全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2015, 50 (3): 378–387, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2015.00378
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收稿日期: 2014-05-13; 接受日期: 2014-08-25
基金项目: 国家自然科学基金(No.31301804)、国家科技支撑计划(No.2012BAD01B0701)、北京市花卉重点项目(No.YLHH201000101,
No.YLHH201400101)和农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目
* 通讯作者。E-mail: mingjun@caas.cn
百合未授粉子房离体培养胚胎形成及植株再生
袁素霞, 李佳, 明军*, 刘春, 徐雷锋, 袁迎迎
中国农业科学院蔬菜花卉研究所, 北京 100081
摘要 未受精子房离体培养是诱导雌核产生单倍体的技术之一。以1个野生种和3个杂种系共7个百合(Lilium)基因型为实验
材料, 探讨了基础培养基、花蕾取样时期和外源激素等因素对百合未授粉子房离体培养胚胎形成的影响。结果表明, CBM、
MS和BDS三种基础培养基均可诱导百合未授粉子房胚胎形成, 但以BDS培养基诱导效果最佳; 开花前1天的花蕾较适于百
合未授粉子房离体培养; 2 mg·L–1 2,4-D + 2 mg·L–1 6-BA和2 mg·L–1 2,4-D + 2 mg·L–1 KT两种外源激素配方均适用于百
合未授粉子房离体培养诱导胚胎形成。在培养过程中, 大多数胚性胚珠中只含有1个胚胎, 位于珠孔端、合子端或极核处, 少
数胚性胚珠中含有双胚胎。通过百合未授粉子房离体培养, 从5个基因型材料中共获得146株再生植株。采用根尖染色体计
数法对其中的62株进行了倍性测定, 其中43株与母体植株染色体倍性不同。
关键词 百合, 未授粉子房培养, 胚胎形成, 再生植株, 倍性
袁素霞, 李佳, 明军, 刘春, 徐雷锋, 袁迎迎 (2015). 百合未授粉子房离体培养胚胎形成及植株再生. 植物学报 50, 378–387.
百合(Lilium)是重要的观赏和食用植物。现代观赏
百合大部分为远缘杂交的后代, 其等位基因杂合, 遗
传背景复杂, 使得许多重要性状, 如花色和抗病虫性
等遗传异常复杂。因而, 在常规杂交育种中, 对重要
育种目标性状的遗传缺乏可预测性, 加之生育周期
(从种子到开花)长达3年以上, 难以高效定向优化聚
合优良遗传基因。而利用单倍体培养技术可以在短时
间内获得等位基因纯合的个体, 这样可简化遗传背
景, 缩短育种年限, 有利于进行重要性状的遗传分
析, 并在杂交育种中提高目标性状遗传的可预测性,
有目的地进行杂交育种, 对提高新品种选育效率具有
重要的作用。同时, 由于隐性性状得以表达, 丰富了
育种资源。获得的单倍体还可应用于基因转化、诱变
和突变体筛选等研究中, 为种质资源创新提供了一种
快捷有效的新途径。此外, 获得的单倍体经过加倍所
建立的双单倍体群体也是进行分子标记、遗传图谱构
建和基因定位等研究的理想材料 (Forster et al.,
2007; Ferrie and Caswell, 2011)。因此, 单倍体培养
技术研究对于加快百合的遗传学基础研究、提高百合
的育种效率和育种水平具有重要意义。
人工诱导产生单倍体的途径包括2大类, 一类是
雄核发育途径, 即花药培养和游离小孢子培养; 另一
类是雌核发育途径。
百合花药培养最早成功于1971年。Sharp等
(1971)在铁炮百合(Lilium longiflorum)上获得了单倍
体植株。其后, 分别在兰州百合(Lilium davidii var.
willmottiae)和亚洲百合(Lilium Asiatic hybrids)等少
数几个基因型上获得了花药愈伤组织 (诱导率为
8.89%–44%)和少量再生植株 (谷祝平和郑国锠 ,
1983; Han et al., 1997; 褚云霞等, 2001; 韩秀丽等,
2010)。但花药培养受花药壁等母体组织的影响, 因
而由愈伤组织分化获得的二倍体再生植株有可能来
源于体细胞。由于存在此缺点, 百合游离小孢子培养
于20世纪80年代已成为研究的热点。到目前为止, 百
合游离小孢子培养尚未获得成功, 仅在铁炮百合和亚
洲百合几个基因型上观察到2个均等核的小孢子、多
核体小孢子或愈伤组织 , 未能获得胚状体(Tanaka
and Ito, 1980, 1981; van de Bulk et al., 1992; Han
et al., 2000; 李佳等, 2012)。
我们发现, 本实验选用的7个百合基因型的小孢
子母细胞减数分裂均存在一定程度的异常率, 有的基
因型在四分体时期的异常率已高达70% (李佳等 ,
2012)。未受精子房或胚珠离体培养是人工诱导雌核
发育形成单倍体和双单倍体的技术之一, 而此技术尤
·技术方法·
袁素霞等: 百合未授粉子房离体培养胚胎形成及植株再生 379

