全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2016, 51 (2): 184–193, www.chinbullbotany.com
doi: 10.11983/CBB15080
——————————————————
收稿日期: 2015-05-18; 接受日期: 2015-12-13
基金项目: 国家自然科学基金(No.31371426, No.31570263)
*通讯作者。E-mail: angy@henu.edu.cn
拟南芥SPL1基因参与调节低磷条件下的根际酸化反应
雷凯健1, 2 , 任晶1 , 朱园园1 , 安国勇1*
1河南大学生命科学学院, 棉花生物学国家重点实验室, 开封 475004; 2河南大学药学院, 开封 475004
摘要 根际酸化是植物适应低磷胁迫的重要策略, 但植物是如何感知和转导低磷信号, 进而促进根际酸化的分子机制至今
还不十分清楚。利用pH指示剂(溴甲酚紫)显色法从拟南芥(Arabidopsis thaliana) T-DNA插入突变体库中分离得到了1株低
磷诱导根际酸化缺失突变体spl1。在含溴甲酚紫的低磷培养基上培养8小时, 野生型拟南芥根际培养基的颜色变为黄色, 而
突变体spl1根际培养基的颜色没有明显变化, 表明spl1的低磷根际酸化反应能力降低。当低磷胁迫处理延长20天, spl1叶片
的花青素积累明显高于野生型。同时也出现, 即使在磷营养正常条件下, spl1突变体也表现出根毛数量与长度增加的特征。
进一步的研究表明, 在低磷条件下, spl1突变体根部的磷含量略高于野生型, 与磷转运相关基因的表达量明显高于野生型。
分子遗传学分析结果表明, SPL1基因受低磷胁迫诱导, 主要在拟南芥的叶片和花等组织中表达, 其编码的蛋白广泛分布在
细胞的各个部位。以上结果表明, SPL1参与介导低磷诱导的拟南芥根际酸化反应, 调节多种低磷胁迫反应及低磷条件下磷
饥饿诱导基因的表达。
关键词 拟南芥, 根际酸化, spl1, 低磷
雷凯健, 任晶, 朱园园, 安国勇 (2016). 拟南芥SPL1基因参与调节低磷条件下的根际酸化反应. 植物学报 51, 184–193.
磷是植物生长、发育及繁殖所必需的大量营养元
素之一, 它不仅是植物体内ATP、核酸和磷脂等生物
分子的重要组分之一, 还在许多酶促反应、信号转导
以及代谢通路中起着重要作用。土壤中的磷素大多以
难溶性磷或有机磷的形式存在, 因此, 土壤中可供植
物直接吸收利用的正磷酸盐含量很低(Vance et al.,
2003; Cordell et al., 2009)。高等植物进化出许多策
略以适应低磷胁迫。例如: 增加植物的侧根及根毛的
密度, 增加根冠比; 根部分泌酸性磷酸酶、核酸酶及
有机酸等, 将土壤中难溶性磷转换为可溶性磷; 以及
激活包括磷转运蛋白在内的多种磷饥饿响应基因
(Rausch et al., 2002; Ticconi and Abel, 2004; Su et
al., 2015)。因此, 生理生化和形态学的变化是植物实
现土壤磷高效利用的基本方式。
根际酸化可以活化根际土壤的磷营养, 提高土壤
磷素的利用效率, 是许多植物应对低磷胁迫最常见的
策略之一。低磷条件下, 白羽扇豆(Lupinus albus)长
出所谓的“排根”来增强根部有机酸和H+的分泌, 促
进根际土壤酸化和土壤磷素的活化(Li et al., 1997;
Watt and Evans, 1999)。甜菜(Beta vulgaris)的根系在
缺磷条件下分泌水杨酸和柠檬酸来溶解土壤中的磷
(Khorassani et al., 2011)。油菜(Brassica campes-
tris)和玉米(Zea mays)磷高效基因型通过分泌较多的
酸性磷酸酶, 水解转化根际土壤中的有机磷, 从而获
得更多的磷(Zhang et al., 2010)。但植物是如何感知
和转导低磷信号、调节有机酸和质子分泌、促进根际
酸化, 并进一步提高磷的吸收利用效率, 其分子机制
仍不甚清楚。
前期的研究显示, 低磷诱导拟南芥(Arabidopsis
thaliana)根际发生酸化时, 根际pH值降至5.5以下以
促进植物高效吸收磷, 而作为酸碱指示剂的溴甲酚紫
的颜色在pH5.2−6.8之间由黄色变为紫色, 所以根际
发生酸化的过程可以由溴甲酚紫的颜色变化直观地
显现出来。本研究根据含溴甲酚紫培养基的颜色变化,
建立了拟南芥根际酸化缺失突变体的筛选体系(Lei et
al., 2015), 并从T-DNA突变体库中筛选到1株低磷条
件下根际酸化缺失的突变体。利用Tail-PCR技术克隆
该突变基因 , 发现该基因是 SPL (SQUAMOSA
PROMOTER BIND- ING PROTEIN-LIKE) 家族成员
的SPL1基因。通过对筛选得到的突变体spl1进行低磷
·研究报告·
雷凯健等: 拟南芥SPL1基因参与调节低磷条件下的根际酸化反应 185

