全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (2): 220–225, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.02.011

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收稿日期: 2009-02-24; 接受日期: 2009-04-11
基金项目: 国家自然科学基金(No.30800075)和教育部高等学校博士点专项基金(No.20050475001)
* 通讯作者。E-mail: wangpt@henu.edu.cn
拟南芥干旱相关突变体的远红外筛选及基因克隆
刘浩1, 王棚涛1*, 安国勇1, 周云1, 樊丽娜2
1河南大学生命科学学院, 植物逆境生物学重点实验室, 开封 475004; 2广州甘蔗糖业研究所, 广州 510316
摘要 干旱胁迫是影响植物生长发育的主要限制因素之一。到目前为止, 许多研究都仅关注于植物对干旱反应的信号转导
网络, 而对其中一些很重要的中间成分却知之甚少。保卫细胞定位于植物叶片的表皮中, 控制二氧化碳的吸收以及水分的
散失, 已经成为一种高度特化的细胞体系, 可用来研究植物早期干旱信号转导机制。控制气孔的开度在提高植物的抗旱性
方面具有重要意义。通过使用远红外热成像仪检测植物叶片表面温度的微小差异, 我们成功地筛选并获得了拟南芥
(Arabidopsis thaliana)干旱敏感突变体doi1。在干旱胁迫条件下, 该突变体表现为叶面温度低于野生型, 且失水率比野生型
高。利用TAIL-PCR技术成功克隆到该突变体基因NCED3, 并利用RT-PCR方法验证了TAIL-PCR结果的可靠性。
关键词 拟南芥, 干旱, 远红外热成像仪, TAIL-PCR方法
刘浩, 王棚涛, 安国勇, 周云, 樊丽娜 (2010). 拟南芥干旱相关突变体的远红外筛选及基因克隆. 植物学报 45, 220–225.
非生物胁迫是农业可持续发展的重要限制因素,
特别是干旱和盐渍条件会造成粮食大幅度减产。因此,
植物逆境生物学一直是植物生物学研究中的一个非
常活跃的领域(汪本勤等, 2007)。近年来的研究表明,
植物叶片气孔开度和密度是影响植物水分利用效率
的重要因素, 是植物在干旱胁迫下保持水分和提高水
分利用效率的重要调节因子 (Schroeder et al.,
2001)。而植物叶片气孔的调节又受保卫细胞控制,
因此, 从保卫细胞角度考虑如何提高植物水分利用效
率就显得非常重要。保卫细胞具有非常灵敏的感受外
界信号变化的能力,干旱条件下, 在植物地上部分尚
未检测到任何水分变化时, 植物叶片气孔已经迅速关
闭(Luan, 2002)。诸多证据表明, 各种胁迫或刺激均
可以引起细胞内信号转导过程, 最终表现为气孔运动
(Assmann,1993; Schroeder et al., 2001)。
通过筛选气孔调节突变体寻找提高植物水分利
用效率的研究已成为生物节水研究的新途径(Knight
et al., 1994; 廖建雄和王根轩, 2000)。然而, 由于很
难从宏观上检测叶片气孔的开闭, 且利用拟南芥(Ar-
abidopsis thaliana)模式体系进行遗传学筛选仍存在
许多技术上的困难, 故对于大规模的突变体筛选工
作, 筛选方法是成败的关键。筛选条件越专一, 直接
获得所期待突变体的机会就越多(侯仙慧等, 2009)。
叶片通过气孔蒸发水分, 使叶片表面的温度降低, 远
红外热成像仪可以检测叶片温度的微小差异。前人已
经成功利用对温度敏感的远红外热成像系统, 以气孔
保卫细胞开闭引起的叶片表面温度微小变化为监控
指标, 构建了有效的遗传学筛选体系(Merlot et al.,
2002)。本实验室利用此研究体系, 通过模拟干旱胁
迫, 在拟南芥T-DNA突变体库中成功筛选到1株叶片
温度明显不同的气孔反应突变体, 并利用TAIL-PCR
(thermal asymmetric interlaced-PCR)技术成功地对
该基因进行了克隆, 该突变基因为干旱主效基因之
一: 9-顺式-环氧类胡萝卜素双氧合酶(9-cis-epoxy-
carotenoid dioxygenase, NCED)基因(Wan and Li,
2006)。在高等植物中, NCED3被认为在干旱诱导
的ABA合成中起关键作用(Urano et al., 2009), 并且
可以在维管的薄壁细胞中特异表达 (Endo et al.,
2008)。
1 材料与方法
1.1 材料
实验材料为拟南芥(Arabidopsis thaliana L.) Colum-
·技术方法·
刘浩等: 拟南芥干旱相关突变体的远红外筛选及基因克隆 221
bia (Col)生态型。T-DNA突变体库由中国科学院遗传
与发育生物学研究所植物基因组学国家重点实验室
提供。
将拟南芥种子清洗消毒后点播于MS培养基上,
4°C春化2–3天后, 放置在材料室内进行培养。光照周
期为16小时光照/8小时黑暗, 培养温度为(20±2)°C,
光照强度为 120–150 μmol·m–2·s–1, 相对湿度为
80%。待幼苗长出4–6片叶子后, 移至营养土中继续
培养, 根据需要在适宜的时间取其不同部位的叶片进
行检测。
1.2 方法
1.2.1 干旱处理及远红外热成像仪对T-DNA突变体
的筛选
远红外热成像仪(ThermaCAM SC3000, 美国)配备
320×240 PtSi探测器, 能够探测短波红外线(8–9 μm),
在室温下温度分辨率小于0.03°C。成像仪安装在距叶
片35–45 cm的高度, 同时与监视器连接, 以便得到可
视的植物热成像。拍摄的热成像图储存于PMCIA存储
卡中。通过计算机用仪器所配热成像处理程序对热成
像、面积和温度频度分布直方图进行分析处理。
将拟南芥T-DNA突变体种子均匀播种于混有蛭
石的营养土中(蛭石与营养土的体积比为3:1), 每株
周缘间隔大约1 cm, 种植后覆盖塑料薄膜以保持湿
度。4°C春化3天后, 置于温室(18–22°C, 光照强度为
150 μmol·m–2·s–1, 光周期为16小时光照/8小时黑暗,
相对湿度为65%)中培养。生长10天后, 停止浇水, 转
移至一个较为干燥的培养箱中(25°C, 相对湿度为
50%, 16小时光照/8小时黑暗)继续培养。干燥处理大
约5天后, 通过远红外热成像仪对干旱处理后的幼苗
进行叶面温度检测, 筛选出叶温有明显差异的植株作
为潜在突变体, 并将其从群体中移出单独培养, 待单
株收种子后进行遗传和生理分析。

