡那霉素的敏感性不同, 各自的致死浓度也不一样。在0%-0.05%的浓度范围内, 随着Silwet L-77浓度的增
加, 在相同的真空渗透时间内, 3个油菜品种的转化率逐渐升高。当Silwet L-77浓度为0.05%时, 10分钟的真空渗透时间可获
得最高转化效率, 此时陕3B、L45和Mg23的转化率分别达到1.97%、2.09%和2.30%。
关键词 油菜, 遗传转化, Silwet L-77, 真空渗透
王道杰, 杨翠玲, 陆鸣 (2009). 真空渗透法转化油菜及转化种子的筛选. 植物学报 44, 216-222.
油菜是重要的油料作物, 对油菜的改良是育种专家
长期努力的目标。多年来, 许多育种工作者试图采用传
统的育种手段来获得油菜良种, 但进展十分缓慢。随着
基因工程技术的发展, 人们越来越倾向于通过基因工程
的手段来改良油菜的产量、品质及抗逆性。因此, 建
立良好的油菜转化体系至关重要。
目前的转基因技术可分为物理法、化学法及生物
学方法。而无论哪一种方法, 都主要依靠转化细胞的脱
分化和再分化这一组织培养植株再生过程, 实现外源基
因的转移, 获得转基因植株(马建华和孙毅, 2006)。真
空渗透转化法作为原位转基因方法 ( i n p l a n t a
transformation)的一种, 是由Bechtold等(1993)将植物
病理学中用来辅助植物病毒进入植株的方法, 应用到了
拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株的农杆菌基因转化
上。该方法具有简便、快速、可靠等优点, 为植物的
转基因工作开辟了新的途径(张庆祝和韩天富, 2004)。
在拟南芥上的实验表明, 其转化效果受植株发育时期、
真空渗透时间和渗透剂浓度等多种因素的影响。此方
法在其它一些植物中也获得成功, 例如Liu等(1998)采用
该方法在北方小油菜(Brass ica campestr is ssp.
chinensis)中获得转化植株; Trieu等(2000)在豆科植物
百脉根(Medicago truncatula)上获得成功。de Ronde
等(2001)将萌发的大豆(Glycine max)种子与农杆菌共培
养一段时间后, 抽真空, 再将种子种于温室, 长成植株后
收获种子检测转基因后代, 也获得转化植株。
甘蓝型油菜(Brassica napus)与拟南芥同属十字花
科, 亲缘关系很近, 可以期望将已经在拟南芥中获得成功
的 in planta基因转化方法应用于油菜。本研究旨在探
索甘蓝型油菜高效的in planta真空渗透遗传转化方法。
同时由于油菜的繁殖系数很高, 本实验也试图通过对不
同方法的比较, 探寻方便快捷的用于筛选in planta法获
得的大量转化种子的方法, 从而为该方法在油菜转基因
实践中的应用提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 植物材料、菌株和质粒载体
植物材料为甘蓝型油菜(Brassica napus L.)自交纯系
L45、陕3B和Mg23。2005年9月下旬播种于育种试
217王道杰等: 真空渗透法转化油菜及转化种子的筛选
验田, 按常规育种方法进行管理。次年3月油菜现蕾抽
薹时挖出, 洗净叶表面和根部土壤, 去掉基部老叶后用于
转化。农杆菌菌株EHA105和表达载体 pKART-AP3
