全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2015, 50 (5): 614–622, www.chinbullbotany.com
doi: 10.11983/CBB14169
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收稿日期: 2014-09-15; 接受日期: 2015-03-19
基金项目: 教育部博士点基金(No.20124320110002)、国家自然科学基金重大研究计划(No.91130009)和国家自然科学基金(No.11475273)
* 通讯作者。E-mail: lsshem@mail.sysu.edu.cn; zhmyuan@sina.com
基于MADS-box诱饵与蛋白质相互作用的
拟南芥花瓣发育分子网络拓展
杨黎1, 2, 孙丛苇1, 2, 代志军1, 2, 何淼3*, 袁哲明1, 2*
1湖南农业大学湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室, 长沙 410128
2湖南农业大学湖南省植物病虫害生物学及防控重点实验室, 长沙 410128; 3中山大学生命科学学院, 广州 510275
摘要 阐明花器官发育调控机理具重要的进化、发育和生态学意义。该文以拟南芥(Arabidopsis thaliana)花瓣发育为例, 整
合蛋白质互作、亚细胞定位、基因芯片和基因功能注释等数据库, 通过组建蛋白质互作可信预测模型, 获得拟南芥花瓣蛋
白质互作网络, 以含有MADS-box结构域蛋白为诱饵在网络中进行一级拓展, 得到含38个蛋白质和67对互作的拓展网络。
基于拓展网络, DAVID基因功能注释表明, 多数蛋白质涉及的生物学过程与花发育调控相关; 提取到19个候选四元互作,
涉及ABCDE模型基因之外的8个基因, 其中含MADS-box结构域的AGL16可能是B类基因新成员或其冗余; SEU、LUH、
CHR4、CHR11、CHR17和AT3G04960为拟南芥花瓣AP1-AP3-PI-SEP四聚体的候选靶标基因。研究结果为深入解析拟南
芥花瓣发育分子调控网络奠定了基础。
关键词 拟南芥, MADS-box, 花瓣发育, 蛋白质相互作用
杨黎, 孙丛苇, 代志军, 何淼, 袁哲明 (2015). 基于MADS-box诱饵与蛋白质相互作用的拟南芥花瓣发育分子网络拓展.
植物学报 50, 614–622.
拟南芥(Arabidopsis thaliana)是国际上第1个完
成全基因组序列测定的高等植物, 其全基因组包含约
26 000个基因, 编码2万多个蛋白质(The Arabido-
psis Genome Initiative, 2000)。花是研究植物器官发
育过程的良好实验系统, 阐明花器官发育调控机理具
重要意义。在基因层面, 控制拟南芥花器官发育的调
控基因已从经典的ABC模型发展到目前广为接受的
ABCDE模型(图1) (Kim et al., 2005), 其中花瓣发育
受A、B和E类基因调控。在蛋白质层面, 四因子模型
假设4种花同源异型基因(或基因产物)的不同组合决
定不同花器官的特征, 其中AP1-AP1-SEP-SEP决定
萼片形成(Pelaz et al., 2001), AP1-AP3-PI-SEP决定
花瓣形成(Immink et al., 2010), AP3-PI-AG-SEP决
定雄蕊形成(Ferrario et al., 2003; Immink et al.,
2003), AG-AG-SEP-SEP决定心皮形成(Theissen
and Saedler, 2001)。这些蛋白质复合物(可能是转录
因子)通过黏着在特异目标基因的启动子上激活或抑
制不同的器官特征基因发挥功能; 不同蛋白质复合物


图1 花器官发育的ABCDE模型及相关基因(引自Kim et al.,
2005)

Figure 1 The ABCDE model and related genes of floral
organ development (from Kim et al., 2005)