条件下的生理功能鉴定和基因功能分析, 发现SPL1
参与了低磷响应的许多过程, 为深入解析磷的吸收利
用调控机制和高效吸收磷品系的创制提供了重要的
研究材料。
1 材料与方法
1.1 植物材料及培养条件
将拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)干燥种子经0.1%
升汞表面消毒5分钟, 无菌水冲洗6−8次, 点播于MS
固体培养基(MS盐+3%蔗糖+0.6%琼脂, pH5.8)上,
于4°C条件下春化3天, 放于培养间(光暗周期为16小
时光照/8小时黑暗, 温度为18−22°C, 光照强度为90−
120 mmol·m−2·s−1, 相对湿度为80%)培养1−2周后供
实验用。
1.2 根际酸化缺失突变体的筛选
利用张健等(2005)构建的拟南芥T-DNA插入突变库
(左建儒研究员惠赠)进行突变体的筛选。将生长在
0.6% (w/v)琼脂的MS固体培养基上10天的突变库拟
南芥幼苗转移至含0.75% (w/v)琼脂、0.006% (w/v)
溴甲酚紫、pH5.8的低磷培养基(LP; H2PO4−的含量为
12.5 μmol·L−1)上培养8−24小时。以根际颜色变黄的
野生型幼苗为对照, 挑选根际指示剂颜色没有发生变
化的幼苗作为潜在的突变体(Lei et al., 2015)。
1.3 根际酸化能力的定量测量
根际酸化能力测定参照Santi等(2009)的方法并作修
改。将正常MS营养液或低磷营养液 (0.5%蔗糖 ,
0.006%溴甲酚紫, pH5.8)各300 μL加入至96孔酶标
板中。取10天苗龄的突变体幼苗, 将幼苗的根全部浸
入到酶标板中的营养液内, 酶标板的每个孔加入3棵
苗作为1个处理样本。每个处理设置3个平行。移苗完
毕后把幼苗用透明塑料罩子遮住, 放入培养室继续光
照培养2小时。然后每孔取出100 μL营养液置于另一
酶标板中(取溶液时先用移液器轻轻吹打1−2次, 使其
浓度均匀), 使用Thermo Scientific的全波长酶标仪
(Multiscan Go)在590 nm处测定溶液的吸光值。在没
有结合质子的状态下, 溴甲酚紫在590 nm处有最大
吸收峰。随着溶液pH值的降低, 质子浓度增大, 没有
结合质子的溴甲酚紫减少, 导致其吸光值降低。由于
吸光值的大小与溶液的pH值成反比, 可根据吸光值
推断出溶液相对pH值变化。
1.4 花青素含量测定
花青素含量测定参照Kim等(2003)的方法并略作修
改。称取0.01 g叶片置于300 μL花青素提取液中(1%
HCl-甲醇混合液), 4°C过夜孵育。然后加入200 μL去
离子水、200 μL三氯甲烷, 于14 000 ×g离心10分钟,
吸取上层水相, 测定吸光值。
花青素相对含量=A530−0.33A657
1.5 无机磷含量测定
无机磷含量的测定参照Ames (1966)的方法并略作修
改。称取0.01 g新鲜材料(叶片或根部)置于1.5 mL
Eppendorf管中, 加入50 μL去离子水, 用研磨棒研磨
充分后加水至125 μL, 3 000 ×g离心4分钟。吸取10
μL上清液加至96孔酶标板, 再加入15 μL去离子水,
100 μL 1 mol·L−1 HCl, 100 μL显色试剂(4.2%钼酸
铵:0.2%孔雀绿=1:3, v/v), 在酶标仪上低速、连续振
荡5秒, 混匀反应液。室温孵育15分钟后, 加入100 μL
1.5%吐温-20, 振荡混匀。室温孵育15分钟后, 于660
nm处测吸光值。由磷含量校准曲线计算出磷浓度。
1.6 半定量PCR及实时荧光定量PCR
称取0.2 g10天苗龄的幼苗, 用Trizol方法提取总RNA
(Sternberg and Mandels, 1979)。用逆转录试剂盒
(Promega)合成第1条cDNA链作为模板, 进行PCR反
应。
利用Agilent Stratagene荧光定量PCR仪 (Mx-
3005P)进行实时荧光定量PCR实验, 荧光染料试剂
盒采用SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa)。每20 μL
PCR反应体系中含1×SYBR Premix Ex Taq, 上下游
引物各0.2 μmol·L−1, 以及100 ng cDNA模板。以
2−ΔΔCt表示目的基因的相对表达量。实验重复3次, 设3
个平行。以Actin2作为内参基因对目标基因进行相对
定量。
1.7 GUS组织化学染色
用正向引物5-CCGGAATTCACGACCAGATTGCC-
ACATCGT-3 (含酶切位点EcoRI)和反向引物5-TG-
GCTGCAGCACTCGATCCAATTCAACAACAG-3
186 植物学报 51(2) 2016

