全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (3): 317-322, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2009.03.008
收稿日期: 2008-08-14; 接受日期: 2008-11-14
基金项目: 河南省重点科技攻关项目(No.92102110160)、河南省教育厅高校青年骨干教师项目(No.200733529)和河南大学重点项目(No.
06ZDZR011)
* 通讯作者。E-mail: wzc@henu.edu.cn
.研究报告.
拟南芥幼苗超低温保存后 DNA甲基化的遗传变异
何艳霞, 王子成*
河南大学农业生物技术研究所, 开封 475004
摘要 运用MSAP技术分析了拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗超低温保存后DNA甲基化的遗传变异情况。结果表明, 在扩
增的662条带中, 对照和2个处理及其第2代间完全一致的带型有598条; 发生变化的带型有64条, 其中能遗传给第2代的有48
条, 占变异条带的75%。与对照相比, 经超低温保存的样品新产生的甲基化位点有14个, 而去甲基化的位点有22个。经过处
理但未冷冻的与冷冻处理组之间带型一致的有624条, 差异条带有38条, 占5.7%, 而对照与未冷冻处理组的差异率是7.45%,
对照与冷冻处理组之间的差异率是6.63%。可见, 拟南芥在超低温保存中, 无论是经液氮冷冻还是未经冷冻处理, 对材料的甲
基化状态均有影响, 而这种甲基化变化大部分是可以遗传的。
关键词 拟南芥, DNA甲基化, 遗传变异, 甲基敏感扩增多态性
何艳霞, 王子成 (2009). 拟南芥幼苗超低温保存后DNA甲基化的遗传变异. 植物学报 44, 317-322.
超低温保存是指在-80°C以下的超低温下保存种
质资源的一整套生物学技术。自1973年Nag等首次超
低温保存胡萝卜悬浮细胞系获得成功以来, 国内外已对
200多种材料进行了超低温保存(梁宏和王起华, 2005)。
超低温保存过程一般包括预培养、脱水、冷冻及解冻
等过程, 涉及一系列的胁迫, 包括渗透胁迫、低温胁迫
等。这些胁迫可能作为一种选择压对不同基因型的植
物材料产生选择效应(Diettrich et al., 1986)。
DNA甲基化(DNA methylation)是真核生物基因组
最常见的一种DNA共价修饰形式, 广泛存在于各种有机
体中。DNA甲基化特别是胞嘧啶的甲基化具有表观遗
传效应和突变效应, 涉及一系列的生物学过程, 如基因
组的稳定、X染色体的失活、基因的转录调节和转座
子元件的活性、基因沉默、基因组印迹等(Bird and
Wolffe, 1999; Bestor, 2000; Bender, 2004; Gehring
et a l., 2004; Chan et a l., 2005)。作为一种表观遗
传修饰, DNA甲基化并不改变碱基的排列顺序,但是阻
断了遗传信息的传递, 从而引起形态性状的变化, 是现
代表观遗传学研究的主要内容和热点之一(仪治本等,
20 05 )。
甲基敏感扩增多态性(methylation-sensitive ampli-
fied polymorp-hism, MSAP)是将AFLP分析和使用甲
基敏感性限制性内切酶结合起来, 以对甲基化敏感的酶
HapII和MspI代替MseI作为高频内切酶, 以EcoRI为
低频内切酶进行反应, 能够检测在DNA序列没有发生变
化的情况下基因组DNA的甲基化修饰水平。该技术已
被应用于水稻( Or yza s a ti v a )、油菜( B r a s s i c a
campestris)、大蒜(Al lium sativum)和玫瑰(Rosa
rugosa)等多种植物的基因组DNA甲基化研究中(Xiong
et al.,1999; Xu et al., 2004; Sha et al., 2005; 陆光远
等, 2005; 何艳霞等, 2007), 并且逐步用于超低温保存
过程中的遗传稳定性研究。Hao等(2001, 2002)应用
MSAP技术检测了超低温保存后苹果和草莓再生植株的
DNA甲基化状态, 发现保存后材料的DNA甲基化水平
均有所降低。
本研究以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)为材
料, 对其幼苗进行超低温保存和处理, 运用MSAP技术检
测处理后材料的DNA甲基化水平的变化情况, 以期探讨超
318 植物学报 44(3) 2009
低温保存导致的表观遗传信息改变问题及对有性生殖后代
的影响, 同时也为其它植物材料的相关研究提供参考。
1 材料与方法
取萌发1-2天的拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)幼苗,
参照Liu等(2001)和王子成和邓秀新(2001)的方法进行
玻璃化法超低温保存。对幼苗设置 3个样品池: (1)对
照, 萌发的幼苗不进行任何处理; (2)处理A, 对幼苗进行
预处理、玻璃化保护剂处理、解处理和恢复培养, 但
不放入液氮中冷冻及解冻; (3)处理B, 对幼苗进行完整
的超低温保存过程。处理A和处理B除了冷冻和解冻
过程的有无外, 其余操作均相同。3个培养池的材料在
抽薹期取幼嫩叶片提取DNA备用。待植株结实成熟后,
收获种子, 然后再次进行萌发培育至抽薹期并分别取叶
片提取DNA备用。每个样品池的材料, 分别取40-50