其适用于雄性不育及花粉母细胞减数分裂异常率高
的植物, 以及通过雄核发育难以获得单倍体的植物。
目前, 有关百合未受精子房离体培养研究的报道
甚少。谷祝平和郑国锠(1983)从兰州百合中长1.2–1.8
cm的花蕾为试材进行未授粉子房离体培养, 主要通
过愈伤组织途径获得了单倍体植株。结果表明, MS培
养基的愈伤组织诱导率高于N6培养基 , 当2,4-D和
6-BA均为4 mg·L–1时, MS愈伤组织诱导率最高, 为
47.76%。Prakash和Giles (1986)以1/2 MS培养基为
基础培养基, 并以2.0 cm长的花蕾为试材利用子房切
片培养在东方百合Leraza (Lilium Oriental hybrids)
中通过胚胎途径获得了少量雌核再生植株。Ramsay
等(2003)以铁炮百合Ace (Lilium longiflorum ‘Ace’)长
3–5 cm的花蕾为试材, 采用切片培养通过愈伤组织
途径获得了少量再生植株, 其中35%再生植株的染色
体数变异较大, 为2n=10–25。此研究还表明MS培养
基的愈伤组织诱导率高于B5培养基, 培养基中适合
的蔗糖浓度是5%。赵珺 (2007)以OT品种黄巨人
(Lilium Oriental × Trumpet ‘Yellow Giant’)的单核小
孢子发育时期对应的子房为试材, 采用MS诱导培养
基通过愈伤组织途径获得了较低频率(5.26%)的单倍
体。上述研究结果表明, 百合未授粉子房离体培养仅
在少数几个基因型中获得成功, 尚缺乏性状优良基因
型培养成功的报道; 大多数研究采用MS培养基作为
诱导培养基; 在实验中3种基因型所选用的花蕾长度
不一致; 大多数是通过愈伤组织途径获得再生植株,
其中单倍体频率低。此外, 通过愈伤组织途径获得的
二倍体再生植株, 有可能起源于体细胞。上述研究工
作都缺乏对二倍体起源进行鉴定。
本实验对1个野生种和3个杂种系共7个百合基因
型试材的未授粉子房进行离体培养, 以提高雌核胚胎
的诱导率, 目的是通过胚胎发生途径获得再生植株,
进一步探讨培养基、取样时期和外源激素等因素对雌
核胚胎发育的影响, 并对获得的再生植株进行倍性鉴
定, 为建立成熟的百合未受精子房离体培养技术体系
奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
供试材料分别为东方百合杂种系(Oriental hybrids)品
种Siberia和Sorbonne, LA (Longiflorum × Asiatic)系
列品种Ceb Dazzle (Lilium ‘Ceb Dazzle’), OT (Ori-
ental × Trumpet)系列品种Robina、Concador和
Yellow Ween, 野 生 种 岷 江 百 合 (Lilium regale
Wils.)。上述材料种植在中国农业科学院蔬菜花卉研
究所玻璃温室内。
1.2 实验方法
1.2.1 子房消毒与培养
选取开花前1天的不同基因型百合花蕾, 置于无菌瓶
中, 先用75%乙醇进行表面灭菌30秒, 之后用10%
NaClO消毒10分钟, 无菌水冲洗3次, 每次3分钟。最
后将无菌的花蕾剥去花萼、花瓣, 取出子房, 将其横
切成1–2 mm的切片, 接种于直径为90 mm培养皿中
进行诱导培养。每皿接入1枚子房。置于25°C, 光强
为30–40 µmol·m–2·s–1 , 每天14小时光照。每25天继
代1次。
培养45天后, 记录胚珠膨大数、成胚数, 并观察
子房生长状况。每个处理设置3次重复, 每处理用3枚
子房。