和DNA序列之间亲合力的不同和不同基因启动子区
域的不同决定了蛋白质复合物和目标基因的相互选
择(Theissen, 2001)。
Sánchez-Corrales等(2010)总结多个实验结果,
·技术方法·
杨黎等: 基于MADS-box诱饵与蛋白质相互作用的拟南芥花瓣发育分子网络拓展 615
构建了动态花特异性关键基因调控网络, 初步阐释了
这些基因之间的调控关系, 但其涉及花器官发育的关
键基因仅限于ABCDE模型中的基因。由于ABCDE模
型中基因的产物大都被其它基因的转录产物所调控,
直接或间接参与花器官的形成和功能(Aukerman and
Sakai, 2003)。因此, 拟南芥花器官发育分子调控网
络有待拓展。
除AP2外, ABCDE模型中目前已发现的花器官
发育功能基因都属于MADS-box转录因子家族, 含1
个由56–58个氨基酸残基组成的高度保守的结构域
——MADS-box(吕山花和孟征, 2007; Smaczniak et
al., 2012)。该序列编码的转录因子黏着在相应DNA
上调该基因转录(Theissen et al., 2000; Theissen,
2001)。含MADS-box结构域的转录因子是植物发育
起始与组织特异性的主调节器(Pajoro et al., 2014)。
目前 , 拟南芥中有近 6 000对蛋白质相互作用
(protein-protein interaction, PPI)对被实验所验证 ;
这为以MADS-box蛋白为诱饵, 基于PPI预测拓展拟
南芥花器官发育分子调控网络提供了契机。
理论上基于结构的PPI预测更为准确(Zhang et
al., 2012), 但应用受限。仅基于序列的PPI预测方法
近年来发展迅速, 其独立预测精度已达到可接受水
平。如Shen等(2007)将20种天然氨基酸重划分为7类,
以343个三联体残基频率表征蛋白质序列, 采用支持
向量机(support vector machine, SVM)建模在人类数
据上获得了83%的独立预测精度。Guo等(2008)以自
协方差编码蛋白质序列的同时考虑各残基间的距离,
在酵母数据上获得了88.09%的独立预测精度。
本文以拟南芥花瓣发育为例, 整合蛋白互作、亚
细胞定位、基因芯片和基因功能注释等数据库, 通过
组建PPI可信预测模型, 得到拟南芥花瓣PPI预测网
络, 以含有MADS-box结构域的蛋白为诱饵在网络中
进行一级拓展, 为深入解析拟南芥花瓣发育的分子调
控网络提供依据。
1 数据与方法
1.1 拟南芥PPI预测模型的构建
样本正集: 实验验证的拟南芥(Arabidopsis thaliana
L.) PPI对(正样本)来自IntAct、BioGRID、BIND与
TAIR 4个数据库。自编python脚本剔除重复与自相关
作用对后, 按如下规则进行筛选: (1) 序列中不含有
未知氨基酸; (2) 序列长度大于50个氨基酸残基; (3)
相互作用的蛋白质相似性低于40%。最后得到6 720
个PPI对, 命名为Pair-1-Pos; 含3 561个蛋白质, 命
名为Single-1-Pos。
样本负集: 实验验证的拟南芥非相互作用蛋白对
数据缺乏, 当前较可信的蛋白质相互作用负集构建法
是亚细胞定位法, 它假定亚细胞定位不同的蛋白质之
间不发生相互作用(Guo et al., 2008)。拟南芥蛋白质
亚细胞定位包含细胞外、细胞质基质、细胞核和线粒
体 4类 (http://suba.plantenergy.uwa.edu.au/), 两两
