全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2013, 48 (1): 6–9, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2013.00006
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收稿日期: 2013-01-05; 接受日期: 2013-01-10
基金项目: 国家转基因生物新品种培育重大专项(No.2011ZX08009-003)
E-mail: wcyang@genetics.ac.cn
植物转基因技术——回顾与前瞻
杨维才
中国科学院遗传与发育生物学研究所, 北京 100101
摘要 自从1953年Watson和Crick发现DNA双螺旋结构以来, 以DNA重组技术为基础的转基因技术迅速发展, 不可避免地
对人们的日常生活产生了巨大的影响。该文回顾了植物转基因技术的发展历程和现状, 重点介绍了基因定点突变技术ZFN
和TALEN, 以期帮助读者全面快速地了解这一令人充满期待的新的转基因技术。
关键词 TALEN技术, 转基因技术, ZFN技术
杨维才 (2013). 植物转基因技术——回顾与前瞻. 植物学报 48, 6–9.
自1953年4月Watson和Crick提出DNA双螺旋结
构以来(Watson and Crick, 1953), 分子生物学的发
展非常迅速。转基因技术已成为当今生物技术产业的
重要组成部分, 影响着每个人的生活。转基因技术始
于DNA重组(DNA recombination)技术。1968年, Linn
和Arber发现甲基化酶(methylase)和核酸酶(nucle-
ase), 提出了“DNA restriction-modification sys-
tem”(Linn and Arber, 1968; Lobban and Kaiser,
1973), 以及后来Smith等发现DNA序列特异的核酸
限制性内切酶(restriction endonuclease), 为DNA重
组技术奠定了基础。1972年, 第1篇有关DNA重组的
论文发表, 斯坦福大学的Berg实验室把λ噬菌体和大
肠杆菌(Escherichia coli)的半乳糖操纵子成功克隆至
猿猴病毒40(Simian virus 40-SV40)DNA中, 描述了
DNA重组的基本方法(Jackson et al., 1972)。1974年,
斯坦福大学的Cohen和Boyer申请了第1个DNA重组
的专利, 并于1980年获得批准。1983年, Genentech
公司重组人胰岛素获得成功(Johnson, 1983)。同年,
孟山都公司通过农杆菌Ti质粒载体把细菌的新霉素
磷酸转移酶NPT(neomycin phosphotransferase)基
因成功转入烟草细胞, 获得了抗卡那霉素的烟草愈伤
组织(Fraley et al., 1983)。1987年, 比利时根特植物
遗传系统公司(Plant Genetic Systems NV)的科学家
把芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt基因转移至烟

草, 获得了抗虫转基因烟草。1992年, 中国第1个转
基因抗病毒烟草实现商业化种植。1994年, 第1个商
业化销售的转反义多聚半乳糖醛酸酶基因的番茄在
美国上市, 该酶降解果胶, 所以抑制该酶基因的表达
可以延长转基因番茄的货架期。1994年, 欧洲批准抗
除草剂(Bromoxynil)转基因烟草的商业化种植; 1995
年, Bt转基因马铃薯在美国获得批准, 随后转基因油
菜(canola)、Bt玉米、Bt棉花和抗草甘膦大豆等相继
取得成功并获准商业化, 加之2000年黄金大米的出
现, 标志着转基因技术进入了新的阶段。
1 DNA重组与转基因技术
重组技术就是通过限制性核酸内切酶和DNA连接酶
把目标基因片段整合进载体DNA的技术, 是转基因
技术的基础。目标基因指的是待转移的、控制有益性
状的基因, 通常包括抗虫、抗除草剂、抗病和抗盐碱
等抗性基因, 以及控制营养高效利用和具医用价值
(如人胰岛素和白蛋白)的基因。载体DNA通常包含在
细菌中复制和选择筛选所必需的DNA序列和报告基
因, 还包含供目标基因克隆和整合所需的多克隆位点
和T-DNA序列。一般通过农杆菌介导、基因枪、细胞
创伤和花粉管通道等方法将携带目标基因的载体转
入目标植物细胞, 并整合到目标植物的基因组中。最