1.2.2 诱导培养基类型
将消毒好的子房切片后分别接种于BDS (Bohanec et
al., 2003)、CBM (Gémes-Juhász et al., 2002)、MS
(Murashige and Skoog, 1962)培养基上进行培养。每
种培养基均附加2 mg·L–1 2,4-D、2 mg·L–1 6-BA、10%
蔗糖、0.6%琼脂, pH 6.0。

1.2.3 取样时期
在上述实验的基础上选取最佳的诱导培养基, 测量开
花前1天的不同基因型材料的花蕾长度, 并以此为基
准, 选取比其短2 cm和4 cm的花蕾及已开放3天的
花, 将其子房进行切片培养。

1.2.4 外源激素配比
在上述实验的基础上, 以Siberia和Sorbonne为试材,
取最佳时期的花蕾进行子房切片, 置于含有4种不同外
源激素浓度配比的最佳基础培养基上进行诱导培养。
4种诱导培养基的激素配比分别为: (1) 2 mg·L–1
2,4-D+2 mg·L–1 6-BA; (2) 4 mg·L–1 2,4-D+4 mg·L–1
6-BA; (3) 2 mg·L–1 2,4-D +2 mg·L–1 KT; (4) 4 mg·L–1
380 植物学报 50(3) 2015

2,4-D+4 mg·L–1 KT。

1.2.5 胚珠透明方法及产胚率统计
选取培养45天的子房, 将膨大的胚珠取下, 用卡诺固
定液固定24小时后再用4%戊二醛固定2小时 , 经
15%、30%、50%、70%、85%、95%梯度乙醇脱水,
每级20分钟, 100%乙醇脱水2次, 每次30分钟。
脱水后, 用无水乙醇和冬青油(1:1, v/v)浸泡1小
时后转入冬青油中分别浸泡6、12、24小时。待胚珠
变透明后置于体式显微镜(Olympus SZ)下观察胚珠
内胚的生长状况。
产胚率计算公式如下:
膨大胚珠数=未授粉子房离体培养中每一枚子房
中膨大的胚珠数;
胚性胚珠数=每一枚子房中含有胚胎的膨大胚珠
数;
胚性胚珠比率 (%)=胚性胚珠数 /膨大胚珠数
×100%。

1.2.6 植株再生
将诱导培养45天、含有膨大胚珠的子房切片转接在最
佳基础培养基(5%蔗糖+0.6%琼脂 , 不含激素 , pH
6.0)上进行植株再生。培养条件同1.2.1节所述。每25
天继代1次。培养80–100天获得再生植株。

1.2.7 再生植株的倍性鉴定
将再生植株转接在生根培养基中培养15–20天, 获得
根系健壮的植株。生根培养基为1/2 MS+0.1 mg·L–1
IBA+0.1 mg·L–1 NAA+60 g·L–1蔗糖+60 g·L–1琼脂, pH
6.0。取其幼嫩根尖进行染色体计数, 进行倍性鉴定。
切取3–8 mm根尖置于0.7 mmol·L–1放线菌酮中,
25°C预处理8–9小时, 然后放入卡诺氏固定液中固定
24小时, 蒸馏水洗净后, 用1 mol·L–1 HCl在60°C水浴
条件下解离10分钟, 再用蒸馏水漂洗2–3次, 然后用
卡宝品红染色制片。在Olympus CX31显微镜下观察
染色体, 选取分散良好的中期分裂细胞进行显微拍
照。每份材料观察30个处于有丝分裂中期的细胞, 统
计染色体数目, 确定染色体的倍性水平。

