全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (1): 37-42, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-12-20; 接受日期: 2008-02-15
* 通讯作者。E-mail: zhanglixin@ibcas.ac .cn
.特邀综述.
拟南芥叶绿体中 DEG蛋白酶功能的研究进展
张艳玲 1 , 孙旭武 2 , 张立新2*
1 兰州大学生命科学学院, 兰州 730000
2 中国科学院植物研究所光合作用研究中心, 光合作用与环境分子生理学重点实验室, 北京 100093
摘要 DEGP家族蛋白酶广泛分布于原核生物和真核生物细胞中。在拟南芥中有16个DEGP类似的蛋白酶, 根据蛋白质组学
数据, 其中有4个定位于叶绿体中, 分别命名为DEG1、DEG2、DEG5和DEG8。结合生物化学和分子生物学等研究手段对拟
南芥叶绿体中的DEGP蛋白酶进行了分析, 现有的研究初步证明了这些蛋白酶参与光系统II (PSII)复合物反应中心D1蛋白的
降解, 从而在PSII复合物的修复循环和功能维护中起重要作用。该文概述了拟南芥叶绿体中DEG蛋白酶的结构和功能的最新
研究进展。
关键词 拟南芥, 叶绿体, DEGP蛋白酶
张艳玲 , 孙旭武 , 张立新 (2009). 拟南芥叶绿体中DEG蛋白酶功能的研究进展. 植物学报 44, 37-42.
蛋白酶广泛分布于原核和真核生物细胞中。蛋白
酶有着各种各样的功能, 如它与分子伴侣结合, 共同参与
蛋白的折叠、错误蛋白的降解等质量控制(Wickner et
al., 1999; Yamamoto, 2001; Maurizi, 2002)。蛋白酶
根据其对能量的需求与否分为依赖ATP水解能量的蛋白
酶和不依赖 A T P 水解能量的蛋白酶。如 F T S H
(fi lamentation temperature-sens it ive)、 Lon和 CLP
(chloroplas t-localized protease)蛋白酶是属于依赖
ATP 的蛋白酶(A dam and Cl arke , 2002 )。DE G
(degradat ion of periplasmic)/HTR(high temperature
requirement)家族蛋白酶是不依赖于ATP的丝氨酸类蛋
白酶, 在原核和真核生物细胞中均有分布(Gottesman,
1996; Pallen and Wren, 1997; Adam and Clarke, 2002;
Clausen et al. , 2002; Kieselbach and Funk, 2003;
Huesgen et al., 2005)。DEG蛋白酶最早在大肠杆菌
中发现, 其在大肠杆菌中具有代表性的成员有 DEGP、
DEGQ和DEGS (Pallen and Wren, 1997; Clausen et
al. , 2002)。DEGP 具有分子伴侣功能和蛋白酶活性,
在低温时表现为分子伴侣功能, 在高温时蛋白酶活性被
激活(Spiess et al. , 1999)。在大肠杆菌中错误折叠和
被破坏的蛋白是 DEGP 蛋白酶的生理底物(Clausen et
al., 2002)。在蓝细菌中有 3个大肠杆菌 DEG蛋白酶的
同系物: DEGP/HTRA、DEGQ/HTRA和DEGS/HHPB
(Sokolenko et al. , 2002; Kieselbach and Funk, 2003;
Huesgen et al., 2005)。对它们的双和三DEG突变体
研究表明, 尽管它们对光保护是必要的, 但是DEG蛋白
酶在活体中对于D1 蛋白的周转和修复不起关键作用
(Barker et al., 2006)。近年来对大肠杆菌的DEG蛋
白酶的结构特点、存在形式以及晶体结构的深入研究