1.2.2 DNA侧翼序列的克隆 (TAIL-PCR)
TAIL-PCR技术的基本原理是3个嵌套的特异性引物
分别与简并引物(arbitrary degenerate primer, AD)组
合, 然后进行3轮连续的PCR循环。采用高温特异性扩
增与低温随机扩增相间进行的特殊热循环程序, 达到
特异产物扩增的同时, 抑制由随机引物产生的非特异
性扩增的目的, 所获得的片段可以直接用作探针标记
和测序模板。人们已成功地从P1、YAC和BAC克隆以
及拟南芥T-DNA插入突变体中分离获得了插入末端的
DNA序列(Liu and Whitter, 1995; Liu et al., 1995; Liu
and Huang, 1998)。Zuo等(2002)也成功地从拟南芥
T-DNA突变体库中分离获得了WUSCHEL基因。
根据pER16表达载体在T-DNA左边界上设计巢
式特异性引物LexA3、LexA4、LexA5和LexA6, 并根
据拟南芥基因特性设计随机引物AD1、AD2、AD3和
AD4, 用于TAIL-PCR实验(表1)。TAIL-PCR在MJ型
PCR仪上进行, 共包括3轮反应, 反应程序见表2。

1.2.3 植物总RNA的提取及RT-PCR
采用TRIZOL法 (参照TRIZOL Reagent说明书 ,

表1 TAIL-PCR引物
Table 1 Primers of TAIL-PCR
Name of
primers
Sequence of primers
LexA3 5′-ATCATCCCCTCGACGTACTGTAC-3′
LexA4 5′-CTGGTTTTATATACAGCAGTCGACG-3′
LexA5 5′-AGTCGAGGTAAGATTAGATATGG-3′
LexA6 5′-TTGGAGAGGACACGCTGAAGC-3′
AD1 5′- (AGCT)TCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT-3′
AD2 5′-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3′
AD3 5′- (A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGA-3′
AD4 5′-AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG-3′