1.2.8 统计分析
采用Microsoft Excel 2003和SAS 8.1软件进行统计分析。
2 结果与讨论
2.1 培养基类型对百合未授粉子房培养胚胎发生
的影响
实验结果(表1)显示, BDS、CBM和MS三种基础培养
基均可诱导7份供试材料产生胚胎, 但是用不同培养
基诱导的膨大胚珠数及胚性胚珠数均呈显著差异。在
所有供试基因型上, BDS培养基诱导的膨大胚珠数及
胚性胚珠数均最多, 且均显著高于MS培养基; 其中
Sorbonne、Robina、Ceb Dazzle和Lilium regale 4
种基因型在BDS培养基中的膨大胚珠数及胚性胚珠
数也均显著高于CBM培养基。此外, 在CBM和MS培
养基上诱导的胚珠较易出现褐化和玻璃化现象。可见,
BDS培养基较适合于百合供试基因型未授粉子房的
离体培养, 诱导膨大的胚珠中81.9%–95.1%含有胚
胎。在所有供试基因型中, Robina在BDS培养基中的
胚胎诱导率最高, 每花蕾达223.7个。
2.2 取样时期与百合未授粉子房培养胚胎发生的
相关性
将不同基因型和不同发育时期的子房接种于BDS培
养基上, 培养45天后, 发现子房的取样时期与未授粉
子房培养胚珠的发育状况和胚胎形成密切相关。实验
结果表明, 花蕾长度最小的子房其胚珠长势较差, 但
随着花蕾长度的增加, 其胚珠的长势变好。从表2可
知, 不同花蕾长度子房培养的胚胎诱导率差异显著。
在所有供试基因型中, 除Siberia外, 其它基因型均在
开花前1天的子房培养中胚性胚珠比率最高。尤其是
Yellow Ween和Ceb Dazzle两种基因型材料在开花
前1天的子房培养中, 膨大胚珠数和胚性胚珠数均显
著高于其它取样时期。Robina开花前1天的子房, 其
胚性胚珠数也显著高于其它取样时期。在Siberia和
Lilium regale中, 胚性胚珠数与已开花3天的子房差
异不显著, 但均显著高于其它取样时期。其余2个基
因型开花前1天的子房也表现出较高的胚性胚珠数。
综合以上结果, 开花前1天是进行百合未授粉子房离
体培养的最佳取样时期。
2.3 外源激素对百合未授粉子房培养胚胎发生的
影响
以Siberia和Sorbonne为试材, 研究了4种外源激素对
袁素霞等: 百合未授粉子房离体培养胚胎形成及植株再生 381

表1 不同培养基诱导百合未授粉子房的胚胎发生频率
Table 1 Induction of embryogenic ovules via lily gynogenesis in different mediums
Genotype Medium Number of the expand
ovules per bud (means±SD)
Number of ovules with
embryo per bud (means±SD)
Rate of embryogenic
ovules (%)
Siberia BDS 132.7 ± 7.6 a 108.7 ± 5.9 a 81.9
CBM 119.0 ± 16.4 ab 94.0 ± 12.8 ab 79.0
MS 101.3 ± 3.5 b 82.0 ± 3.0 b 80.9
Sorbonne BDS 136.3 ± 24.6 a 116.0 ± 20.8 a 85.1
CBM 88.7 ± 4.7 b 71.7 ± 3.8 b 80.8
MS 82.3 ± 5.7 b 70.0 ± 4.6 b 85.1
Concador BDS 150.0 ± 11.1 a 127.3 ± 9.6 a 84.9
CBM 136.3 ± 13.7 ab 105.0 ± 10.4 ab 77.0
MS 113.0 ± 18.5 b 91.7 ± 14.7 b 81.2
Robina BDS 235.3 ± 6.0 a 223.7 ± 5.5 a 95.1
CBM 147.7 ± 10.4 b 118.3 ± 8.3 c 80.1
MS 182.7 ± 19.4 c 157.0 ± 16.5 Bb 85.9
Yellow Ween BDS 184.3 ± 6.0 a 169.3 ± 6.0 a 91.9
CBM 171.7 ± 5.7 b 152.7 ± 4.7 ab 88.9
MS 161.0 ± 12.1 c 137.0 ± 10.1 b 85.1
Ceb Dazzle BDS 242.3 ± 8.3 a 201.0 ± 7.2 a 83.0
CBM 131.7 ± 8.6 b 92.3 ± 6.1 c 70.1
MS 172.0 ± 12.1 c 137.7 ± 9.6 b 80.0
Lilium regale BDS 175.0 ± 15.5 a 152.0 ± 13.5 a 86.9
CBM 108.3 ± 5.5 b 82.3 ± 4.5 c 76.0
MS 131.0 ± 9.2 c 119.0 ± 8.2 b 90.8
采用邓肯氏多重比较检验; 同一列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
P value of significance was estimated by Duncan’s test; the different lowercase indicated significant difference at P<0.05 level.