组合后按如下规则进行筛选: (1) 序列中不含有未知
氨基酸; (2) 序列长度大于50个氨基酸残基; (3) 配对
的两个蛋白质相似性低于40%; (4) 不含有正样本中
存在的蛋白对; (5) 随机抽取与正样本数相等的蛋白
对。最后得到6 720个蛋白质非相互作用对, 命名为
Pair-2-Neg; 含2 793个蛋白质 , 命名为Single-2-
Neg。
训练集与测试集划分: 从样本正集Pair-1-Pos与
样本负集Pair-2-Neg中随机各取5 000对构成训练集
Pair-3-Train, 剩下的3 440对构成独立测试集Pair-3-
Test。
序列表征: 采用Guo等(2008)提出的自协方差编
码表征序列, 每个氨基酸残基包含疏水性、亲水性、
极性、极化率、侧链体积、溶剂可及表面积与侧链静
电荷指数7种理化性质, 每对蛋白质含2×7×lg维特征,
lg为序列中两个残基之间的最大距离。
SVM训练建模: SVM采用台湾林智仁的Libsvm,
核函数选用径向基核, 核函数c和g参数以网格遍历
寻优(grid.py)经5次交叉测试优化获得。
1.2 拟南芥花瓣发育基因芯片数据及其共表达过滤
查询TAIR(http://www.arabidopsis.org/)的子数据库
AtGenExpress, 获得6张拟南芥花瓣发育基因芯片
ATGE_35(A、B、C)与ATGE_42(B、C、D)。花周期
12的ATGE_35含13 024个基因, 花周期15的ATGE_
42含12 451个基因。若某基因在6张芯片中表达值均
非零, 则视该基因为拟南芥花瓣发育有表达基因。获
得花瓣中有表达基因集, 含11 483个基因, 命名为
Single-3。
11 483个基因两两组合数据庞大, 直接以前述
616 植物学报 50(5) 2015
SVM模型预测PPI对, 会有绝对数量较大的假阳性样
本。基因共表达是指两个基因表达模式上的相似性,
两个相互作用的蛋白质通常存在共表达(Zhang and
Horvath, 2005)。拟南芥基因共表达数据库ATTED-II
(http://atted.jp/)含22 574个基因两两间的皮尔逊相关
系数(Pearson’s correlation coefficient, PCC)矩阵。
PCC一般默认阈值为0.6 (Srinivasasainagendra et
al., 2008)。为进一步控制蛋白质互作预测的假阳性,
设定阈值为0.7; 若PCC绝对值大于或等于0.7, 则认
为两基因间存在共表达。花瓣中有表达基因集
Single-3经共表达过滤, 得到共表达明显的166 836
对蛋白质, 命名为Pair-4; 含3 982个蛋白质, 命名为
Single-4。
1.3 含MADS-box诱饵蛋白在拟南芥花瓣PPI网
络中的一级拓展
取拟南芥PPI样本正集中的3 561个蛋白质集合
Single-1-Pos与花瓣中有表达的11 483个基因集合
Single-3的交集, 得花瓣中实验验证有相互作用的蛋
白质1 998个, 命名为Singe-5-Obs; 包含3 133对实
验验证相互作用蛋白质, 命名为Pair-5-Obs。
合并花瓣中共表达明显且预测为阳性的PPI对以
及花瓣中实验验证PPI对, 构成拟南芥花瓣PPI网络;
以拟南芥含MADS-box结构域的蛋白质为诱饵 , 在
PPI网络中进行一级拓展。
2 结果与讨论
2.1 拟南芥PPI模型评估与预测