加深了我们对 DEGP 蛋白酶的功能特性的理解。随着
拟南芥基因组测序的完成, 对拟南芥中的DEG蛋白酶同
系物的鉴定和研究也取得了很大进展。
1 DEGP的结构特点和功能
对大肠杆菌DEGP的研究结果显示, 它的氨基酸组成中
除了含有丝氨酸类型的蛋白酶结构域外, 还含有 2个
PDZ结构域 (Pallen and Wren, 1997; Clausen et al.,
2002)。不同物种(如大肠杆菌、蓝细菌和拟南芥)中的
DEGP 家族蛋白酶的结构域部分氨基酸序列均高度保
38 植物学报 44(1) 2009
守。PDZ结构域通过与底物蛋白C-末端的数个氨基酸
残基发生特异性的结合参与调节蛋白 -蛋白之间的相互
作用, 并且对底物的识别和蛋白酶活性的调节也非常重
要(Sheng and Sala, 2001; W ilken et al. , 2004)。PDZ
结构域的晶体结构揭示了 PDZ和多肽之间的识别方式
(Doy le et al., 1996)。PDZ结构域可以帮助 DEGP 蛋
白酶组装成有功能的六聚体形式(Sas soon e t a l. ,
1999)。在不同的物种中, DEGP 蛋白酶家族成员的氨
基酸组成中所含有的 P DZ 结构域的数量也有所不同。
在大肠杆菌的 DEGP 蛋白酶中含有 2个 PDZ结构域。
在拟南芥中, 大多数的DEGP蛋白酶只含有1个PDZ结
构域, 如 DEG1和 DEG8等; 而有的没有明显的 PDZ结
构域, 如 DEG2和 DEG5。在大肠杆菌中 DEGP蛋白酶
的功能单位是三聚体, 形成一个像管道式的结构。蛋白
酶结构域位于管道的顶端, PDZ结构域位于底部外围。
蛋白酶结构域形成比较固定的部分, PDZ结构域则相对
比较灵活(Clausen et al. , 2002)。对 DEGP 的晶体结
构研究发现, 2个三聚体通过长的 Loop形成 1个六聚体
的功能体。在低温时它的蛋白水解区域由于外围的
PDZ结构域处于封锁状态, 使得底物不能进入催化区域,
所以表现为分子伴侣活性; 当温度升高时, 外围的 PDZ
结构域处于开放状态, 这时底物可以进入催化位点被降
解, 所以表现出蛋白酶水解活性(Krojer et al. , 2002)。
大肠杆菌中的DEGP蛋白酶的结构特点在生理上表现为
双重功能, 这两种功能的转换靠温度的变化来调节, 在低
温时表现出分子伴侣的功能, 在高温时则表现为蛋白酶
的功能。这样的特性使得它可以区分哪些是可以再折
叠的蛋白底物, 哪些是不能再折叠而需要被降解的蛋白
底物(Spiess et al. , 1999)。
2 拟南芥中的DEG蛋白酶
在拟南芥中有 16个 DEGP 类似的蛋白酶, 根据蛋白质
组学数据, 其中有 4 个定位于叶绿体(Pe lt ier et a l. ,
2002; Schubert et al. , 2002)。其中 DEG1、DEG5
和DEG8定位于类囊体腔侧, DEG2定位于类囊体膜的
基质侧。
2.1 类囊体腔侧的DEG蛋白酶
2.1.1 DEG1蛋白酶
Itzhak i等(1988)研究发现, 豌豆叶绿体中含有一个DEG
蛋白酶。该蛋白酶与膜结合, 可以被高浓度的盐和非金
属去污剂洗脱, 说明它是一个膜周质的蛋白酶, 但该蛋白
酶不能被外加的蛋白酶所消化, 表明它位于类囊体腔
侧。经 40°C热处理 4小时, 该蛋白酶的蛋白含量逐渐
增加, 表明它可能在叶绿体的热胁迫适应中起作用。含
有DEG1的类囊体可以降解模式底物 b-干酪素, 这种降
解可以被丝氨酸类型的蛋白酶抑制剂所抑制 , 说明
DEG1是丝氨酸类型的蛋白酶。
Chas s in 等(2002 )体外表达并纯化了叶绿体的
DEG1蛋白酶, 发现在体外它能以单体和六聚体的形式
存在, 具有降解模式底物 b-干酪素的活性, 其活性与浓
度呈正相关且在pH值为6.0时最高, 在0-42°C范围内,
随着温度的升高其活性增加。体外表达纯化的DE G1