未授粉子房离体培养胚胎形成的影响。实验结果(表
3)表明, 在2个百合供试基因型上, 4 mg·L–1 2,4-D+4
mg·L–1 6-BA处理相对于其余3种处理, 诱导出的胚性
胚珠数和胚性胚珠比率均最低。虽然其余3种激素处
理在2个基因型中均表现出不同的胚性胚珠比率, 但
是诱导的膨大胚珠数和胚性胚珠数均差异不显著。从
降低成本的角度考虑, 2 mg·L–1 2,4-D+2 mg·L–1 6-BA
和2 mg·L–1 2,4-D+2 mg·L–1 KT 两个处理均适用于诱
导百合未授粉子房离体培养胚胎形成。
2.4 百合未授粉子房培养过程中胚胎的发育
在培养过程中发现, 子房培养2天后, 胚珠开始膨大。
培养7天时, 胚珠内即可观察到球形胚(图1 A–C)。培
养45天 , 还可以观察到子叶胚(图1D)和棒状胚(图
1E)。一般, 一个胚囊中只形成1个胚状体, 有的位于
珠孔端(图1A), 有的位于合子端(图1C), 还有的处于
极核位置(图1B)。此外, 我们还观察到多胚现象, 大
多为2个胚胎共存, 分别位于珠孔端、极核部位或合
子端(图1 F, G)。综合上述结果, 说明70%以上的膨大
胚珠中含有胚胎(图1H-a), 其余少部分出现无胚胎的
现象(图1 H-b)。
2.5 植株再生及倍性鉴定
通过未授粉子房离体培养, 6个供试基因型获得了再
生植株(图2), 共146株(分别来源于不同的胚珠或愈
伤组织)。其中, Siberia、Sorbonne、Yellow Ween、
Concador、Robina、Lilium regale分别获得7、55、
14、58、9和3株; 而Ceb Dazzle未能获得再生植株。
从Sorbonne和Concador的再生植株中分别选取23
株和39株进行根尖染色体鉴定。结果 (表4)表明 ,
Sorbonne再生植株的群体是由单倍体(26.09%)、二
倍体(43.48%)、四倍体(4.34%)和非整倍体(26.09%)
382 植物学报 50(3) 2015

表2 不同基因型百合的花蕾长度与成胚率的关系
Table 2 Embryo production of different lily flower buds in BDS mediums
Genotype Bud developmental stage Number of the expand
ovules per bud (means±SD)
Number of ovules with
embryo per bud (means±SD)
Rate of embryo-
genic ovules (%)
Siberia 6 cm 97.3 ± 5.1 c 59.7 ± 3.1 c 61.4
8 cm 116.0 ± 8.9 b 92.7 ± 7.4 b 79.9
1 d before anthesis (10 cm) 132.3 ± 7.4 a 108.3 ± 6.4 a 81.9
3 d after anthesis 122.0 ± 6.6 ab 104.0 ± 5.6 ab 85.2
Sorbonne 6 cm 87.7 ± 4.0 b 58.7 ± 3.1 b 66.9
8 cm 110.3 ± 26.0 ab 87.3 ± 20.4 ab 79.1
1 d before anthesis (10 cm) 136.2 ± 24.6 a 116.0 ± 20.8 a 85.2
3 d after anthesis 122.3 ± 14.4 ab 101.3 ± 11.7 a 82.8
Concador 7 cm 152.7 ± 8.1 b 119.0 ± 6.1 a 77.9
9 cm 124.7 ± 13.4 ab 90.0 ± 9.6 b 72.2
1 d before anthesis (11 cm) 148.0 ± 11.5 a 126.0 ± 9.5 a 85.1
3 d after anthesis 132.3 ± 11.7 a 110.0 ± 9.6 a 83.1
Robina 7 cm 164.3 ± 7.1 b 125.0 ± 5.6 d 76.1
9 cm 225.0 ± 8.7 a 189.0 ± 7.0 b 84.0
1 d before anthesis (11 cm) 234.3 ± 10.1 a 223.0 ± 9.5 a 95.2
3 d after anthesis 179.0 ± 19.2 b 161.0 ± 17.4 c 89.9
Yellow Ween 6 cm 115.0 ± 4.6 c 91.0 ± 3.6 c 79.1
8 cm 152.0 ± 5.0 b 126.0 ± 4.0 b 82.9
1 d before anthesis (10 cm) 213.7 ± 12.1 a 196.7 ± 11.1 a 92.0
3 d after anthesis 97.7 ± 4.7 d 87.0 ± 4.4 d 89.0
Ceb Dazzle 5 cm 104.0 ± 11.0 c 77.0 ± 8.0 c 74.0
7 cm 125.3 ± 7.5 bc 99.0 ± 6.0 bc 79.0
1 d before anthesis (9 cm) 242.0 ± 19.5 a 201.0 ± 16.5 a 83.1
3 d after anthesis 148.7 ± 20.2 b 122.0 ± 16.7 b 82.0
Lilium regale 6 cm 164.0 ± 9.0 b 128.0 ± 7.0 b 78.0
8 cm 166.7 ± 8.7 b 135.0 ± 7.2 b 81.0
1 d before anthesis (10 cm) 169.7 ± 18.8 b 148.0 ± 16.5 ab 87.2
3 d after anthesis 236.3 ± 28.9 a 168.0 ± 20.8 a 71.1
采用邓肯氏多重比较检验; 同一列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
P value of significance was estimated by Duncan’s test; the different lowercase indicated significant difference at P<0.05 level.