(含酶切位点PstI)从拟南芥基因组中扩增SPL1的启
动子序列, 并克隆到载体pCAMBIA1381上。通过农
杆菌介导转化拟南芥, 参考Jefferson等(1987)的方
法, 将转基因植物幼苗进行GUS染色, 用乙醇脱色并
拍照。
1.8 植物原生质体瞬时转化
利用PCR方法扩增得到SPL1基因的全长cDNA片段,
用于构建pHBT-GFP融合蛋白载体。所用引物如下:
正向引物5′-ATAGTCGACATGGAAGCTAGAATTG-
ATGAAGG-3′ (SalI); 反向引物5′-TATGGATCCGC-
TTGTTCCATAGTCCAATAACT-3′ (BamHI)。参照文
献(Gomes-Junior et al., 2006)所述方法, 通过PEG
介导的方法将SPL1-pHBT-GFP载体转化拟南芥叶肉
细胞原生质体。使用Olympus激光共聚焦显微镜
(laser scanning confocal microscope, LSCM, FV-
1000)观察GFP荧光。
2 结果与讨论
2.1 根际酸化缺失突变体spl1的筛选
将T-DNA插入突变库的种子按照1.2节所述方法点种
于含0.6%琼脂的MS培养基上, 经4°C春化3天后放于
培养室中培养。约10天后, 将幼苗移植到含溴甲酚紫
指示剂的低磷培养基上, 根据根部培养基颜色的差异
筛选根际酸化相关的突变体。其中, spl1-1是筛选得到
的一株根际酸化缺失拟南芥突变体。与野生型拟南芥相
比, 低磷处理前后突变体spl1-1根部培养基的颜色没有
明显变化, 表明低磷诱导其根部酸化缺失。通过对自交
繁殖得到的T3和T4代植株检测表明, 在低磷诱导下,
突变体spl1-1根际酸化缺失性状能够稳定遗传。
2.2 突变体spl1突变位点的鉴定
通过Tail-PCR和对PCR产物的序列分析表明, spl1-1
突变体是由于T-DNA插入到拟南芥SPL1基因(AT2G-


图1 拟南芥spl1突变体的鉴定及根际酸化缺失表型分析
(A) spl1-1和spl1-2的T-DNA插入位点示意图; (B) RT-PCR分析SPL1的表达; (C) 溴甲酚紫显色法分析WT和spl1在MS及低磷(LP)
培养基上(12.5 μmol·L−1 H2PO4−)的根际酸化反应(Bar=1 cm); (D) WT和spl1的酸化定量。*表示与野生型相比差异显著(P<0.05)。

Figure 1 Arabidopsis thaliana spl1 mutants show the phenotype of rhizosphere acidification deficiency and decreased acidi-
fication capacity
(A) T-DNA insertion sites in spl1-1 and spl1-2; (B) Reverse transcriptase-PCR analysis of SPL1 expression; (C) The rhizosphere
acidification reaction of WT and spl1 mutants under MS and low phosphate (LP) conditions (12.5 μmo·L−1 H2PO4−) (Bar=1 cm);
(D) The acidification capacity of WT and spl1 mutants. Asterisk represent statistically differences compared with the wild type
(P<0.05).
雷凯健等: 拟南芥SPL1基因参与调节低磷条件下的根际酸化反应 187




图2 低磷条件下拟南芥突变体spl1-1和spl1-2花青素的积累
(A) 在正常和低磷条件下, WT、spl1-1和spl1-2的叶片表型特征; (B) 低磷处理20天, 野生型(WT)、spl1-1和spl1-2的花青素含量变
化。*表示与野生型相比差异显著(P<0.05)。

Figure 2 The anthocyanin accumulation in Arabidopsis thaliana spl1-1 and spl1-2 under low Pi condition
(A) The anthocyanin accumulation in wild type (WT), spl1-1, and spl1-2 plants during Pi sufficient and Pi deprivation; (B) An-
thocyanin content was determined in WT and spl1 plants grown with normal and low Pi (LP) on the twentieth day of Pi starvation.
Asterisk represents statistically differences compared with the wild type (P<0.05).


图3 不同条件下拟南芥突变体spl1的无机磷含量变化
生长7天的拟南芥幼苗移植到MS或低磷(LP)培养基上处理14天,
然后测定无机磷含量。*表示与野生型相比差异显著(P<0.05)。

Figure 3 The Pi content analysis of Arabidopsis thaliana
spl1 mutants
Seven-day-old seedlings were transferred to MS or low Pi
(LP) medium for 14 d and then harvested for Pi content analy-
sis. Asterisk represents statistically differences compared
with the wild type (P<0.05).