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后通过选择标记筛选和分子生物学鉴定获得含目标
基因的转基因植物。由于转基因技术可以跨越物种界
限, 克服常规遗传育种技术所不能跨越的物种限制,
因此具有很大的优势, 但同时也对宗教信仰等传统物
种理念带来了新的挑战。
2 植物遗传转化技术的发展
实现遗传转化需要解决2个问题: 一是转化载体, 二
是选择标记基因。20世纪70年代末, 美国华盛顿大学
Nester实验室发现, 发根农杆菌(Agrobacterium tu-
mefaciens)的Ti质粒可以整合到植物细胞基因组中
(Chilton et al., 1977)。80年代初, 比利时根特自由大
学的Schell和Van Montagu实验室证明, Ti质粒可以
作为将外源DNA转入植物细胞基因组的载体(Hernal-
steens et al., 1980), 其T-DNA可以将外源基因整合
到宿主细胞基因组中, 从而解决了转化载体和外源基
因整合的问题。第2个问题是选择标记, 即如何使细
菌的抗菌素基因在植物细胞中表达？1983年, Van
Montagu和德国马普育种所Schell实验室、华盛顿大
学Mary-Dell Chilton实验室和剑桥大学Flavell实验
室, 分别成功地利用根癌农杆菌Ti质粒的冠瘿碱合酶
(nopaline synthase)基因的启动子(NOS)和3’非编码
序列 , 构建了NOS启动子驱动的NEO和CAT(chlo-
ramphenicol acetyltransferase)嵌合基因, 并在烟草
冠瘿瘤细胞中表达, 获得了抗抗菌素的转基因冠瘿瘤
细胞(Bevan et al., 1983; Herrera-Estrella et al.,
1983)。之后洛克菲勒大学蔡南海实验室对花椰菜花
叶病毒35S启动子进行了改良(Benfey and Chua,
1989, 1990), 解决了外源基因在植物中表达的问题。
后来, 又相继发展出非抗生素选择标记(如激素合成
酶基因IPT)(Ebinuma et al., 1997; Zuo et al., 2002)、
双载体共转化 (Depicker et al., 1985; Hare and
Chua, 2002)、双T-DNA边界序列 (Huang et al.,
2004)、CRE/lox和FLP/frt重组(Hoess et al., 1982;
Cox, 1983)以及Ac/Ds转座子系统等技术, 从而排除
了植物选择标记, 使得转基因技术更加安全。有关目
前所用选择标记基因和无选择标记技术的详细介绍
见Tuteja等(2012)的文章。至此, 转基因技术的基本
要素都得以解决, 为今后安全高效转基因技术的蓬勃
发展奠定了基础。
3 基因的定点突变技术: ZFN和TALEN
技术
转录因子通常通过特殊的DNA结合域识别目标基因
启动子上的DNA序列。其中有一类转录因子通过锌指
结构域(zinc-finger domain, ZF)与DNA特异结合。此
类结构域由Klug实验室首先在爪蛙(Xenopus)转录因
子TFIIIA中发现并命名(Miller et al., 1985; Klug and
Rhodes, 1987)。经典的是Cys2His2类ZF结构域, 具
有保守的X2-Cys-X2,4-Cys-X12-His-X3,4,5-His结构, 它
通常识别3 bp的DNA核苷酸序列。不同的ZF结构域识
别的核苷酸序列不同, 可以通过组合不同数目的ZF
类转录因子的Cys2His2结构域实现对目标DNA序列
的特异结合。同时这些ZF结构域可以与DNA核酸内
切酶FokI融合 , 从而构建新的核酸酶 (Zinc-Finger
Nuclease, ZFN)(Kim et al., 1996), 把FokI引至目标
基因并实现切割。由于FokI的活性结构域通常以二聚
体形式发挥作用 , 所以一般需要构建2个ZFN, 使
FokI能形成二聚体。目标基因上的切口大多会被细胞
的DNA修复系统修复, 但也会产生错误, 从而达到突
变目标基因的目的。这就是ZFN技术。
植物黄单孢菌属(Xanthomonas)病原菌通常通
过细菌三型分泌系统向宿主细胞注入效应因子, 以征
服宿主细胞。其中一类是具有转录激活活性的效应因
子TALE (Transcription Activator-Like Effectors)。美
国佛罗里达大学的Stall实验室首先通过遗传学研究
发现了效应因子 avrBs3的存在。随后加州大学