可以降解体外表达纯化的质体蓝素和放氧复合物PsbO
蛋白, 表明它可以降解类囊体腔侧的蛋白质。K apri -
Pardes等采用RNA干扰技术获得了抑制DEG1表达的
拟南芥突变体, 这些突变体表现出对光抑制的敏感性增
加, 植株生长慢, 矮小并且早花。突变体中无功能形式
的 D1 蛋白累积量增加, 并且产生 D1 蛋白的C- 末端
5.2 kDa和 16 kDa的降解片段。用体外重组的DEG1
蛋白酶处理翻转的类囊体膜, 可以产生 D1蛋白的 C-末
端 5.2 kDa的降解片段, 表明 DEG1蛋白酶可能参与了
D1蛋白在第 5跨膜 Loop后腔侧区的剪切。在 deg1突
变体中, FTSH蛋白酶的含量减少了, 同样在 FTSH蛋
白酶的突变体中 , 发现 DE G 1 蛋白酶的含量也减少
了。这些研究表明DEG1可能和FTSH发生相互作用,
共同参与被光破坏的 D1 蛋白的降解。另外, 还发现
突变体中的 DE G 2 蛋白酶的含量也有所减少, 说明
DEG1和DEG2也可能发生了相互作用(Kapri-Pardes et
al. , 2007)。
2.1.2 类囊体膜腔侧的 DEG5和 DEG8蛋白酶
Sun等研究发现, 拟南芥的 DEG5和 DEG8蛋白酶定位
于类囊体膜腔侧, 是与膜结合的周质蛋白。它们在体外
39 张艳玲等: 拟南芥叶绿体中DEG蛋白酶功能的研究进展
可以形成六聚体复合物。体外重组的DEG 8具有蛋白
酶水解活性, 可以降解模式底物 b - 干酪素。重组的
DEG8和经光破坏的类囊体膜共同温育, 发现它可以降
解 D1蛋白, 并产生 N-末端 16 kDa和 C-末端 18 kDa
的降解片段, 说明它可能在类囊体膜的腔侧和D1蛋白
的 CD 跨膜 Loop 处发生剪切。进一步筛选DE G5 和
DE G 8 缺失的突变体, 并通过杂交获得了同时缺失
DEG5和 DEG8的双突变体。研究表明, 在正常生长条
件下, 突变体和野生型之间没有明显的差异。但是在强
光条件下, 突变体的生长受抑制的程度增加, 生长速度明
显低于野生型, 双突变体的生长受抑制程度更为显著。
用离体叶片进行光抑制实验, 发现突变体对光抑制的敏
感性增加, 双突变体比单突变体对光抑制的敏感性更
高。免疫印迹分析表明, 突变体中的 D1蛋白的降解速
度比野生型慢。这些研究表明缺失 DEG5和 DEG8后,
在光抑制条件下D1蛋白的降解受到了影响, 证明DEG5
和 DEG8可能参与了光抑制条件下 D1蛋白的降解。缺
失 DEG5和 DEG8的双突变体比单突变体对光抑制的
敏感性增加的程度大, 证明它们在降解光破坏的D1蛋
白上有协同功能(Sun et al. , 2007a)。同时通过检测
体内光抑制免疫印迹结果, 证明其在体内具有协同作用,
共同参与 D1蛋白 CD区的降解。对突变体和野生型材
料做热胁迫处理, 发现在热胁迫条件下突变体也表现出
了与强光胁迫相似的敏感性(Sun et al. , 2007b)。因
此, DE G5和 DEG8不仅参与光抑制条件下被破坏的
D1蛋白的降解, 也可能参与高温条件下被破坏的D1蛋
白的降解。
2.2 基质侧的DEG2蛋白酶
Haussuhl等研究发现, DEG2蛋白酶分布在类囊体膜基
质侧非垛叠区域, 是一个与膜结合的周质蛋白。体外纯
化的 DEG2分子量约为 60 kDa。用蛋白酶抑制剂处理
后发现, DEG2的蛋白酶水解活性可以被丝氨酸类型的
蛋白酶抑制剂特异性地抑制, 说明 DEG2是一个丝氨酸
类型的蛋白酶。在干旱、盐和强光胁迫下, DE G2的
表达量有所增加, 表明它可能参与了植物的胁迫响应。
体外重组的 DEG2蛋白酶可以降解 D1蛋白, 并产生 C-
末端 23 kDa的降解片段。反应体系中加入GTP 可以
促进反应, 说明 DEG2是一个依赖于 GTP的蛋白酶, 参
与了对D1 蛋白的降解。DEG2只能降解光破坏的 D1