训练集Pair-3-Train经SVM建模, 在lg为15、20、25、
30、35、40和45时对含3 440个样本的独立测试集
Pair-3-Test获得了76.24%–78.03%的预测精度, 当
lg为30时最高, 达78.03%, 显示该模型较为可信。
取lg=30, 预测花瓣中共表达明显的166 836对
蛋白质Pair-4, 得15 621个阳性样本(预测有相互作
用蛋白对), 命名为Pair-6-Pre; 含2 235个蛋白质, 命
名为Single-6-Pre。
2.2 基于MADS-box诱饵与PPI的拟南芥花瓣发
育分子网络
对实验验证有相互作用蛋白对Pair-5-Obs与预测有
相互作用蛋白对Pair-6-Pre求并集, 得花瓣中PPI对
18 703, 命名为Pair-7-Total; 含3 692个蛋白质, 命
名为Single-7-Total。
拟南芥全基因组含MADS-box结构域的蛋白质
有107个(Parenicová et al., 2003), Single-7-Total覆
盖其中的10个: AP1、AP3、PI、SEP1、SEP2、SEP3、
CAL、AGL18、AGL16和FLM。将花瓣中PPI对
Pair-7-Total导入网络可视化程序Cytoscape, 以10
个MADS-box蛋白质为诱饵进行一级拓展, 得拓展的
拟南芥花瓣发育分子网络(图2), 该网络含38个蛋白
质, 67对相互作用; 不计与实验验证重合的PPI对,
新增预测PPI为27对。其中 , SEP3与SEP1之间的
相互作用虽未被实验证实或证伪, 但同源相互作用
支持SEP3与SEP1之间存在互作(de Folter et al.,
2005)。
由表1可知, 网络中涉及的38个蛋白质中多数蛋
白其DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)功能注释
涉及的生物学过程与花发育调控相关。此外, 有报道
显示, AT3G04960基因的表达在成花诱导中与花同
源异型基因相关(Schimid et al., 2003); CYP77A6参
与花发育的角质层形成, 属花发育ABCDE模型中A
类基因亚家族的重要成员(Li-Beisson et al., 2009;
Yang et al., 2010); AGL18参与花发育的负调控、延
迟花器官衰老和脱落(Chen et al., 2011)。
2.3 花瓣发育分子网络中候选的四元互作
花器官发育的四因子假说模型提示我们应关注网络
中潜在的四元互作。以4个蛋白6对PPI为条件, 从图2
中可提取19个候选四元互作(图3), 涉及ABCDE模型
基因之外的8个基因 ; 特别是AGL16, 其本身含
MADS-box结构域, 在系统发育上与B类基因AP3和
PI较近, 与A类基因AP1以及E类基因SEP1、SEP2和
SEP3较远(Parenicová et al., 2003), 推测AGL16是
B类基因新成员或其冗余。此外, AT1G02190蛋白参
与角质层蜡质的合成与花粉发育(Gomez-Mena et
al., 2005); AT2G20870为细胞壁蛋白, 在光周期通
路中下调拟南芥的开花时间(Cai et al., 2007)。
2.4 花瓣四聚体的候选作用靶标
四因子假设模型中, AP1-AP3-PI-SEP决定花瓣形成,
该四聚体通过黏着在特异目标基因的启动子上激活
杨黎等: 基于MADS-box诱饵与蛋白质相互作用的拟南芥花瓣发育分子网络拓展 617