47070)的5′-UTR区产生的(图1A)。为保证筛选到突变
体的表型确实是由该基因突变引起的, 我们从Salk研
究所订购了SPL1的T-DNA插入突变体, 命名为spl1-2。
半定量PCR检测结果表明, SPL1基因在突变体spl1-1
和spl1-2中表达量均显著下降(图1B), 表明spl1-1和
spl1-2两个突变体是SPL1功能缺失或减弱的突变体。
根际酸化实验结果显示, 突变体spl1-1和spl1-2都具
有低磷诱导的根际酸化缺失表型, 表明该表型确实由
SPL1基因突变所引起(图1C)。采用酸化能力相对定
量测定的方法表明: 低磷处理可使野生型(WT)根际
营养液在590 nm处的吸光值下降, 表明根部质子净
流出量增加(图1D); 而突变体spl1-1和spl1-2根际营
养液的吸光值均明显高于WT, 表明其酸化能力显著
低于WT。
2.3 spl1突变体低磷反应特性分析
2.3.1 花青素含量分析
为了分析低磷条件下突变体的各种生理表型, 我们将
突变体spl1-1和spl1-2种植在正常培养基和低磷培养
基上。20天后观察结果显示, 在正常的MS培养基上,
突变体spl1-1和spl1-2与WT植株的生长状态均良好,
长势一致; 而在低磷培养基上突变体spl1-1和spl1-2
的叶片比WT积累更多花青素, 表现更为明显的低磷
188 植物学报 51(2) 2016

症状(图2A)。WT及突变体spl1-1和spl1-2的花青素含
量测定结果也显示, 突变体spl1-1和spl1-2在低磷条
件下的花青素含量分别比WT升高了1.98倍及1.83倍
(图2B)。花青素积累是植物响应低磷胁迫的重要缺素
特征, 低磷诱导引起突变体spl1-1和spl1-2花青素积
累的实验结果表明 , spl1是低磷敏感的拟南芥突
变体。

2.3.2 无机磷含量分析
为了进一步分析突变体spl1参与的低磷响应特征, 分
别测定了不同条件下突变体的叶片和根组织的磷含
量。结果表明, 在正常条件下, spl1-1和spl1-2植株的
叶片及根部的磷含量与WT相比无显著差别; 而在低
磷条件下, spl1-1和spl1-2植株的根部磷含量略高于
WT(图3)。这些结果表明, 突变体spl1不仅参与根际
酸化过程, 而且也与植物体内的磷平衡相关。

2.3.3 根毛表型分析
根部形态的改变是拟南芥适应低磷的一种重要策略
(López-Bucio et al., 2003)。将生长5天的spl1-1、
spl1-2和WT的幼苗移植到MS及低磷培养基上, 2天
后观察根毛特征。结果显示, 在低磷培养基上, 突变
体spl1-1及spl1-2的根毛数量及根毛长度与WT相比
没有显著差别, 都表现出类似根毛增多的低磷反应特
征; 而在MS培养基上, 突变体spl1-1及spl1-2的根毛
数量及根毛长度都较WT有明显的增加(图4A–C)。这
些结果表明, 正常营养条件下, SPL1功能缺失可使拟
南芥植株表现出根毛数量增多和根毛长度增加的低


图4 SPL1突变对根毛形态特征的影响
(A) 不同磷营养条件下, WT、spl1-1和spl1-2的根毛表型特征(Bar=1 mm); (B), (C) 在MS及低磷(LP)条件下的根毛数目(B)及根毛长
度(C)统计结果(P<0.05)。*表示与对照相比差异显著。

Figure 4 SPL1 alters root hair architecture
(A) Images of root tips with intact root hair from WT, spl1-1 and spl1-2 plants (Bar=1 mm); (B), (C) Number of root hair (B) and root
hair length (C) under MS and low Pi (LP) condition. *Data significantly different from the corresponding controls are indicated
(P<0.05).
雷凯健等: 拟南芥SPL1基因参与调节低磷条件下的根际酸化反应 189