为本实验室保存。
1.1.2 培养基
渗透培养液: 基本成分为 1/2MS无机盐、1×B5有机
物、5%蔗糖、0.044 mmol.L-1 6-BA, 用 1 mol.L-1
KOH调 pH值至 5.7。转化时所加Silwet L-77共设置
0%、0.02%、0.05%和0.1%(v/v)4个浓度梯度, 分别
标记为C0、C1、C2 和C3。选择培养基: 基本成分
为 1 / 2 MS 大量元素、1 ×B 5 微量元素、1 % 蔗糖、
0.8%琼脂, 用 1 mol.L-1 KOH调节 pH值至5.8, 高压
灭菌后添加相应浓度的卡那霉素(kanamycin, Km)。
1.2 实验方法
1.2.1 农杆菌的转化及鉴定
采用电击法(electroporation)将植物表达载体pKART-
AP3导入农杆菌EHA105中, 具体步骤如下: 取100 mL
农杆菌EHA105感受态细胞, 加入 1 mL(约 500 ng)
pKART-AP3质粒, 2.5 kV电击转化, 然后迅速加入1 mL
LB液体培养基, 28°C下每分钟200转振荡培养1小时
后, 8 000 x g 离心 1分钟, 弃上清, 留 200 mL 重悬沉
淀。将重悬菌液涂布于含50 mg.L-1卡那霉素(Km)和
25 mg.L-1利福平(Rif)的LB固体培养基平板上, 28°C倒
置培养1-2天, 挑选单克隆鉴定阳性菌落。将鉴定出的
阳性重组克隆培养后在甘油中保存于-70°C备用。
1.2.2 油菜植株的原位真空渗透遗传转化
将阳性重组农杆菌单菌落接种于10 mL YEB液体培养
基中(含终浓度 50 mg.mL-1 Rif和 50 mg.mL-1 Km),
28°C下每分钟200转振荡培养48小时, 然后将菌液转
入1 L不含抗生素的YEB培养基中, 继续培养至OD600
为0.8左右, 室温下3 000 x g离心15分钟, 收集菌体
后用1 L不含Silwet L-77的渗透培养液洗涤1次, 然后
将菌体重悬于1 L渗透培养液中备用。将从田间挖回洗
净的油菜植株连同根部一起倒插入含菌体的渗透培养液
中, 抽真空, 维持0.05 MPa压力5-15分钟(设置5、10
和 15分钟 3个时间梯度, 分别标记为 T1、T2和 T3)。
以自然生长的未做任何处理的植株和在不含Silwet L-77
的农杆菌渗透培养液中同等条件下处理的植株为对照。
取出处理后的植株, 于塑料袋中侧放保湿 24小时。然
后将其移栽田间, 浇少量水, 覆膜保湿5天。去掉薄膜,
灌透水 , 按常规方法培育植株至成熟 , 收获种子
(T1代)。
1.2.3 转化种子的筛选
卡那霉素最佳致死浓度的确定按以下步骤进行。制备
分别含 0 mg.L-1、30 mg.L-1、50 mg.L-1、100 mg.
L-1 和 150 mg.L-1 5个梯度的Km的MS选择培养基。
将未经处理的对照种子用75%乙醇消毒1分钟, 然后在
0.1%的HgCl2中消毒10分钟, 无菌水洗涤4-5次。将
表面消毒的种子做如下2种处理: (1)平铺于含相应浓度
Km的MS选择培养基上, 每瓶100粒, 重复3次, 对照
(CK1)为种子消毒后直接播种于不含Km的MS选择培
养基上; (2)浸入含相应浓度Km的水溶液中, 4°C处理
40小时, 然后再平铺于含相同浓度Km的MS选择培养
基上, 每瓶100粒, 重复3次, 对照(CK2)为种子消毒后