图2 基于MADS-box诱饵与蛋白质相互作用的拟南芥花瓣发育分子网络
○: 含MADS-box结构域的蛋白质; ◇: 不含MADS-box结构域的蛋白质; ─: 实验验证的蛋白质互作(PPI); ┄: 支持向量机预测的
蛋白质互作(PPI)。

Figure 2 Molecular network related to petal development based on MADS-box bait protein and protein-protein interaction (PPI)
in Arabidopsis thaliana
○: Proteins with MADS-box domain; ◇: Proteins without MADS-box domain; ─: Verified PPI by experiment; ┄: Predicted PPI
by support vector machine (SVM).


或抑制不同的器官特征基因发挥功能(Theissen and
Saedler, 2001)。基于PPI与靶基因的功能注释, 根据
图2所示信息提取到花瓣AP1-AP3-PI-SEP四聚体的
6个候选靶标基因: SEU、LUH、CHR4、CHR11、
CHR17和AT3G04960。其中, SEU功能注释为花发育
调控、胚珠发育、胚芽发育、雌蕊发育和多细胞组织
发育等。LUH功能注释为花发育、胚芽发育和转录调
控等。CHR4、CHR11和CHR17主要功能注释为染色
体组装及染色质重塑。AP1-AP3-PI-SEP四聚体以
MADS-box序列编码的转录因子通过黏着在CHR4、
CHR11和CHR17的DNA上调其转录(Theissen and
Saedler, 2001; Huanca-Mamani et al., 2005), 支持
本文CHR4、CHR11和CHR17为花瓣四聚体候选作用
靶标的推测。AT3G04960在成花诱导中与花同源异
型基因相关(Schimid et al., 2003)。
2.5 讨论
影响PPI预测精度的因素众多。(1) 负集构建方法。
常用的包括正样本中蛋白质随机配对法、亚细胞定位
法和一侧蛋白质k-let重排人工构造序列法等。Guo等
(2008)研究表明, 亚细胞定位法构造负集更为可信。
然而, 假设A-B存在互作, 由于穿梭蛋白的存在, 若
蛋白A本应同时定位于细胞质基质和细胞核, 蛋白B
本应仅定位于细胞核; 由于当前亚细胞定位仅记录到
蛋白A定位于细胞基质、蛋白B定位于细胞核, 且当前
实验验证数据库中无A-B互作记录, 则A-B可能被错
618 植物学报 50(5) 2015
表1 拓展网络中38个蛋白质涉及的生物学过程
Table 1 The related biological processes of 38 proteins in expansion network
Proteins Biological processes
AP1 Flower development; floral meristem determinacy; meristem structural organization; positive regulation of tran-
scription
AP3 Flower development; reproductive structure developmental; regulation of transcription
PI Flower development; reproductive structure developmental; regulation of transcription
SEP1 Flower development; ovule development
SEP2 Flower development; ovule development
SEP3 Flower development; ovule development; specification of floral organ identity; regulation of transcription
LUH Flower development; embryo development; negative regulation of transcription; regulation of transcription
SEU Regulation of flower development; ovule development; embryo development; gynoecium development; multi-
cellular organismal development
AGL16 Regulation of transcription
CHR4 Chromatin organization; chromatin assembly or disassembly; regulation of transcription; chromosome organi-
zation
CHR11 Embryo sac development; gametophyte development; chromatin organization; chromatin remodeling; chro-
mosome organization
CHR17 Chromatin organization; chromatin remodeling; chromatin modification; chromosome organization
CHR3 Flower development; organ boundary specification between lateral organs and the meristem; response to wo-
unding
AGL18 Negative regulation of flower development; negative regulation of short-day photoperiodism; flowering
CAL Floral meristem determinacy; positive regulation of flower development
FLM Negative regulation of flower development; photoperiodism; flowering; regulation of flower development
HSS Ovule development; positive regulation of flower development; floral organ abscission; negative regulation of
transcription
GYM Regulation of lateral root development; negative regulation of transcription
BLH19 Fruit development; floral whorl morphogenesis; negative regulation of transcription; organ formation
SPL5 Regulation of transcription; regulation of vegetative phase change
ZCW32 Petal morphogenesis; regulation of transcription; DNA-dependent
CYP77A6 Cutin biosynthetic process; flower development
ATGPAT6 Cutin biosynthetic process; flower development; metabolic process
ATINO80 Positive regulation of DNA repair; regulation of transcription; somatic cell DNA recombination
AT4G00870 Regulation of transcription
AT1G02190 Fatty acid metabolic process; fatty acid biosynthetic process; lipid biosynthetic process; organic acid biosyn-
thetic process
AT2G42990 Lipid catabolic process
AT5G45960 Lipid catabolic process
KNAT3 Regulation of transcription; detection of hormone stimulus; detection of cytokinin stimulus; response to organic
substance
ATY2 Glycerol ether metabolic process; cellular homeostasis; cell redox homeostasis
EDA29 Polar nucleus fusion; response to abscisic acid stimulus
BRM Regulation of gene expression
CYP706A3 Unknown
ATRLI1 Unknown
AT3G04960 Unknown
AT1G49490 Unknown
AT5G22430 Unknown
AT2G20870 Unknown

误地选择为负样本。物种间当前亚细胞定位信息准确
性与全面性的差异是导致不同物种间负集构建合理
性进而影响PPI预测准确性的重要原因。(2) 正样本
代表性的覆盖度。PPI存在多种模式, 若某物种已经
杨黎等: 基于MADS-box诱饵与蛋白质相互作用的拟南芥花瓣发育分子网络拓展 619

图3 拟南芥花瓣发育分子网络中候选的四元互作
○: 含MADS-box结构域的蛋白质; ◇: 不含MADS-box结构域的蛋白质; ─: 实验验证的蛋白质互作(PPI); ┄: 支持向量机预测的
蛋白质互作(PPI)。

Figure 3 The candidate tetrameric interactions related to petal development molecular network in Arabidopsis thaliana
○: Proteins with MADS-box domain; ◇: Proteins without MADS-box domain; ─: Verified protein-protein interaction by ex-
periment; ┄: Predicted protein-protein interaction by support vector machine (SVM).