株幼苗上的嫩叶混合。采用Micheli等(1994)的CTAB
法提取 DNA。
MSAP分析参照Xiong 等(1999)和Cervera 等
(2002)的方法并略作改动。用MspI和HapII分别与
EcoRI结合对基因组DNA进行酶切。EcoRI/HpaII酶
切过程分步进行: 20 mL体系含DNA 250 ng, EcoRI 3
U, 10×缓冲液(500 mmol.L-1 Tris-HCl, pH 7.5; 100
mmol.L-1 MgCl2; 10 mmol.L-1 Dithiothreitol; 100
mmol.L-1 NaCl) 2 mL和无菌水, 于37°C下温浴2-4小
时, 加2倍体积无水乙醇-20°C下放置2小时, 抽干后
加6 mL无菌水溶解, 然后加入3 U HpaII, 2 mL 10×缓冲
液(100 mmol.L-1 Tris-HCl, pH 7.5; 100 mmol.L-1
MgCl2; 10 mmol.L-1 Dithiothreitol), 加水至20 mL, 37°C
下酶切3小时。MspI酶切体系: 20 mL体系含DNA 250
ng, EcoRI和MspI各 3U, 10×缓冲液(330 mmol.L-1
Tris-Ac, pH 7.9; 100 mmol.L-1 Mg-Ac, 5 mmol.L-1
Dithiothreitol 660 mmol.L-1 K-Ac) 2 mL, 4.0 mL BSA
和无菌水, 在37°C下反应3小时。酶切产物随后进行
连接、预扩、选扩、电泳及银染, 操作过程均参照
何艳霞等(2007)所述方法。分子标记检测所用的接
头及引物均由上海生工公司合成。接头和引物序列
见表 1 。
2 结果与讨论
HpaII和Msp I是一组同裂酶, 二者均识别并切割 5-
CCGG-3序列, 但是HpaII对胞嘧啶的甲基化极其敏感,
它不能切割任何一个或两个胞嘧啶均甲基化的序列, 也
即Hpa I I 对 5 -CmCGG-3、5 -mCCGG-3 和 5 -
mCmCGG-3都不能表现活性, 但是若只在单链发生甲
基化, 它是能够识别并切割的。而 MspI只对外部胞嘧
啶的甲基化敏感, 也就是说MspI可以切割5-CmCGG-
3, 但不能切割5-mCCGG-3。因此在本实验中共检测
到3种带型(表2): I型带是在EcoRI/HpaII和EcoRI/MspI
两种酶切组合中均出现的带(图1中a所示); II型带是在
EcoRI/HpaII酶切中不出现但在EcoRI/MspI中出现的带
(图1中b所示); III型带是在EcoRI/HpaII酶切中出现但
在EcoRI/MspI中不出现的带(图1中c所示)。用EcoRI
和HpaII-MspI的14对引物组合共扩增出 662条带, 带
型分布见表3。所有的带中, 在对照和2个处理及其第
表 1 接头和引物序列
Table 1 Sequences of adapters and primers
Primers/adapters Sequences
Adapter
EcoRI-adapterI 5-CTCGTAGACTGCGTACC-3
EcoRI-adapterII 5-AATTGGTACGCAGTC-3
HpaII-MspI-adapterI 5-GATCATGAGTCCTGCT-3
HpaII-MspI-adapterII 5-TCATGATCCTGCTCG-3
Preselective primers
E-A 5-GACTGCGTACCAATTCA-3
HpaII-MspI 5-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3
Selective primers
EcoR-AAC 5-GACTGCGTACCAATTCAAC-3
EcoR-AAG 5-GACTGCGTACCAATTCAAG-3
EcoR-ACA 5-GACTGCGTACCAATTCACA-3
EcoR-ACT 5-GACTGCGTACCAATTCACT-3
EcoR-AGG 5-GACTGCGTACCAATTCAGG-3
EcoR-ACC 5-GACTGCGTACCAATTCACC-3
EcoR-ACG 5-GACTGCGTACCAATTCACG-3
EcoR-AGC 5-GACTGCGTACCAATTCAGC-3
HpaII-MspI-TCCA 5-ATCATGAGTCCTGCTCGGTCCA-3
HpaII-MspI-TCAA 5-ATCATGAGTCCTGCTCGGTCAA-3
319何艳霞等: 拟南芥幼苗超低温保存后DNA 甲基化的遗传变异
2代间完全一致的带型有598条, 而最多的I型带有514
条, 其次是 II型带, 有 59条, III型带只有 27条。
在带型有变化的 64条带中, 可以大致分成两种情
况: 第1代样品在处理之间有变异, 而这种变异仍然体现
在第2代的样品中, 这样的变异带共有48条, 占变异条
带的75%; 其余的25%在代与代之间表现不一致。按
照Hao等(2002)的方法分析第1代的3个样品带型, 结
果表明, 与对照相比, 经超低温保存的样品(处理B)新产
生的甲基化条带有14条, 而去甲基化的位点有22个, 另
外有4个变化位点可能是新产生的, 也可能是脱甲基化
造成的。在所有变化的条带中, 处理A的带型与对照一
致而与处理B不同的有14条, 与处理B一致而与对照有
差异的有26条, 其中还有25条带为其独有而与对照和
处理B均不同。单独分析第2代, 样品间差异的带型有
51条, 而其中49条均与第1代的变异一致, 只有2条差
异带不同。
2个处理组间带型一致的有624条, 差异带有38条,