在无菌水中 4°C处理 40小时, 然后播种于不含 Km的
MS选择培养基上。以上处理的种子在25°C暗培养2
天后, 每天光照 12小时, 培养 3 天。取出培养瓶观察
并记录幼苗长势和颜色变化, 统计发芽率, 并在每个培养
瓶中取样 30株, 测量其下胚轴和主根长度。
T1代种子的抗性筛选具体操作步骤如下。对真空
渗透转化获得的T1代种子经75%乙醇消毒1分钟, 然后
在0.1%的HgCl2中消毒10分钟, 无菌水洗涤4-5次。
将种子浸入150 mg.L-1 Km水溶液中, 4°C处理40小
时, 然后平铺于含150 mg.L-1 Km的MS选择培养基上,
密度为 300粒 /瓶。25°C暗培养2天后, 每天光照12
小时培养3-4天。将正常生长的绿色苗在距生长点1-
1.5 cm处切下, 插入新的相同MS选择培养基中继续筛
选 2-3代, 每 2-3周继代 1次。
218 植物学报 44(2) 2009
1.2.4 抗性植株的PCR检测
油菜基因组DNA提取参照王灏等(2001)的方法。扩增
pK ART- AP 3 内 3 5 S 启动子的引物序列: F , 5 -
ACCCACAGATGGTTAGAGAGGC-3 ; R, 5 -
CTCTCCAAATGAAATGAACTTC-3。在 20 mL PCR
反应体系中含有 1 ×PCR buff er、1. 2 mmol.L-1
MgCl2、 0.2 mmol.L-1 dNTPs、1.0 U Taq酶、0.2
mmol.L-1正反向引物以及约15 ng模板DNA。PCR反
应程序: 94°C 3分钟; 94°C 60秒, 56°C 60秒, 72°C 90
秒, 40个循环; 72°C延伸10分钟; 4°C下贮存直至电泳
分析。扩增产物在 1.4%(w/v)的琼脂糖凝胶(含 1 mg.
mL-1 EB)中电泳(1×TAE buffer, 5 V.cm-1), 紫外透射
仪检测并照相。
2 结果与讨论
2 .1 卡那霉素对油菜种子发芽及其生长发育的
影响
由于油菜繁殖系数高, 真空渗透转化的假阳性率也很高,
收获的种子不可能全部进行分子检测, 所以抗性筛选尤
为重要。而抗性筛选中抗生素致死浓度的确定非常关
键, 如果抗生素浓度过高会使转化体也被淘汰, 过低则
造成非转化体逃逸而带来过多的假阳性。种子的抗性
又与再生体的抗性不同, 而且不同品种的抗性也不一
样, 所以必须首先确定各品种(系)种子的抗生素最低致
死浓度。
Km在0-150 mg.L-1浓度范围内对油菜种子的萌
发影响不显著, 各处理的发芽率均高达98%以上, 但对
其生长发育具有明显的抑制作用(图 1A, B)。随着Km
浓度的增加, 其抑制作用加强。种子消毒后直接播种于
含相应浓度Km的筛选培养基中, 与对照相比, 3个品种
的主根长度均随Km浓度的增加而下降, 并且均与对照
达到极显著差异水平(图1A)。陕3B和Mg23两个品种
的下胚轴长度随 Km浓度的增加而下降, 而L45在Km
浓度为30 mg.L-1时下胚轴长度比对照有轻微的增加,
之后随Km浓度的增加而下胚轴长度减少, 表明低浓度
Km对 L45的下胚轴伸长有促进作用(图1B)。
种子消毒后在含相应浓度Km的水溶液中4°C浸泡
40小时, 然后播种于含相同浓度Km的筛选培养基中,
结果表明3个品种的主根和下胚轴长度均随Km浓度的
增加而减少(图1A, B)。主根长度在Km浓度为30 mg.