表2 TAIL-PCR反应程序
Table 2 Program of TAIL-PCR
Reaction File
No.
Num-
ber of
cycle
Thermal condition
Primary 1 1 95°C (2 min)
2 5 94°C (30 s), 62°C (1 min), 72°C (2.5 min)
3 1 94°C (30 s), 25°C (3 min), ramping to 72°C
over 3 min, 72°C (2.5 min)
4 15 94°C (15 s), 68°C (1 min), 72°C (2.5 min)
94°C (15 s), 68°C (1 min), 72°C (2.5 min)
94°C (15 s), 44°C (1 min), 72°C (2.5 min)
5 1 72°C (5 min)
Secondary 6 15 94°C (15 s), 65°C (1 min), 72°C (2.5 min)
94°C (15 s), 65°C (1 min), 72°C (2.5 min)
94°C (15 s), 44°C (1 min), 72°C (2.5 min)
5 1 72°C (5 min)
Tertiary 7 25–30 94°C (15 s), 44°C (1 min), 72°C (2.5 min)
5 1 72°C (5 min)
222 植物学报 45(2) 2010
Invitrogen, Catalog No. 15596-018)提取总RNA。取
0.1 g拟南芥幼苗于液氮中充分研磨后, 将材料转移至
装有1 mL TRIZOL的离心管中, 剧烈振荡15秒, 室温
静置5分钟后, 加入200 μL氯仿并充分混匀, 再静置5
分钟。然后于4°C下, 1 150 ×g离心15分钟, 小心吸取
上清500 μL于1个新的离心管中, 并加入等体积的异
丙醇混匀后室温静置15分钟。然后于4°C下, 1 150 ×g
离心15分钟, 吸干上清后加入1 mL 75%乙醇(DEPC
处理水配制)洗涤沉淀。于4°C下, 7 500 ×g离心5分钟,
吸干上清后室温干燥5分钟, 加入20 μL DEPC处理水
溶解沉淀。
cDNA第1链的合成按照逆转录试剂盒说明
书进行(Promega product, Catalog No. M1701),
基因表达分析按照普通PCR方法进行。
RT-PCR所用引物 , NCED3基因Sense prim-
er: 5-CGGTATTGCCCGACTCAT-3; Antise-
nse primer: 5-CGAATCTTGCGACCTTGTT-3。
ACTIN2基因Sense primer: 5 -TCTTGACCTTG-
CTGGACG-3; Antisense primer: 5-CCTGCCTC-
ATCATACTCG-3。
2 结果与讨论
2.1 突变体的远红外验证
在远红外检测过程中, 幼苗生长时期、叶面积、植
株个体的高矮和营养土本身背景温度的不一致均
会造成幼苗的热图表现出个体间温度的显著差
异 , 因此对筛选得到的潜在突变体首先要排除这些
因素所造成的影响。以本实验室筛选到的突变体doi1
为例, 将突变体doi1单株收种子。种子干燥处理15天
后, 与野生型(WT)一同播种于正常的MS培养基上。
待幼苗长出4–6片真叶时, 将二者移栽到同一个盘中,
干旱处理4天后进行远红外的重复验证(图1A)。如图
1B所示, 突变体的叶面温度明显低于野生型, 二者相
差大约0.5°C (图1C), 说明doi1突变体叶面温度低的