Staskawicz实验室的博士后Bonas克隆了 avrBs3
(Bonas et al., 1989)。avrBs3这类TALE蛋白在其C端
有1个核定位信号和1个转录激活域, 其中央有一段
由多个重复结构串联而成的DNA结合域。一个关键的
问题是 , avrBs3的DNA结合域由17.5个重复结构
组成 , 那么它是如何识别DNA的呢？2009年德国
Bonas实验室和美国衣阿华州立大学Bogdanove实
验室同时回答了这个疑问(Boch et al., 2009; Moscou
and Bogdanove, 2009)。他们的研究发现, avrBs3的
每个重复结构由34个氨基酸残基组成, 其中的第12
位和第13位氨基酸残基是可变的, 这2个氨基酸残基
负责识别1个DNA碱基。这2个氨基酸残基的不同组
合, 可以相对特异性地结合特定的碱基, 例如组氨酸
和天冬氨酸组合识别C或A或T, 天冬酰胺和谷氨酸组
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合识别T或C, 天冬酰胺和异亮氨酸组合识别A。因此,
只要改变每个重复结构第12位和13位的氨基酸残基
组成和重复结构的数目(10–15个)就可以设计出识别
不同DNA序列的TALE蛋白(Boch et al., 2009; Mos-
cou and Bogdanove, 2009; Deng et al., 2012)。如果
再把设计的TALE和核酸酶FokI融合, 就形成了能够
识别特定DNA序列并切割DNA的新核酸酶TALEN
(TALE nuclease或Nickase)。TALEN可以在细胞基因
组的特定位点产生切口, 细胞的DNA损伤修复系统
会对其进行修复, 但修复过程中可能出错, 就会在该
位点产生突变。所以利用TALEN技术就可以在目标基
因中产生突变, 为我们所用。同样, TALE也可以用来
在基因组中特异地激活目标基因。由于TALEN技术可
以在不需转基因的情况下改变任何目标基因的表达,
对科学研究和动植物的遗传改良是非常有用的。自该
技术诞生之日起, 已在动植物研究中被广泛应用, 其
速度之快, 超出人们的想象。但与ZFN技术一样, 该
技术也有缺点, 它不能实现目标基因的跨物种间转
移, 也有非特异突变的可能, 尤其对于多倍体植物和
多拷贝基因的遗传操作还是有难度的。尽管如此, 可
以预见, TALEN技术将像PCR技术一样, 加速生命科
学的发展。
从DNA双螺旋结构的发现到基因定点突变技术
的出现, 仅用了50多年。技术的发展对科学的推动作
用越来越明显, 也许在不远的将来对动植物基因的改
良将会是件容易的事。
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Plant Transgenic Technology: Past and Current Development
Weicai Yang
Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
Abstract Since the discovery of the DNA double helix structure by Watson and Crick in 1953, technologies based on
DNA recombination, such as transgenic technology, have developed so quickly that we can not escape its impact in our
daily life. This short review discussed the past and current status of transgenic technology in plants with a focus on ZFN
and TALEN technology to provide a quick overview of this exciting technology.
Key words TALEN, transgenic technology, ZFN
Yang WC (2013). Plant transgenic technology: past and current development. Chin Bull Bot 48, 6–9.
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(责任编辑: 刘慧君)