表3 不同激素配比对百合成胚率的影响
Table 3 Effect of hormone concentration and proportion on the embryo induction in lily
Genotype Treatment Number of the expand
ovules per bud (means±SD)
Number of ovules with
embryo per bud (means±SD)
Rate of embryogenic
ovules (%)
Siberia 2 mg·L–1 2,4-D + 2 mg·L–1 6-BA 164.7 ± 13.2 ab 133.3 ± 10.7 ab 80.9
4 mg·L–1 2,4-D + 4 mg·L–1 6-BA 143.7 ± 8.02 b 112.3 ± 6.5 b 78.1
2 mg·L–1 2,4-D + 2 mg·L–1 KT 175.3 ± 12.7 a 143.7 ± 10.6 a 82.0
4 mg·L–1 2,4-D + 4 mg·L–1 KT 158.0 ± 10.5 ab 131.0 ± 8.5 ab 82.9
Sorbonne 2 mg·L–1 2,4-D + 2 mg·L–1 6-BA 135.3 ± 9.5 a 104.3 ± 6.8 ab 77.1
4 mg·L–1 2,4-D + 4 mg·L–1 6-BA 129.0 ± 13.0 a 98.0 ± 10.0 b 76.0
2 mg·L–1 2,4-D + 2 mg·L–1 KT 141.0 ± 12.0 a 114.3 ± 9.5 a 81.1
4 mg·L–1 2,4-D + 4 mg·L–1 KT 131.3 ± 5.5 a 105.3 ± 4.5 ab 80.2
采用邓肯氏多重比较检验; 同一列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
P value of significance was estimated by Duncan’s test; the different lowercase indicated significant difference at P<0.05 level.

袁素霞等: 百合未授粉子房离体培养胚胎形成及植株再生 383



图1 百合未授粉子房培养胚珠内胚胎的发育
(A) 球形胚(位于珠孔端); (B) 球形胚(位于极核处); (C) 球形胚(位于合子端); (D) 子叶胚; (E) 棒状胚; (F) 双胚胎胚珠(分别位于珠
孔端和极核处); (G) 双胚胎胚珠(分别位于珠孔端和合子端); (H) 含胚胎胚珠(a)和无胚胎胚珠(b)

Figure 1 Gynogenic embryogenesis in lily
(A) Globular embryo on micropylar end; (B) Globular embryo on polar nucleus position; (C) Globular embryo on zygote end; (D)
Cotyledonary embryo; (E) Clavate embryo; (F) Ovule with two embryos (on micropylar end and polar nucleus position, respec-
tively); (G) Ovule with two embryos (on micropylar end and zygote end, respectively); (H) Embryogenic ovule (a) and ovule
without embryo (b)