表型能够稳定遗传。并且当干旱处理15天后, 突变体
doi1已经死亡, 而野生型还可以正常存活(图2), 这也
从另一方面暗示了doi1突变体确实与干旱有关, 也进
而证实了用远红外热成像仪来筛选干旱相关突变体
是可行的。
2.2 TAIL-PCR及RT-PCR方法克隆和验证突变体
基因
TAIL-PCR技术能够在较短的时间内从已知序列中分
离到其邻近的未知侧翼序列, 已成为T-DNA插入突
变体基因克隆的有效方法。因此, TAIL-PCR方法比传
统手段(图位克隆)能节约更多的时间。在TAIL-PCR
的第2轮反应中, 我们成功扩增到1个长约500 bp的
特异条带。以第2轮产物为模板, 经过PCR循环扩增,
最终得到1个大小约为400 bp的片段。为了防止PCR
扩增过程中出现错误, 取第2轮和第3轮反应产物进
行琼脂糖凝胶电泳分析。由于特异引物是嵌套的, 因
此特异性扩增的特点是第3轮反应产物小于第2轮,
两者片段长度相差距离正好与引物LexA4和LexA5在
T-DNA上的位置相差距离相等(图3A)。故我们认为第
3轮反应产物为特异性的目标片段。把第3轮的片段回
收后直接测序 , 结果表明 , T-DNA插入到NCED3
(At3g-14440)基因内部导致了突变体对干旱敏感
的表型。
为了进一步验证TAIL-PCR结果的可靠性, 我们
采用RT-PCR方法检验突变体中NCED3基因的表达
情况。结果表明, 该植株是纯合的T-DNA插入缺失突
变体 , NCED3基因在突变体中无正常的转录产物
(图3B)。
2.3 讨论
由于只有在微观情况下才能够测定气孔开度, 因此气
孔反应的分子遗传学分析一直不够深入。气孔的关闭
会减少水分的蒸腾进而导致叶片表面温度升高, 利用
远红外热成像仪可以把这种微小的差异检测出来。
Merlot等(2002)已经利用此种方法筛选到了一些干旱
相关的突变体, ost1是第1个真正意义上的气孔反应
突变体, 为理解气孔调控提供了许多有价值的信息
(Mustilli et al., 2002)。由于植物98%的水分蒸腾是通
过气孔进行的(Merlot et al., 2002), 因此这种筛选方
法应该非常有效, 利用这种方法能够提供许多有关气
孔运动调控的遗传变异材料。
与其它克隆基因的方法相比, TAIL-PCR在获得
已知基因的未知侧翼序列应用中具有以下优点。(1)
方法简便。PCR前既不需要特殊的DNA操作, 反应后
也不需要繁琐的产物鉴定, 只需进行琼脂糖凝胶电泳
刘浩等: 拟南芥干旱相关突变体的远红外筛选及基因克隆 223


图1 干旱胁迫下拟南芥突变体doi1的红外表型重复
(A) 干旱胁迫下突变体doi1与野生型(WT)幼苗的生长状况; (B) 远红外热图显示干旱胁迫下突变体doi1叶片温度低于WT; (C) 干旱
胁迫下突变体doi1的叶片温度比WT约低0.5°C

Figure 1 The phenotype of doi1 mutant of Arabidopsis thaliana under drought stress
(A) Growing state of doi1 and wild type (WT) under drought stress; (B) Thermal picture showed doi1 had lower leaf temperature
than WT under drought stress; (C) Leaf temperature of doi1 was about 0.5°C lower than that of WT under drought stress