L-1时即与对照达到极显著差异水平(图1A), 而下胚轴长
度只有在Km浓度达到100 mg.L-1时才与对照达到显著
差异水平(图1B)。同时浸泡处理组的主根长度除对照
外均比同品种直接播种组的主根长度短(图1A), 而浸泡
处理组的下胚轴长度, 在0-100 mg.L-1Km浓度范围内
比同品种直接播种组的长, 只有当Km浓度达到 150
mg.L-1时比同品种直接播种组的短(图1B), 表明Km对
种苗主根生长的影响要大于对下胚轴伸长的影响。
图 1 卡那霉素对油菜子叶苗主根(A)和下胚轴(B)生长的影响
Z: 种子未经卡那霉素溶液浸泡直接播种于培养基; P: 种子经卡那
霉素溶液浸泡后播种于培养基
Figure 1 Effect of kanamycin on the growth of tap root (A)
and hypocotyls (B) of Brassica napus seedling
Z: Seeds were sown in the medium directly without soaking in
the kanamycin solution; P: Seeds were sown in the medium
after soaking in the kanamycin solution
219王道杰等: 真空渗透法转化油菜及转化种子的筛选
在子叶颜色变化方面, 对Km浸泡处理5天后的野
生型材料进行统计, 结果发现: 不同油菜品种的Km致死
浓度不同(图2)。经浸泡处理5天, L45在Km筛选浓度
为150 mg.L-1以上时幼苗全部黄化或紫化死亡, Km浓
度在50 mg.L-1及以下时的油菜种苗生长状况基本正常,
部分子叶出现黄化; Km浓度在100 mg.L-1时, 油菜幼
苗下胚轴呈淡紫色, 叶片严重黄化或紫化, 呈现中毒现
象。而未经浸泡处理的 L45, Km筛选浓度在100 mg.
L-1以下时种苗生长状况基本正常, 当Km浓度为 150
mg.L-1时仍有部分子叶呈绿色。因此, 可以确定L45在
Km浸泡处理后最低Km致死浓度为100 mg.L-1。而
陕3B和Mg23两个品种对卡那霉素有较强的耐受性,
未经浸泡处理时, 在Km浓度为150 mg.L-1时多数子
叶仍呈现绿色。尤其是陕3B, 即使经150 mg.L-1Km
浸泡处理后, 仍有部分子叶呈绿色, 而Mg23 经 150
mg.L-1Km浸泡处理后多数子叶已经黄化或紫化。进
一步的研究结果表明, 陕3B需经250 mg.L-1的Km浸
泡处理 5天, 然后在含相同浓度Km的培养基上筛选,
才能达到致死的目的。而Mg23经200 mg.L-1的Km
浸泡处理 5天, 然后在相同浓度的Km培养基上筛选,
即可达到致死目的。
综上所述, 不同油菜品种对卡那霉素的敏感性不同,
各自的致死浓度也不一样。在Km浸泡处理的情况下,
L45、Mg23和陕 3B的Km致死浓度依次为 150 mg.
L-1、200 mg.L-1和250 mg.L-1, 这个浓度可以作为转
基因种子的筛选浓度。该方法简单高效, 可用于批量种
子的快速筛选, 在油菜非组培遗传转化种子的筛选中具
有一定的应用价值。
2.2 Silwet L-77浓度对油菜真空渗透转化率的
影响
真空渗透转化法的原理是基于农杆菌穿过植物表层细胞
而感染植株, 不同浓度的渗透剂有助于农杆菌穿越植物
表层细胞而进入体内。目前多数实验中所用渗透剂为
Silwet L-77, 虽然它有助于农杆菌的渗入, 但是其浓度
过高又会对植物造成毒害作用, 因此必须确定其合适的
使用浓度。
本实验采用Silwet L-77作为渗透辅助剂, 其不同作
用浓度的对比实验结果如表1和图3所示。从图3中可
以看出, 当Silwet L-77浓度低于0.05%时, 随着Silwet
L-77浓度的增加, 在相同的真空渗透时间内, 3个品种的
转化率逐渐增高, 当Silwet L-77浓度超过0.05%达到
0.10%时, 转化率反而下降(图3)。Silwet L-77浓度为
图 2 不同油菜品种对卡那霉素的敏感性分析
Z: 种子消毒后不经卡那霉素浸泡处理直接播种于含相应浓度卡那
霉素的培养基; P: 种子消毒后经卡那霉素水溶液浸泡处理后再播
种于含相应浓度卡那霉素的培养基
Figure 2 Analysis of the resistance to kanamycin of different
cultivars in Brassica napus
Z: Seeds were sown in the medium directly without soaking in
the kanamycin solution; P: Seeds were sown in the medium
after soaking in the kanamycin solution
220 植物学报 44(2) 2009
0.05%时, 陕 3B、L45和Mg23的最高转化率分别达