植株组成(图3), 其中56.52%的再生植株倍性与供体
植株不同。Concador再生植株是由单倍体(10.25%)、
二倍体 (35.90%) 、三倍体 (23.08%) 和非整倍体
(30.77%)植株组成(图3), 其中76.92%的再生植株倍
性与供体植株不同。此外, 我们发现, Sorbonne的非
整倍体再生植株染色体数目变异范围为2n=10–19;
而Concador的非整倍体再生植株染色体数目变异范
围较大, 为2n=6–32。
2.6 讨论
培养基是未授粉子房离体培养诱导胚胎形成的重要
影响因素之一。谷祝平和郑国锠(1983)在兰州百合未
授粉子房培养中发现, MS培养基的愈伤组织诱导率
高于N6培养基。Prakash和Giles (1986)以1/2 MS为
基础培养基, 诱导出了少量单倍体植株。在铁炮百合
Ace上, Ramsay等(2003)实验证明MS培养基优于B5
培养基。目前, 未授粉子房培养常用的基础培养基类
型主要有MS (玉米 (Zea mays)、南瓜 (Cucurbita
pepo)、甜菜(Beta vulgaris)等)、BDS (洋葱(Allium
cepa))、N6 (向日葵 (Helianthus annuus)、大麦
(Hordeum vulgare)、水稻(Oryza sativa)等)和CBM
(黄瓜(Cucumis sativus))4种(Bohanec, 2009)。本研
究是在前人研究的基础上 , 探讨3种基础培养基
(BDS、CBM和MS)对百合未授粉子房离体培养胚胎
形成的影响, 虽然3种培养基均可诱导百合胚珠产生
胚胎, 但综合考虑诱导的膨大胚珠数、胚性胚珠数以
及胚性胚珠比率, 认为BDS培养基优于CBM和MS。
通过比较这3种培养基的成分发现, MS培养基中含有
较高浓度的铵态氮、硝态氮和钙离子。进而, BDS培
养基中除特有的脯氨酸外, 还含有较高浓度的肌醇。
由此推断, 高氮和高钙浓度可能不利于百合未受精胚
珠培养和雌核单倍体胚胎诱导, 肌醇和脯氨酸可能在
一定程度上促进了百合雌核单倍体胚胎的诱导。
作为培养基的添加成分之一, 外源激素也是诱
导雌核胚胎形成的关键因子。在基础培养基中单独添
加适当浓度的2,4-D、TDZ, 或者与6-BA和KT组合均
能有效地促进未受精子房离体培养胚胎发生或愈伤
组织形成(Bohanec, 2009)。在兰州百合未授粉子房
培养中, 外源激素能有效促进愈伤组织的诱导, 当
2,4-D和6-BA的浓度均为4 mg·L–1时, 愈伤组织诱导
率最高(谷祝平和郑国锠, 1983)。Muren (1989)的研
究表明, 2 mg·L–1 2,4-D+2 mg·L–1 6-BA对洋葱雌核胚
384 植物学报 50(3) 2015



图2 百合未授粉子房离体培养雌核胚胎萌发及植株再生
(A–C) 萌发胚; (D) 再生植株

Figure 2 Stages of embryo germination and plant regeneration in lily unpollinated ovaries culture
(A–C) Germinant embryo; (D) Regenerant plantlet


表4 不同基因型百合的小孢子再生植株群体倍性水平
Table 4 Chromosome ploidy level of population derived from microspores in Sorbonne and Concador
Genotype Number of population plants Haploid Diploid Triploid Tetraploid Aneuploid
Sorbonne (2n=2x=24) 23 6 10 0 1 6
Concador (2n=3x=36) 39 4 14 9 0 12




图3 百合未授粉子房离体培养再生植株的倍性

Figure 3 Ploidy of regenerants obtained from unpolinationed ovule culture in lily


胎的诱导最有效, 这个激素配比一直被沿用至今。本
研究结果表明, 2 mg·L–1 2,4-D+2 mg·L–1 6-BA在2个
供试基因型上诱导的膨大胚珠数和胚性胚珠数与2
mg·L–1 2,4-D+2 mg·L–1 KT 和 4 mg·L–1 2,4-D+4
mg·L–1 KT处理组差异不显著, 但显著高于4 mg·L–1
2,4-D+4 mg·L–1 6-BA处理组。这与谷祝平和郑国锠
(1983)的实验结果不一致, 其原因可能与所选用的供
试基因型有关。
子房发育时期也会影响未受精子房的离体培养
效果。花蕾长度不同及大孢子母细胞所处的发育阶段
不同均会导致胚胎诱导率的差异。在向日葵中, 开花
前2–3天胚囊发育成熟的小花适于培养(Yang et al.,
1986)。在甜菜中也得出了类似的结果, 即开花前1–3
天所有收集的含有成熟胚囊的花蕾最适合培养
(Ferrant and Bouharmont, 1994)。开花前1天所收集
的子房最适于印度油菊(Guizotia abyssinica)的培养
(Bhat and Murthy, 2007)。而胚囊处于单核至四核期
的花蕾最适于水稻未受精子房的培养(Zhou et al.,
袁素霞等: 百合未授粉子房离体培养胚胎形成及植株再生 385

