全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (1): 59-68, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2008-05-13; 接受日期: 2008-05-16
基金项目: 国家自然科学基金(No. 30770217)
* 通讯作者。E-mail: lixg@sdau.edu.cn; zhangxs@sdau.edu.cn
.研究论文.
APETALA1启动子驱动 AtIPT4在转基因拟南芥中表达
导致花和花器官发育异常
于明明, 李兴国 *, 张宪省 *
山东农业大学生命科学学院, 作物生物学国家重点实验室, 泰安 271018
摘要 细胞分裂素对拟南芥(Arab idopsis thal iana )花分生组织细胞的分裂和分化具有重要作用。本研究利用APETALA1
(AP1)特异启动子在花分生组织和第1、2轮花器官中表达细胞分裂素合成酶(isopentyl trans ferase, IPT)基因IPT4, 研究细
胞分裂素对花和花器官发育的影响。在pAP1::IPT4转基因植株中出现了花密集和花器官数目增多等现象。原位杂交和GUS
组织染色结果发现, 在pAP1::IPT4转基因植株中, 花分生组织特征决定基因LEAFY (LFY)与花器官特征决定基因AP1、
PISTILLATA (PI )和AGAMOUS (AG)的表达量均有不同程度的提高。研究结果表明在拟南芥中表达pAP1::IPT4影响其花和
花器官的正常发育。
关键词 拟南芥, 细胞分裂素, 花发育, 花器官特征决定基因, LEAFY基因
于明明 , 李兴国 , 张宪省 (2009). APETALA1(AP1)启动子驱动AtIPT4在转基因拟南芥中表达导致花和花器官发育异常. 植物学报 44,
59-68.
细胞分裂素在植物生长发育的多个方面起着重要作
用(Mok and Mok, 2001), 其中包括对植物花发育的调
节。细胞分裂素浓度的改变能够影响植物花和花器官
的发育。例如, 利用 35S启动子在拟南芥中过量表达细
胞分裂素氧化酶(cytokinin oxidase/dehydrogenase)基
因AtCKX, 转基因植株体内的细胞分裂素浓度降低到野
生型的30%-45%, 植株极度矮化, 苗端分生组织体积变
小, 花的数目显著减少(Werner et al., 2003), 表明其花
序分生组织和花原基的发育均受到抑制。在水稻中降
低细胞分裂素氧化酶基因OsCKX2的表达水平, 导致细
胞分裂素在花序分生组织中的积累, 花的数目增加, 最终
导致籽粒数目增加(Ashikari et al. , 2005)。对野生型
拟南芥花序外施细胞分裂素导致花器官数目增多, 产生
过渡形态的花器官, 如萼片 -花瓣、花瓣 -雄蕊和雄蕊 -
心皮等, 以及在萼片腋部产生二级花(Veng la t and
Sawhney, 1996)。拟南芥 amp1突变体含有高浓度的
细胞分裂素, 有时形成异常的花器官, 如多心皮的雌蕊
(Chaudhury et al. , 1993)。上述结果暗示细胞分裂素
的浓度对花和花器官的发育具有重要的调节作用。细
胞分裂素信号转导也与植物花和花器官的发育相关。
拟南芥细胞分裂素受体突变体 ahk2 ahk 3 ahk 4的苗端
分生组织变小, 开花时间延迟, 只形成少量败育的花
(Higuchi et al. , 2004; Nishimura et al. , 2004; Riefler
et al., 2006)。Leibfried 等的研究显示, 以 35S 启动子
过量表达点突变的 A RA B I DO P S IS RES P O NS E
REGULATOR7(ARR7)基因(Asp 85®Glu), 转基因植株
幼苗产生类似于 wus突变体的表型, 苗端分生组织发育
受阻, 有的分裂为2或3个独立部分, 这几部分不能形成
正常的叶序和花原基; arr7 arr15双突变体的雌配子体败
育; arr3 arr4 arr5 arr6 arr8 arr9六突变体在花序轴分支
处产生异位的花; 干细胞维持基因WUSCHEL (WUS)能
够直接抑制部分A 类细胞分裂素响应调节因子(ARR5、
ARR6、ARR7和 ARR15)的表达。以上结果表明A 类
ARR基因可能参与调节花序分生组织的大小和花原基的
起始(Leibfried et al. , 2005)。
Coen和Meyerowitz最早在 1991年提出了花器官
60 植物学报 44(1) 2009
发育的 ABC模型。该模型认为, 调控花器官形成的基
因按功能可划分为A、B 和 C 3类, 每一类基因均在相
邻的 2轮器官中起作用。A 类基因单独作用于萼片; A
和 B类基因共同决定花瓣的形成; B和 C类基因共同决
定雄蕊发育; C类基因单独决定心皮的形成(Coen and
Meyerowitz , 1991)。在拟南芥中, A 类基因包括AP1
和APETALA2 (AP2), B类基因包括APETALA3 (AP3)
和 PI , C类基因包括 AG。除了 A类基因 AP2, 大部分
ABC基因为MADS-box转录因子家族成员。目前已知
赤霉素(gibberell in, GA)能够促进 LFY以及花器官特征
决定基因 AP 3、PI 和 AG 的表达(Blázquez et a l. ,
1998; Yu et al., 2004; Eriksson et al., 2006), 但是关
于细胞分裂素与这些基因的关系却知之甚少。早期的
研究表明, 在烟草中过表达农杆菌细胞分裂素合成酶基
因 IPT 会导致其花器官发育异常。以矮牵牛的MADS-