占5.7%。而对照与处理B的差异率为6.63%, 对照与
处理A的差异率为 7.45%。可见, 在超低温保存处理
中, 无论是经液氮冷冻还是未经冷冻处理, 对材料的甲基
化状态均有影响。与处理A相比, 处理B去甲基化的有
16条, 而新产生的甲基化仅有8条。冷冻的总体趋势还
是以脱甲基化为主, 同前面与对照分析结果一致。另
外, 在所有的差异带中, 数量最多的是在处理A中显示
出II型带而其它所有的泳道中均无任何带型(表3中带星
号的带型及图1中粗箭头标注的位置)。这是否暗示在
冷冻保护液处理中形成的差异会由液氮冷冻消除一部分,
还有待进一步研究。此外在统计的带型中有少数带型
变化跳跃性很大, 目前无法分析其原因。Riddle 和
Richards(2002)研究证实, 染色体NOR区的甲基化水平
表 2 同裂酶HpaII和MspI的甲基化敏感性及限制性谱带分析
Table 2 Methylation-sensitivity and restriction bands of HpaII and MspI
Methylation state Restriction enzyme activity Restriction bands Count of the bands
HpaII MspI HpaII/EcoRI MspI/EcoRI
CCGG + + I
GGCC Active Active
CmCGG - + I I
GGmCC Inactive Active
mCCGG + - III
GGCC Active Inactive
mCmCGG - - -
GGmCmC Inactive Inactive
图 1 拟南芥幼苗基因组甲基敏感扩增多态性分析
1: 对照; 2: 处理A; 3: 处理B; 1、2、3分别是1、2、3的第
2代; a、b、c 分别表示 I、II、II I型带; M: Ms pI/Ec oRI消化图
谱; H: HpaII/EcoRI消化图谱
Figure 1 DNA methylation-sensitive amplified polymorphism
(MSAP) of Arabidopsis seedlings
1: Control; 2: Samples of treatment A; 3: Samples of treatment
B; 1, 2, 3 represent the descendants of 1, 2, 3, respectively;
a, b, c indicate I, II, III MSAP - banding patterns respectively; M:
Digested figs of MspI/EcoRI; H: Digested figs of HpaII/EcoRI
320 植物学报 44(3) 2009
变异是受遗传因子和表观遗传因子共同控制的。其具
体机制还不十分清楚。曾有人认为DNA甲基化水平的
变化是为了适应一些变化着的生存环境而发生的自我修
饰, 但还有待进一步证实。
植物DNA甲基化水平在植物的不同组织及生长的
不同时期都会有差异, 这在其它的物种中已有报道。番
茄(Lycopersicon esculentum)种子的甲基化水平比成熟
叶片高, 而成熟叶片比幼叶高(Messagure et al., 1991);
水稻中幼苗的甲基化程度比剑叶高(Xiong et al., 1999)。
这可以解释为甲基化是植物在发育和分化过程中控制基
因表达的一种调控机制(刁线民和孙敬三, 1999; 崔欣等,
2002)。在本研究中, 取材时间都控制在同一生理期, 部
位都是幼嫩叶片, 从而减小了实验误差。通过Southern
杂交证明, 拟南芥DNA对于MspI的敏感位点要比对
HpaII多得多(Finnegan et al.,1996; Ronemus et al.,
1996), 因而对于甲基化的CCGG序列, HpaII要比其同
裂酶MspI切割的频率低。理论上分析本研究得到的II
型带应多于III型带, 我们的实际统计结果也是II型带(59
条)多于 III型带(27条), 证明本研究结果是可靠的。
种质保存的目的不仅是要保证物种的延续, 而且也
要尽可能减少保存过程中变异的发生。冷冻保存与未
冷冻保存相比, 其甲基化的水平会发生变化, 有新产生的
甲基化也有脱甲基化的条带出现, 而脱甲基化是主要趋
势。Hao等(2002)在对草莓的超低温保存研究中, 也发
现有脱甲基化现象, 表明外界的影响可以导致遗传物质
修饰的变化。在研究植物春化作用时, 也发现经过低温
处理的植物材料发生了DNA脱甲基化(Sherman and
Talbert, 2002)。DNA甲基化的变化参与植物基因表达
表 3 样品MSAP带型统计
Table 3 Analysis of MSAP-banding patterns of the sample
Band patterns\groups of sample 1 2 3 1 2 3 Amount
Same band patterns in all samples I I I I I I 514
II II II II II II 59
III III III III III III 25
Band patterns changed among the treatment I II I I II I 6
groups but the variations were genetic to - I - - I - 4
their descendants I I - I I - 4
I II II I II II 5
- II - - II - 3