1986)。在洋葱中存在类似的现象, 胚囊发育分别处
于早期(包括大孢子母细胞阶段)、中期(2–4核期胚
囊)、晚期(成熟胚囊)的小花, 在培养中其胚诱导能力
逐渐下降(Musial et al., 2005)。在本研究所有供试基
因型中, 我们发现用4种不同长度的花蕾进行子房培
养均能诱导胚胎产生, 但开花前1天的花蕾最适于未
授粉子房培养。可见, 在未受精子房或胚珠离体培养
中, 最佳的外植体发育时期因物种而异。
胚囊是具有单倍体的卵细胞, 但从理论上讲, 其
它细胞(如助细胞、反足细胞、极核)也具备发育成单
倍体胚的能力。大量的研究结果表明, 多数胚起源于
卵细胞, 如甜菜(Ferrant and Bouharmont, 1994)、洋
葱(Musial et al., 2001, 2005)、向日葵(Gelebart et
al., 1987) 、大麦 (Huang et al., 1982) 和烟草
(Nicotiana tabacum) (Wu and Chen, 1982)等。部分
原胚来源于助细胞和反足细胞, 如大麦(San Noeum,
1979)和水稻(Zhou et al., 1986)。通过整体透明技术
对百合雌核胚胎进行了初步观察, 我们发现大部分胚
囊内通常只含有1个胚胎, 有的位于珠孔端, 有的位
于合子端, 还有的位于极核处。此外, 我们在个别胚
囊中发现了2个胚胎同时存在的现象。由此推测, 百
合雌核胚胎的起源具多样性, 其胚胎发生机理有待进
一步研究。
本实验采用根尖染色体计数法对百合未授粉子
房培养的再生植株进行了倍性分析, 在62株再生植
株中, 有43株(69.35%)与母体植株的染色体倍性不
同, 分别为单倍体、非整倍体、二倍体或四倍体。四
倍体可能与雌核单倍体胚胎发育中发生了自然加倍
有关。在铁炮百合Ace未授粉子房培养中, Ramsay等
(2003)发现35%的再生植株的染色体数目变异较大,
从2n=10–25, 其余均与母体植株倍性相同(2n=2x=
24)。赵珺(2007)在黄巨人未授粉子房培养中也获得
了少量的非整倍体, 同时发现只有15.79%的再生植
株与母体植株倍性不同。本研究中, 我们也获得了一
定频率的非整倍体。值得一提的是, 我们获得了较高
频率的与母体植株染色体倍性不同的再生植株。目前,
所选用的试材均为现代观赏百合品种, 具有高度的杂
合性, 而且本研究的部分供试材料为种间杂交的三倍
体品系(李克虎等, 2011), 小孢子母细胞减数分裂存
在一定程度的异常(李佳等, 2012)。从而推测, 其大孢
子母细胞减数分裂可能也存在一定的异常率, 这也许
是导致未授粉子房培养中获得了一些非整倍体再生
植株的主要原因。对于本实验中所获得的与母体染色
体倍性相同的植株还有待于进行分子和形态学鉴定。
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袁素霞等: 百合未授粉子房离体培养胚胎形成及植株再生 387

Embryogenesis and Plant Regeneration from Unpollinated Ovary
Culture of Lily
Suxia Yuan, Jia Li, Jun Ming*, Chun Liu, Leifeng Xu, Yingying Yuan
Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract Unfertilized ovary or ovule culture is an effective technology for producing homozygous materials (doubled
haploids) via gynogenesis. We studied the effects of basal medium and bud developmental stage on the genogenesis in
seven lily genotypes, including one wild species and six cultivars. Gynogenesis occurred in all genotypes, but BDS was
the optimal basal medium as compared with CBM and MS. When ovary sections from buds collected 1 d before anthesis
were cultured in BDS medium, more embryogenic ovules or responding ovules were obtained. To estimate the effect of
phytohormones on lily gynogenic embryogenesis, two genotypes were tested. An amount of 2 mg·L–1 2,4-dichloro-
phenoxyacetic acid (2,4-D) and 2 mg·L–1 6-benzylaminopurine (6-BA) or kinetin (KT) was suitable for embryo induction
from unfertilized ovaries. During culture, embryo development was observed by the cleaning-squash technique; most
ovules contained one embryo, which lay on the micropylar end, zygote end or polar nucleus position. In addition, a few
ovules with two embryos were observed. In total, 146 regenerants were obtained from unpollinated ovary culture of five
genotypes; for 62, the ploidy level was determined by chromosome counting. We found that 43 plantlets had a chromo-
some number different from maternal plants.
Key words Lilium, unpollinated ovary culture, embryogenesis, regenerant, ploidy
Yuan SX, Li J, Ming J, Liu C, Xu LF, Yuan YY (2015). Embryogenesis and plant regeneration from unpollinated ovary
culture of Lily. Chin Bull Bot 50, 378–387.
———————————————
* Author for correspondence. E-mail: mingjun@caas.cn
(责任编辑: 白羽红)