磷胁迫反应特征。
2.4 低磷处理对SPL1基因表达的影响
为了验证SPL1在转录水平上是否受低磷胁迫影响,
利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)方法检测在低磷
条件下野生型拟南芥中SPL1的表达情况。结果表明,
低磷处理3小时, SPL1的表达量明显上升, 在6小时
表达量最高(是最初的3.22倍), 12小时表达量有所下
降, 在24至72小时均呈逐渐上升的趋势(图5A)。以上
结果表明, SPL1的表达受低磷诱导。
为了进一步阐明spl1突变体参与低磷胁迫的分
子机制, 我们将生长7天的WT及spl1-1和spl1-2突变
体植株转移至MS及低磷培养基上, 处理7天后分别
提取其总RNA, 通过qRT-PCR方法检测磷充足及磷
缺乏条件下WT、spl1-1和spl1-2突变体的磷饥饿响应
基因的表达情况。检测的基因包括低磷胁迫响应
Mt4/TPS1家族成员的AT4和IPS1基因(Shin et al.,
2006; Franco-Zorrilla et al., 2007)、参与半乳糖脂合
成途径并释放体内无机磷的磷脂酶D家族PLDZ2基
因(Cruz-Ramirez et al., 2006)、高亲和磷转运蛋白家
族Pht1;7、Pht1;8和Pht1;9基因(Lapis-Gaza et al.,
2014) 及调控磷平衡的 miR399f 基因 (Lin et al.,
2008)。结果表明, 在spl1-1和spl1-2突变体中, 低磷
胁迫可使这7个磷饥饿诱导基因的表达量均比WT显
著增加(图5B)。
2.5 SPL1的组织表达模式及亚细胞定位
为了深入探讨SPL1在植物响应低磷胁迫中的作用,
我们利用SPL1::GUS转基因植株, 通过GUS组织化
学染色法, 分析了SPL1组织表达特性。结果表明,
SPL1在整个植株的多个组织中均有表达, 其中在叶
脉和根部的维管束部位表达量最高(图6A)。进一步采
用qRT-PCR方法分析SPL1在叶、花、根和茎等不同
组织的表达情况。结果表明, SPL1在叶和花中的表达
相对较强, 而在根和茎中的表达相对较弱(图6B)。因
此, SPL1的表达特性暗示该基因可能参与调节低磷
胁迫反应中磷的分配和运输。
为了进一步分析SPL1蛋白的亚细胞定位, 我们
构建了GFP::SPL1瞬时表达载体, 并通过原生质体
瞬时表达和荧光观察方法, 分析SPL1亚细胞的分布
情况。如图7所示, SPL1在整个细胞质中均有分布。


图5 低磷对SPL1基因表达的影响(A)及磷饥饿诱导基因在拟
南芥spl1突变体中的表达(B)

Figure 5 Expression analyses of the SPL1 gene (A) in
Arabidopsis seedlings in response to low phosphate (LP)
stress and expression pattern of Pi starvation induced genes
in spl1 mutants (B)


根据拟南芥网站 (www.arabidopsis.org)预测 ,
SPL1作为SPL转录因子家族的成员可能在细胞核部
位调节基因的表达。结合以上亚细胞定位实验结果,
推测该蛋白可能会通过核质穿梭运动参与调节植物
的低磷反应。
2.6 讨论
根际酸化是植物(特别是双子叶植物)应对低磷胁迫的
一种反应, 植物通过根系向根际分泌的氢离子多于碳
酸氢根离子或氢氧根离子, 从而使根际土壤呈酸性
(Raghothama, 1999; Neumann and Römheld, 1999)。
190 植物学报 51(2) 2016



图6 SPL1基因的组织表达特性
(A) SPL1::GUS转基因植株的GUS染色; (B) 用qRT-PCR方法分析SPL1基因在根、茎、叶和花中的组织表达

Figure 6 Tissue-specific expression of SPL1
(A) Histochemical localization of GUS activity directed by SPL1::GUS fusions in transgenic Arabidopsis; (B) qRT-PCR showed
the relative abundant of SPL1 gene in different tissues, including root, stem, leaf and flower




图7 pHBT (A−D)及SPL1 (E−H)蛋白的细胞定位特性
(A), (E) 绿色荧光图; (B), (F) 叶绿体自发荧光图; (C), (G) 透射光图; (D), (H) 叠加图。Bar=5 µm
Figure 7 Localization of GFP signals from pHBT empty vector (A−D) and SPL1 (E−H) fused with GFP
(A), (E) Fluorescence images under confocal microscopy; (B), (F) Chloroplast fluorescence; (C), (G) Bright-field images of the
cells; (D), (H) Merged fluorescence. Bar=5 µm

土壤pH值降低促进了难溶性含磷化合物的溶解和磷
的吸收(Hinsinger et al., 2005), 提高了磷的生物有
效性。本实验从T-DNA标签法构建的突变库中筛选到
1株根际酸化缺失突变体spl1, 通过观察和分析突变
体在低磷条件下的表型, 发现突变体spl1不仅表现出
根际酸化缺失的表型, 而且影响了一系列低磷响应
雷凯健等: 拟南芥SPL1基因参与调节低磷条件下的根际酸化反应 191