蛋白, 而不能降解其它光系统蛋白, 其在4°C和37°C时
都有水解活性。说明 DEG 2的生理底物是已破坏的蛋
白, 不降解那些没有被破坏的蛋白(Haussuhl et al. ,
2001 )。
体外重组的DEG2可以降解D1蛋白, 那么它在体
内的生理功能是什么呢？筛选拟南芥 DEG2突变体, 结
果表明缺失DEG2的拟南芥突变体和野生型在生长表型
上没有明显差异。进行光抑制处理后发现, 突变体对光
抑制的敏感性与野生型相比也没有差异, 并且突变体中
D1蛋白的降解也没有发生明显改变。这说明在拟南芥
的叶绿体中, 有其它蛋白酶可能起到了与 DEG2同样的
功能, 当 DEG2缺失时, 它们可以替代补偿DEG2的作
用(Huesgen et al. , 2006)。
3 拟南芥中DEG蛋白酶的作用底物
在蛋白酶的功能研究中, 研究者最关心的是其作用底物,
只有搞清作用底物才能进一步研究它们作用的分子机
制。在对大肠杆菌的 DEG蛋白酶的研究中发现, 它的
生理底物主要是细胞周质中那些错误折叠或者被破坏的
蛋白, 诸如 colic in A lysis protein、K88 and K99 pil in
subunits、MalS和 PapA pilin (Kim and Kim, 2005)。
拟南芥中的 DEG蛋白酶有 16个家族成员, 它们的分布
位置不同, 所起的作用也不同, 其作用底物也有很大差
异。即便是分布在同一位置, 它们之间虽然可能会发生
相互协作, 但也不能排除它们对底物识别的差异。在拟
南芥的叶绿体中, 目前发现的4个DEG蛋白酶都可以对
光破坏的D1蛋白发生作用, 但是它们的作用位点有所不
同(Haussuhl et al., 2001; Kapri-Pardes et al. , 2007;
Sun et al. , 2007a)。这说明蛋白酶在降解某个特定底
物时既有协作又有分工, 但也可能证明它们的作用底物
不仅有 D1蛋白一个。体外纯化的DEG1蛋白可以降解
体外纯化的PsbO蛋白, 这表明DEG蛋白酶对作用底物
起作用所需的条件有差异。在细胞环境中, DEG蛋白
40 植物学报 44(1) 2009
酶不只一个, 也可能只是在特定的生长条件下才会对特
异的底物起作用。由于细胞内环境非常复杂, 很难捕捉
到DEG蛋白酶的所有作用底物, 只能在特定的处理条件
下去分析和发现它们的作用底物。在缺失突变体中, 蛋
白酶的作用底物往往会发生累积, 结合突变体以及蛋白
质组学分析, 将会更有效地发现蛋白酶的作用底物
(Sjögren et al. , 2006)。
4 DEG蛋白酶之间以及与其它蛋白酶
之间的关系
在拟南芥的叶绿体中, 已鉴定有 4个 DEG蛋白酶存在,
其中分布在类囊体膜腔侧 3个, 基质侧 1个。它们的存
在方式和相互关系如何呢？在大肠杆菌中, DEG蛋白酶
形成寡聚六聚体(Krojer et al. , 2002)。在叶绿体中,
DEG1可以形成寡聚体(Chassin et al. , 2002)。体外
检测发现DEG5和DEG8也可以形成六聚体复合物(Sun
et al., 2007a)。在 DEG1减少的突变体中, DEG2蛋
白酶含量也减少了, 表明 DEG1和 DEG2之间存在某种
相互联系(Kapri-Pardes et al. , 2007)。这些蛋白酶之
间存在着功能上的相互关联, DEG5和 DEG 8的双突
变体比单突变体对光抑制的敏感程度更强, 表明它们之
间在功能上存在一定的协同性(Sun et al. , 2007a)。
在对同一个作用底物的降解上, 虽然它们的作用位点可
能不同, 但是它们可能会同时参与底物的降解, 加速对
底物的清除。
5 研究展望
目前已鉴定的叶绿体中 DEG蛋白酶有 DEG1、DEG2、
DEG5和 DEG8, 在体外实验中证明它们都可以参与对
光破坏的 PSII反应中心 D1蛋白的降解。但是在 D1蛋