到 1.97%、2.09%和 2.30%。而在不加 Silwet L-77
的情况下, 只在L45上获得了0.3%和0.6%的转化率,
其它2个品种均未获得转化体(表1; 图3)。实验结果表
明, 浓度为0.05%的表面活性剂Silwet L-77能对真空
渗透转化甘蓝型油菜起到明显的促进作用。
2 .3 真空渗透时间对油菜真空渗透转化率的影
响
真空渗透时间也是影响真空渗透转化率的一个重要因
素。随着真空渗入时间的延长, 转化率会有所提高, 但是
时间过长也会对植物造成伤害。在Silwet L-77的浓度
小于0.05%时, 各品种表现出一致的规律, 即随着真空渗
透时间的延长, 转化率随之升高(图3)。当Silwet L-77的
浓度为0.05%时, 10分钟的真空渗透时间可获得最高转
化率, 此时陕 3B、L45 和Mg23 的转化率分别达到
1.97%、2.09%和2.30%(表1)。而当Silwet L-77的浓
度达到0.10%时, 虽然随着真空渗透时间的延长, 转化率
也有所提高, 但比相同时间Silwet L-77浓度为 0.05%时
的转化率要低或相当(图3)。张广辉等(1998)认为, 在一
定范围内, 真空泵的吸力与适宜处理时间成反比。真空
度过小, 转化率明显降低; 而真空度过大, 影响植株随后
的生长恢复和结种, 反而降低转化率。好的真空处理植
株外观特征为处理叶片呈水渍状, 且不出现萎蔫变软。
综上所述, 油菜真空渗透转化中采用 0.0 5% 的
Silwet L-77浓度和10分钟的真空渗透时间, 可以获得
高达 2% 的转化率。
2.4 转基因植株的分子检测
为了在油菜苗期快速检测转基因植株中是否含有外源
表 1 pKART-AP3载体真空渗透转化油菜结果
Table 1 Results of the transformation of pKART-AP3 vector in Brassica napus by vacuum infiltration
Code Concentration of Infiltration No. of harvested seeds No. of resistant plants
Silwet L-77(v/v) time (min) Shaan 3B L45 Mg23 Shaan 3B L45 Mg23
1 5 6 307 4 633 8 309 0 0 0
2 0% 10 6 151 4 321 7 899 0 13 0
3 15 6 032 4 095 7 628 0 25 0
4 5 6 103 4 137 7 456 31 36 60
5 0.02% 10 5 823 3 824 7 096 46 42 71
6 15 5 612 3 357 6 637 50 43 99
7 5 4 789 3 526 5 287 57 56 95
8 0.05% 10 4 363 3 106 4 892 86 65 112
9 15 3 986 2 752 3 953 72 52 83
10 5 2 985 2 321 4 096 39 37 69
11 0.10% 10 2 378 1 893 2 988 43 34 59
12 　 15 1 983 896 1 833 37 18 35
转化率(%)＝抗性株数 /收获种子数×100% Transformation frequency (%)=No. of resistant plants/No. of harvested seeds × 100%
图 3 Silwet L-77的浓度和真空渗透时间对真空渗透转化油菜
的影响
图中编号对应于表 1中编号
Figure 3 Effect of Silwet L-77 concentration and infiltration
time on the transformation efficiency in Brassica napus by
vacuum infiltration
The code corresponds to that in Table 1
221王道杰等: 真空渗透法转化油菜及转化种子的筛选
DNA, 采用微量快速法提取植株总DNA, 以提取的油菜
叶片总DNA为模板, 根据CaMV 35S启动子序列设计
1对引物(引物序列见 1.2.4节), 进行PCR检测, 扩增
35S启动子中 744 bp的片段。电泳检测 PCR扩增产
物, 结果表明, 从抗性转化植株DNA样品中扩增出与
pKART-AP3质粒正对照相同的744 bp的条带, 而未转
化阴性对照则无扩增条带(图4), 表明外源DNA已整合
到转化植株基因组中。
随着分子生物学研究技术的快速发展, 油菜的遗传
转化研究日趋成熟。在油菜的遗传转化中, 有越来越多
的研究倾向于采用外源基因直接转化法, 因为其不受宿
主范围的限制, 也不需使用特定的载体(张庆祝和韩天富,
2004)。在早期的油菜遗传转化研究中已取得成功的方
法有 3种: 电击法、PEG 法和显微注射法。近年来发