过程。
花青素积累是植物响应低磷的最明显的缺素性
状(Raghothama, 1999)。突变体spl1的花青素含量在
低磷条件下显著高于WT, 表现出对低磷敏感的性
状。根形态建成发生变化是拟南芥适应低磷胁迫的另
一个表型特征。低磷可引起植物根毛数量增多和长度
变长, 从而增加了根的表面积, 促进植物对土壤磷的
吸收(Rouached et al., 2010)。我们通过检测WT与突
变体spl1的根形态, 发现在正常条件下突变体的根毛
数量和长度均比WT显著增加, 表现出低磷胁迫的反
应特征, 表明该突变基因可能参与了拟南芥根毛发育
的过程。另外, 对突变体spl1无机磷含量的测定结果
显示, 在低磷条件下突变体根部的无机磷含量略高于
WT。从以上结果可以看出, 突变体spl1根际酸化缺
失, 并表现出低磷敏感、磷吸收增强的表型。根际酸
化是分泌氢质子和有机酸的过程, 而磷吸收是消耗氢
质子和能量的过程。我们推测, 根际酸化与磷吸收存
在一个质子分泌和消耗的动态平衡。突变体spl1根际
酸化缺失, 是否与磷吸收增加而过多消耗根际质子有
关, 还需要更多的实验来证实。
通过Tail-PCR分析表明 , 突变体 spl1是由于
T-DNA插入到SPL1基因的5UTR区产生的。SPL1是
SPL转录因子家族成员 , 被划归为第 I亚类家族。
qRT-PCR实验结果显示, 在低磷条件下, 与磷转运
相关的磷饥饿诱导基因在突变体spl1中表达量显著
升高。该结果解释了突变体spl1在低磷条件下根部磷
含量升高的原因。但由于突变体地上部分磷含量并无
差异, 说明该基因突变可能对根部到地上部分的磷运
转过程不起调控作用。
目前已在许多植物中分离出了SPL基因, 研究表
明它们参与了许多发育及代谢过程, 如时相转换过程
(Wu et al., 2009; Kim et al., 2012)、叶的发育(Wang
et al., 2008)、维持育性(Unte et al., 2003; Xing et al.,
2010)、赤霉素响应(Zhang et al., 2007; Yu et al.,
2012)、花青素合成(Gou et al., 2011)以及胁迫应答
(Yamasaki et al., 2009; Cui et al., 2014; Stief et al.,
2014)等。SPL家族共有17个成员, 其中第II亚类家族
均受miR156调控, 对其参与发育及代谢过程的分子
机制研究得比较深入。而对第I亚类家族研究得较少。
到目前为止还未见对SPL1基因功能研究报道。
Hsieh等(2009)已报道调控SPL家族的miR156表
达受低磷诱导, 有可能参与植物的低磷胁迫反应过程
(雷凯健和安国勇, 2014)。尽管如此, miR156及其靶
基因参与低磷调控的机制并不清楚。本实验室在前期
工作中已发现miR156的超表达及功能缺失突变体参
与了低磷响应的一系列反应, 并通过调控下游SPL3
基因参与低磷调控过程(Lei et al., 2016)。本研究发现
SPL家族中不受miR156调控的SPL1参与了低磷响应
过程, 暗示该家族成员参与低磷响应调控的广泛性。
SPL1与第II亚类家族共同参与低磷调控过程的对话
机制将是今后研究的重点。
参考文献
雷凯健, 安国勇 (2014). 植物miRNA介导磷信号转导的研究
进展. 植物生理学报 50, 1071−1078.
张健, 徐金相, 孔英珍, 纪振动, 王兴春, 安丰英, 李超, 孙加
强 , 张素芝, 杨晓辉, 牟金叶 , 刘新仿, 李家洋 , 薛勇彪,
左建儒 (2005). 化学诱导激活型拟南芥突变体库的构建及
分析. 遗传学报 32, 1082−1088.
Ames BN (1966). Assay of inorganic phosphate, total
phosphate and phosphatase. Methods Enzymol 8, 115−
118.
Cordell D, Dranger JO, White S (2009). The story of
phosphorus: global food security and food for thought.
Global Environ Change 19, 292−305.
Cruz-Ramirez A, Oropeza-Aburto A, Razo-Hernandez F,
Ramirez-Chavez E, Herrera-Estrella L (2006). Phos-
pholipase DZ2 plays an important role in extraplastidic
galactolipid biosynthesis and phosphate recycling in
Arabidopsis roots. Proc Natl Acad Sci USA 103, 6765−
6770.
Cui LG, Shan JX, Shi M, Gao JP, Lin HX (2014). The
miR156-SPL9-DFR pathway coordinates the relationship
between development and abiotic stress tolerance in
plants. Plant J 80, 1108–1117.
Franco-Zorrilla JM, Valli A, Todesco M, Mateos I, Puga
MI, Rubio-Somoza I, Leyva A, Weigel D, Garcia JA,
Paz-Ares J (2007). Target mimicry provides a new
mechanism for regulation of microRNA activity. Nat Genet
39, 1033−1037.
Gomes-Junior RA, Moldes CA, Delite FS, Pompeu GB,
Gratão PL, Mazzafera P, Lea PJ, Azevedo RA (2006).
Antioxidant metabolism of coffee cell suspension cultures
in response to cadmium. Chemosphere 65, 1330−1337.
Gou JY, Felippes F, Liu CJ, Weigel D, Wang JW (2011).
Negative regulation of anthocyanin biosynthesis in Ara-
192 植物学报 51(2) 2016