白降解时它们是如何分工合作？它们之间的关系如何？
它们是否还有其它的作用底物？针对其它底物的特异性
怎样？在类囊体膜腔中存在的 DEG1、DEG5和 DEG8
之间是否能形成同源或异源多聚体？它们在发挥作用时
是否与光合膜复合物相互结合, 在不同的环境条件下它
们又是如何发生相互作用的？在拟南芥中, 有16个基因
编码 DEG 类似蛋白酶, 经预测, DE G6、DEG 9 和
DEG16也定位在叶绿体中(Huesgen et al., 2005)。叶
绿体中其它 3个 DEG蛋白酶的功能如何？其作用底物
是什么？它们与目前所研究的DEG1、DEG2、DEG5
和DEG8之间的关系如何等等, 诸多的问题还有待于逐
步研究解答。
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Yanling Zhang1, Xuwu Sun2, Lix in Zhang2*
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2Ke y L aborato ry of Photosynth esis an d Envi ronmental Mol ecul ar Physio logy, Photosynthe sis Re search Cen ter, In sti tute o f Bo tan y,
Ch ine se Acad emy of Sci ences, Bei jin g 1 000 93, Chi na
Abstr act The DEGP f amily is w idely present in cells of both prokaryotes and eukaryotes. In Arab idops is thali ana, 16 genes
coding for DEGP- like proteases have been identif ied, 4 of w hich are located in chloroplasts , according to proteomic data. The
DEGPs in chloroplas ts of A. thali ana w ere analyzed by biochemical and molecular biology methods, and results suggested that
these DEGPs are involved in the degradation of the photosystem II reac tion center protein D1; therefore, they play important roles
in the repair cycle and maintenance of the photosystem II complex. In this paper, w e review recent progress in research into the
struc ture and f unc tion of DEGPs in chloroplasts of A. thal iana.
Ke y words Ara bid opsi s thal ian a, chlo rop last, DEG pro teases
Zhang YL, Sun XW, Zhang LX (200 9). Ad van ces in fun cti on stud y o f DEG p roteases i n chlo rop last of Arabid opsis thal ian a. Chi n Bu ll
Bo t 44 , 3 7-42 .
* Author for correspondence. E-mail: zhanglix in@ibcas.ac.cn
(责任编辑: 白羽红)