I III III I III III 3
- - I - - I 3
- I I - I I 4
II I I II I I 3
III III I I I I 3
III I I III I I 3
II II I II II I 4
- - II - II II 1
II I - II - - 2
Band patterns changed among the treatments II - I I I I 1
but the variations were not be genetic II II II - - - 2
- I - - - - 8*
- II I I I I 1
I III II I II I 2
- - III III III III 1
II III - - - 1
1、2、3、1 、2、3 同图 1 ; * 一种特殊的变异带型
1, 2, 3, 1, 2, 3 see Figure 1; * An abnormal variation band
321何艳霞等: 拟南芥幼苗超低温保存后DNA 甲基化的遗传变异
调控, 对植物的生长发育起着非常重要的作用(Razin
and Cedar, 1991; Prudhac et al.,1996; 南楠等, 2008)。
如果甲基化水平不足或者太高, 都会导致生长发育不正
常和形态结构异常(Ronemus et al.,1996; Kakutani et
al.,1999; Finnegan et al., 2000)。在本实验中观察到
的处理组幼苗生长滞后的现象是由于低温造成的, 而导
致了甲基化的变化, 还是因为低温导致甲基化的变化而
引起生长滞后？这还有待进一步探讨。本实验中观察
到甲基化变化的条带有75%在第2代中出现, 而第1代
种子的萌发率有某种程度的降低。可以推测这些变化
可能与某些转座子有关, 从而启动了与再生与分化相关
基因的表达, 其中脱甲基化可能更为重要。
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322 植物学报 44(3) 2009
Variation of DNA Methylation in Arabidopsis thaliana Seedlings
After the Cryopreservation
Yanxia He, Zicheng Wang*
Insti tute of Agricultural Biotechnology, Henan University, Kaifeng 475004, China
Abstract We analyzed the variation patterns of DNA methylation in Arabidopsis thaliana seedlings after cryopreservation using
methylation-sensitive amplified polymorphism. Of 662 fragments, 598 were shared by all the samples and their descendants; and
among 64 different fragments, a varied 48 (75%) were genetically related to their descendants. Compared to the control, 14 sites
showed de novo methylation, and 22 sites were demethylated in the samples after cryopreservation. Among samples treated with
cryoprotection and after cryopreservation were 624 shared fragments and 38 fragments of difference, with 7.45% and 6.63%
difference in the two treatment samples, respectively, as compared with the control. In conclusion, the results showed that
whether cryostorage in liquid nitrogen or other treatments had impact on the DNA methylation states of the material in this study, and
most of the change could be genetic to their descendants.
Key words Arabidopsis thal iana, DNA methylation, genetic variation, methylation-sensitive ampli fication polymorphism
He YX, Wang ZC (2009). Variation of DNA methylation in Arabidopsis thaliana seedlings after the cryopreservation . Chin Bull Bot 44,
317-322.
* Author for correspondence. E-mail: wzc@henu.edu.cn
(责任编辑: 白羽红)
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