bidopsis by a miR156-targeted SPL transcription factor.
Plant Cell 23, 1512−1522.
Hinsinger P, Gobran GR, Gregory PJ, Wenzel WW (2005).
Rhizosphere geometry and heterogeneity arising from
root-mediated physical and chemical processes. New
Phytol 168, 293−303.
Hsieh LC, Lin SI, Shih AC, Chen JW, Lin WY, Tseng CY,
Li WH, Chiou TJ (2009). Uncovering small RNA-media-
ted responses to phosphate deficiency in Arabidopsis by
deep sequencing. Plant Physiol 151, 2120−2132.
Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW (1987). GUS
fusions: Beta-glucuronidase as a sensitive and versatile
gene fusion marker in higher plants. EMBO J 6, 3901−
3907.
Khorassani R, Hettwer U, Ratzinger A, Steingrobe B,
Karlovsky P, Claassen N (2011). Citramalic acid and
salicylic acid in sugar beet root exudates solubilize soil
phosphorus. BMC Plant Biol 11, 121−128.
Kim J, Yi H, Choi G, Shin B, Song PS, Choi G (2003).
Functional characterization of phytochrome interacting
factor 3 in phytochrome-mediated light signal transduc-
tion. Plant Cell 15, 2399−2407.
Kim JJ, Lee JH, Kim W, Jung HS, Huijser P, Ahn JH
(2012). The microRNA156-SQUAMOSA PROMOTER
BINDING PROTEIN-LIKE3 module regulates ambient tem-
perature-responsive flowering via FLOWERING LOCUS T
in Arabidopsis. Plant Physiol 159, 461−478.
Lapis-Gaza HR, Jost R, Finnegan PM (2014). Arabidopsis
PHOSPHATE TRANSPORTER1 genes PHT1;8 and
PHT1;9 are involved in root-to-shoot translocation of or-
thophosphate. BMC Plant Biol 14, 334.
Lei KJ, Lin YM, Ren J, Bai L, Miao YC, An GY, Song CP
(2016). Modulation of the phosphate-deficient responses
by the microRNA156 and its targeted SQUAMOSA PRO-
MOTER BINDING PROTEIN-LIKE 3 in Arabidopsis. Plant
Cell Physiol 57, 192−203.
Lei KJ, Xie JY, Zhu YY, Song CP, An GY (2015). Screen-
ing and analysis of rhizosphere acidification deficiency
mutants in Arabidopsis thaliana under low phosphorus.
Soil Sci Plant Nutr 61, 493−500.
Li M, Shinano T, Tadano T (1997). Distribution of exu-
dates of lupin roots in the rhizosphere under phosphor-
rus deficient conditions. Soil Sci Plant Nutr 43, 237−
245.
Lin SI, Chiang SF, Lin WY, Chen JW, Tseng CY, Wu PC,
Chiou TJ (2008). Regulatory network of microRNA399
and PHO2 by systemic signaling. Plant Physiol 147, 732–
746.
López-Bucio J, Cruz-Ramírez A, Herrera-Estrella L
(2003). The role of nutrient availability in regulating root
architecture. Curr Opin Plant Biol 6, 280−287.
Neumann G, Römheld V (1999). Root excretion of carbo-
xylic acids and protons in phosphorus-deficient plants.
Plant Soil 211, 121−130.
Raghothama KG (1999). Phosphate acquisition. Annu Rev
Plant Physiol Plant Mol Biol 50, 665−693.
Rausch C, Bucher M (2002). Molecular mechanisms of
phosphate transport in plants. Planta 216, 23−37.
Rouached H, Arpat AB, Poirier Y (2010). Regulation of
phosphate starvation responses in plants: signaling play-
ers and cross-talks. Mol Plant 3, 288−299.
Santi S, Schmidt W (2009). Dissecting iron deficiency-
induced proton extrusion in Arabidopsis roots. New
Phytol 183, 1072−1084.
Shin H, Shin HS, Chen R, Harrison MJ (2006). Loss of At4
function impacts phosphate distribution between the roots
and the shoots during phosphate starvation. Plant J 45,
712−726.
Sternberg D, Mandels GR (1979). Induction of cellulolytic
enzymes in Trichoderma reesei by sophorose. J Bacteriol
139, 761−769.
Stief A, Altmann S, Hoffmann K, Pant BD, Scheible WR,
Bäurle I (2014). Arabidopsis miR156 regulates tolerance
to recurring environmental stress through SPL transcript-
tion factors. Plant Cell 26, 1792−1807.
Su T, Xu Q, Zhang FC, Chen Y, Li LQ, Wu WH, Chen YF
(2015). WRKY42 modulates phosphate homeostasis
through regulating phosphate translocation and acqui-
sition in Arabidopsis. Plant Physiol 67, 1579−1591.
Ticconi CA, Abel S (2004). Short on phosphate: plant
surveillance and countermeasures. Trends Plant Sci 9,
548−555.
Unte US, Sorensen AM, Pesaresi P, Gandikota M, Leister
D, Saedler H, Huijser P (2003). SPL8, an SBP-box gene
that affects pollen sac development in Arabidopsis. Plant
Cell 15, 1009−1019.
Vance CP, Uhde-Stone C, Allan DL (2003). Phosphorus
acquisition and use: critical adaptations by plants for
securing a nonrenewable resource. New Phytol 157,
423−447.
Wang JW, Schwab R, Czech B, Mica E, Weigel D (2008).
Dual effects of miR156-targeted SPL genes and CYP-
78A5/KLUH on plastochron length and organ size in
Arabidopsis thaliana. Plant Cell 20, 1231−1243.
雷凯健等: 拟南芥SPL1基因参与调节低磷条件下的根际酸化反应 193