图4 拟南芥花瓣四聚体的候选作用靶标
○: 含MADS-box结构域的蛋白质; ◇: 不含MADS-box结构域的蛋白质; ─: 实验验证的蛋白质互作(PPI); ┄: 支持向量机预测的
蛋白质互作(PPI)。

Figure 4 The candidate targets of petal tetramers in Arabidopsis thaliana
○: Proteins with MADS-box domain; ◇: Proteins without MADS-box domain; ─: Verified protein-protein interaction by ex-
periment; ┄: Predicted protein-protein interaction by support vector machine (SVM).
620 植物学报 50(5) 2015
过实验验证存在PPI的正样本代表性不够, 仅覆盖少
量PPI模式, 必然导致全基因组范围内PPI预测精度
偏低。(3) 序列表征与特征筛选。如氨基酸重分7类三
联体残基频率表征(Shen et al., 2007)与残基7种理化
性质自协方差编码表征(Guo et al., 2008)。7种理化
性质可能不足以代表残基的复杂特性, AA531数据库
包含天然氨基酸的531种理化性质, 代表性虽充分,
但又势必存在无关与冗余, 此时特征筛选成为必要。
(4) 样本A-B中各蛋白质序列特征的先后排列次序。
可交换核函数是解决这一问题的有效手段(Shen et
al., 2007)。相比Shen等(2007)在人类数据上获得的
83%及Guo等(2008)在酵母数据上获得的88.09%的
独立预测精度 , 本研究在拟南芥数据上获得的
78.03%独立预测精度偏低。综合考虑上述改进因素,
进一步较大幅度提升拟南芥PPI预测精度将是后续工
作的重要内容。
本研究挖掘到花瓣发育分子网络中19个候选四
元互作, 含53对PPI, 其中12对PPI有待分子生物学
实验验证(图3); 推测花瓣AP1-AP3-PI-SEP四聚体的
6个候选靶标基因为SEU、LUH、CHR4、CHR11、
CHR17和AT3G04960 (图4), 可供分子生物学实验
优先验证。花器官发育包括萼片、花瓣、雄蕊、心皮
和胚珠, 本文仅涉及花瓣。随着其它花器官芯片数据
的丰富, 构建一个完整的拟南芥花器官发育分子调控
网络是值得探讨的一个新课题。
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622 植物学报 50(5) 2015
Expansion of the Molecular Network Related to Petal Development
Based on MADS-box Proteins and Protein-Protein Interaction
Network in Arabidopsis thaliana
Li Yang1, 2, Congwei Sun1, 2, Zhijun Dai1, 2, Miao He3*, Zheming Yuan1, 2*
1Hunan Provincial Key Laboratory of Crop Germplasm Innovation and Utilization, Hunan Agricultural University, Changsha
410128, China; 2Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests, Hunan Agri-
cultural University, Changsha 410128, China; 3School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China
Abstract The regulatory mechanism of flower organ development has an important role in evolution, development and
ecology. Here, we used petal development of Arabidopsis thaliana as an example and integrated protein-protein interac-
tion, subcellular localization, gene-chip and gene functional annotation databases to reveal a protein-protein interaction
network related to petals of A. thaliana and built a reliable predictive model of protein-protein interaction. By using proteins
containing the MADS-box domain as bait, we could expand the network by one level and obtained an expanded network
of 38 proteins and 67 protein-protein interactions. Gene functional annotation with the DAVID database suggested that
most of the proteins were involved in regulation of flower development in the expanded network. We derived 19 candidate
tetrameric interactions, involving 8 genes, from the expanded network. None of the 8 genes belonged to the ABCDE
model genes: AGL16, with an MADS-box domain, may be a new member or a redundant gene of class B. SEU, LUH,
CHR4, CHR11, CHR17, and AT3G04960 were candidate targets of petal AP1-AP3-PI-SEP tetramers of A. thaliana. The
results provide references for deeply analyzing the molecular regulatory network related to petal development of A.
thaliana.
Key words Arabidopsis thaliana, MADS-box, petal development, protein-protein interaction
Yang L, Sun CW, Dai ZJ, He M, Yuan ZM (2015). Expansion of the molecular network related to petal development
based on MADS-box proteins and protein-protein interaction network in Arabidopsis thaliana. Chin Bull Bot 50, 614–622.
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* Authors for correspondence. E-mail: lsshem@mail.sysu.edu.cn; zhmyuan@sina.com
(责任编辑: 白羽红)