图2 拟南芥突变体doi1与野生型(WT)的耐旱性比较

Figure 2 Comparison of drought tolerance between
doi1 mutant and wild type (WT) of Arabidopsis thaliana


即可有效地证明产物的特异性。(2)省时。传统克隆基
因的方法, 如图位克隆, 从杂交到最后的基因定位,
一般需耗费半年以上的时间。TAIL-PCR则需要大概1
天的时间就可以克隆到目的基因。但是TAIL-PCR方
法本身也有缺陷, 例如, 在扩增的过程中, 可能会出
现非特异性条带的扩增。因此, 在本文中, 利用琼脂
糖凝胶电泳分析和RT-PCR方法对其扩增结果进行了
进一步验证, 从而避免了TAIL-PCR可能出现的错误
结果。
我们利用远红外筛选体系得到了突变体doi1, 经
过基因克隆表明该突变基因为NCED3。NCED3被认
为是ABA合成过程中的关键酶。在干旱胁迫下, NCE-
D3基因表达量显著增加, 并且在高盐胁迫下, 突变


图3 拟南芥突变体doi1的TAIL-PCR电泳(A)及NCED3基因在
doi1中无表达的RT-PCR验证(B)

Figure 3 Electrophoresis result (A) of doi1 mutant of
Arabidopsis thaliana by TAIL-PCR and that NCED3 gene was
not expressed in doi1 mutant checked by RT-PCR (B)

体doi1可以正常生长。超表达AtNCED3基因的转基因
拟南芥叶片的蒸腾速率明显降低 , 抗旱能力增强
(Barrero et al., 2006; Hao et al., 2009)。这为我们从
转基因着手, 对植物进行细胞和分子水平的精细调
控, 提高植株的抗逆性提供了很好的理论依据。
致谢 中国科学院遗传与发育生物学研究所植物基
因组学国家重点实验室为本研究提供T-DNA突变体
224 植物学报 45(2) 2010
库 , 特此致谢。
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刘浩等: 拟南芥干旱相关突变体的远红外筛选及基因克隆 225
Use of Infrared Thermal Imaging to Isolate and Gene Cloning of
Drought-related Mutants in Arabidopsis thaliana
Hao Liu1, Pengtao Wang1*, Guoyong An1, Yun Zhou1, Lina Fan2
1Key Laboratory of Plant Stress Biology, College of Life Science, Henan University, Kaifeng 475004, China; 2Guangzhou
Sugarcane Industry Research Institute, Guangzhou 510316, China
Abstract Drought stress is one of the major limitations to plant growth and development. To date, many studies have
focused on network signaling pathways that regulate plant responses to drought. However, many of the principal signaling
components and their interactions remain largely unknown. Guard cells, located in the epidermis of plant leaves, control
both the influx of CO2 and water loss during transpiration, and have become a highly developed system for dissecting
early drought signal-transduction mechanisms in plants. So it has central effects on controlling of water balance or im-
proving drought tolerance to retaining optimal aperture of stomata in plants. Recently, infrared thermal cameras have
been used to monitor the subtle differences in leaf temperature in plants. We used this system to screen a drought-
sensitive mutant, doi1, in Arabidopsis. This mutant showed cooler leaf temperature and faster water loss rate than did the
wild type under drought stress. The mutant gene NCED3 in doi1 was cloned by the TAIL-PCR method, and RT-PCR was
used to confirm the authenticity of the TAIL-PCR result.
Key words Arabidopsis thaliana, drought, infrared thermal camera, TAIL-PCR method
Liu H, Wang PT, An GY, Zhou Y, Fan LN (2010). Use of infrared thermal imaging to isolate and gene cloning of drou-
ght-related mutants in Arabidopsis thaliana. Chin Bull Bot 45, 220–225.

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* Author for correspondence. E-mail: wangpt@henu.edu.cn
(责任编辑: 孙冬花)