Watt M, Evans JR (1999). Proteoid roots. Physiology and
development. Plant Physiol 121, 317−323.
Wu G, Park MY, Conway SR, Wang JW, Weigel D, Po-
ethig RS (2009). The sequential action of miR156 and
miR172 regulates developmental timing in Arabidopsis.
Cell 138, 750−759.
Xing SP, Salinas M, Höhmann S, Berndtgen R, Huijser P
(2010). MiR156-targeted and non targeted SBP-box trans-
cription factors act in concert to secure male fertility in
Arabidopsis. Plant Cell 22, 3935−3950.
Yamasaki H, Hayashi M, Fukazawa M, Kobayashi Y,
Shikanai T (2009). SQUAMOSA PROMOTER BINDING
PROTEIN-LIKE7 is a central regulator for copper homeo-
stasis in Arabidopsis. Plant Cell 21, 347−361.
Yu S, Galvão VC, Zhang YC, Horrer D, Zhang TQ, Hao
YH, Feng YQ, Wang S, Schmid M, Wang JW (2012).
Gibberellin regulates the Arabidopsis floral transition
through miR156-targeted SQUAMOSA PROMOTERBIN-
DING-LIKE transcription factors. Plant Cell 24, 3320−
3332.
Zhang Y, Schwarz S, Saedler H, Huijser P (2007). SPL8, a
local regulator in a subset of gibberellins mediated de-
velopmental processes in Arabidopsis. Plant Mol Biol 63,
429−439.
Zhang Y, Xu S, Ding P, Wang D, Cheng YT, He J, Gao M,
Xu F, Li Y, Zhu Z, Li X, Zhang Y (2010). Control of
salicylic acid synthesis and systemic acquired resis-
tance by two members of a plant-specific family of
transcription factors. Proc Natl Acad Sci USA 107,
18220−18225.

SPL1 is Involved in the Regulation of Rhizosphere Acidification
Reaction Under Low Phosphate Condition in Arabidopsis
Kaijian Lei1, 2 , Jing Ren1 , Yuanyuan Zhu1, Guoyong An1*
1State Key Laboratory of Cotton Biology, College of Life Sciences, Henan University, Kaifeng 475004, China
2College of Pharmacy, Henan University, Kaifeng 475004, China
Abstract Under low phosphate (Pi), the rhizosphere acidification of plants is a vital strategy to cope with low Pi stress.
However, how plants perceive and transduce the low Pi signal and acidify the rhizosphere is not clear. A mutant, spl1, with
decreased rhizosphere acidification induced by low Pi, was isolated from a T-DNA library by using the pH indicator (bro-
mocresol purple). After 8 h incubation in low Pi medium containing bromocresol purple, the color of the rhizosphere of
wild-type (WT) seedlings on the low Pi medium turned yellow, whereas that of the rhizosphere of spl1 seedlings did not
change, which suggested decreased rhizosphere acidification capacity of spl1. The anthocyanin content was higher for
spl1 than the WT with 20 days of low Pi treatment. The number and the length of root hairs of spl1 increased under normal
conditions. Further research suggested that the Pi content of the spl1 mutant was slightly decreased in shoot but in-
creased in root under Pi deficiency. Moreover, the expression of Pi transport-related genes in the spl1 mutant increased
under Pi deficiency. Molecular genetics analysis revealed that the expression of SPL1 was induced by low Pi stress. SPL1
was mainly expressed in Arabidopsis leaves and flower tissues and the SPL1 protein was widely distributed in each part
of the cell. These results indicate that SPL1 is involved in low Pi-induced rhizosphere acidification, regulation of multiple
low Pi responses and Pi starvation-induced gene expression.
Key words Arabidopsis, rhizosphere acidification, spl1, low Pi
Lei KJ, Ren J, Zhu YY, An GY (2016). SPL1 is involved in the regulation of rhizosphere acidification reaction under low
phosphate condition in Arabidopsis. Chin Bull Bot 51, 184–193.
———————————————
* Author for correspondence. E-mail: angy@henu.edu.cn
(责任编辑: 白羽红)