展起来的还有基因枪法、激光微束穿刺法、真空渗透
遗传转化法和花粉介导法等(马建华和孙毅, 2006)。张
广辉等(1998)利用真空渗透法, 以白菜型油菜(Brassica
campestris)子叶为受体进行转化, 得到转化株, 转化率
为2.11%。本研究对不同遗传背景的甘蓝型油菜真空
渗透遗传转化条件进行了探索和优化, 以期为甘蓝型油
菜的非组培直接遗传转化方法研究提供借鉴。
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图 4 转基因抗性油菜植株的PCR鉴定
M：DL2000 DNA分子量标准; 1-3: 野生型油菜 L45、陕 3B和
Mg23; 4-6: 对应的抗性植株 L45、陕3B和Mg23; 7: pKART-AP3
质粒正对照
Figure 4 PCR screening of the transformed Brassica napus
plants resistant to kanamycin
M: DL2000 DNA marker; 1-3: The wild type plants of L45, Shaan
3B and Mg23; 4-6: The corresponding transformed plants of
L45, Shaan 3B and Mg23; 7: pKART-AP3 plasmid as positive
control
222 植物学报 44(2) 2009
Transformation of Brassica napus by Vacuum Infiltration
Daojie Wang*, Cuiling Yang, Ming Lu
Key Laboratory of Plant Stress Biology of Henan Province, College of Life Science, Henan University, Kaifeng 475004, China
Abstract We studied the effect of vacuum infiltration time and Silwet L-77 concentration on transformation of different rapeseed
cultivars (Brassica napus) Shaan 3B, L45 and Mg23. The selection methods for transformed seeds were optimized. Seed germi-
nation rates were not affected significantly by kanamycin, but the shoot growth was inhibited. The higher the concentration of
kanamycin, the stronger the inhibition. The lethal concentration of kanamycin differed among different B. napus cultivars. The
transformation frequency increased when 0%-0.05% Silwet L-77 was used but declined with 0.05%-0.10% Silwet L-77. The
transformation frequency was highest with 0.05% Silwet L-77 for 10-min vacuum infiltration: as high as 1.97%, 2.09% and 2.30%
for Shaan 3B, L45 and Mg23, respectively.
Key words Brassica napus, genetic transformation, Si lwet L-77, vacuum infi ltration
Wang DJ, Yang CL, Lu M (2009). Transformation of Brassica napus by vacuum infi ltration. Chin Bull Bot 44, 216-222.
* Author for correspondence. E-mail: wangdj@henu.edu.cn
(责任编辑: 刘慧君)
更 正
本刊 2009年 44卷 1期 79-85页《甘蓝型油菜油体数量及面积之和与含油量的相关性》一文中, 由于排版和校
对疏漏, 导致部分计量单位出现错误, 更正如下: 80页右栏 15-17行和 81页左栏 11-17行中, “mg”应为“µg”; 81页
右栏 13-20行中, “mm2”应为“µm2”; 82页图 1的图注中, “Bar=5 mm”应为“Bar=5 µm”。编辑部向该文作者和广大
读者致歉。