box 基因 DEFA、GLO和 PLENA mRNA 为探针进行
Northern杂交, 结果表明烟草中与之对应的 3个同源基
因的表达量下降(Estruch et al., 1993)。在风信子的花
器官再生体系中, 花特异基因 HAG1(拟南芥中 AG的同
源基因)和HoMADS1(D类MADS-box基因)的表达受细
胞分裂素和生长素的诱导(Li et al. , 2002; Xu et al. ,
2004)。以上研究结果表明, 细胞分裂素可能影响花分
生组织和花器官特征决定基因的表达。
为了进一步研究细胞分裂素与花发育的关系, 我们
构建了表达载体pAP1::IPT4并转化野生型拟南芥, 结果
发现转基因植株的花密集, 花器官数目增多。原位杂交
和GUS组织化学染色结果发现, pAP1:: IPT4转基因植
株中花分生组织特异基因LFY以及花器官特征决定基因
AP1、PI 和 AG 的表达量均有不同程度的上调。本研
究为探讨转基因植株的表型与上述基因的表达变化之间
的关系提供了新的证据。
1 材料与方法
1.1 植物材料及培养条件
所用拟南芥(Arab idopsis thaliana L.)生态型为 Colum-
bia (Col)。种子用 75% (v/v)乙醇消毒 5分钟, 2. 6%
(v/v) NaClO消毒 10分钟, 播种于GM 培养基(1/2 MS
无机盐, 1% 蔗糖, pH 5.7)。在黑暗中低温处理 3天后
移至短日照条件下(23°C, 8小时光照)萌发5-7天, 然后
将幼苗移到基质中, 在短日照条件下生长30天后移至长
日照(23°C, 16小时光照)条件下诱导开花。
1.2 转基因植株的获得
通过PCR方法从野生型拟南芥基因组DNA中扩增获得
AP1启动子(Mandel et al. , 1992; Hempel et al. ,
1997)、IP T4 基因(该基因不含内含子) (K ak im o to ,
2001)和LFY启动子(Weigel et al. , 1992; Blázquez et
al. , 1997)。LFY 启动子引物序列为 5-AATCGATGA-
TCCATTTTTCGCAAAGG-3和 5-AGGATCCAATC-
TATTTTTCTCTCTCTCTC-3。AP1启动子引物序列为
5-CTAAGCTTTCAAAACTCAGGACGTACAT-3和 5-
ATGGTACCAGCTCAGACTTTGGTATGA-3。IPT4基
因引物序列为 5-CCTGGTACCCTCAATTTACGACAT-
GA AGTG T-3 和 5-TCTGG TA CCG TTTTGCGG T-
GATATTAGTC-3。
将 IPT4基因插入 AP 1启动子之后连入表达载体
pBI121获得pAP1:: IPT4表达载体。AP1启动子和LFY
启动子分别插入到表达载体 pBI121的GUS表达框之前
获得 pAP1::GUS 和 pLFY:GUS 表达载体。用花序浸
染法转化拟南芥(Clough and Bent, 1998), 并在含有
50 mg·L-1卡那霉素(kanamyc in)的培养基上筛选 T1 代
转基因植株。以 pAP1:: IPT4植株为母本, pLFY:GUS
植株为父本进行杂交, 进而对 F1代植株进行GUS 染色
和表型分析, 得到 pAP1:IPT4×pLFY:GUS 植株。
1.3 原位杂交
用于原位杂交的 LF Y、AP1、PI 以及 AG RNA 探针
序列均参考前人的报道(Drews et al., 1991; Weigel et
al., 1992; Goto and Meyerowitz, 1994; Sundström et
al., 2006)。探针合成参照Roche公司 RNA Labelling
Kit (11 175 025 910)说明书。将材料于 FAA 固定液
(50%乙醇: 10%冰醋酸: 5%甲醛)中4°C固定 10小时,
经脱水、透明和浸蜡, 包埋于 100% 石蜡中。切片厚
61于明明等: APETALA1(AP1)启动子驱动AtIPT4在转基因拟南芥中表达导致花和花器官发育异常
度为 8 µm, 42°C 展片、烘片。材料经脱蜡、消化和
乙酰化等步骤后, 与探针杂交。再经洗片、免疫学反
应后显色(Xu et al. , 2005)。用Olympus BH-2显微镜
观察, Olympus DP12 数码相机照相。
1.4 GUS染色分析
GUS染色方法参考文献报道(Molier et al. , 1995)并略
有改动。花序顶端组织在 90% 丙酮中冰浴固定 10-15
分钟, 用GUS 染液缓冲液漂洗 3次, 每次 5分钟, 然后
置于GUS 染液中, 37°C染色 2-8 小时。染色后的材
料用石蜡包埋后切片, 用钌红衬染后镜检观察, 或者直接
用 Hoyer’s透明剂 (三氯乙醛:水:甘油 =3:0.8:0.4)透明
后压片观察。
2 结果
2.1 pAP1::IPT4 转基因植株表型
拟南芥为十字花科植物, 野生型的花具有 4片萼片、4
片花瓣、6枚雄蕊和 1枚雌蕊(图 1A, B)。在获得的 47
个 pAP1:: IPT4转基因拟南芥株系中, 有45个株系出现
花密集和花器官数目增多的表型(图 1 )。以 43 号株系
为例, 该株系花序顶端的花排列紧密(图 1E), 在开放的
花朵中, 只有10%的花与野生型相同, 其余90%的花具
有增多的花器官, 有5-8片萼片, 5-7片花瓣, 6-8枚雄
蕊, 1枚由 2个心皮构成的雌蕊(图 1F, G)。我们推测,
紧密排列的花和数目增多的花器官, 可能与花分生组织
和花器官发育的相关基因的表达模式或表达量的变化有
关。因此, 我们选取 43 号株系为代表, 用原位杂交和
GUS染色方法分析花分生组织特异基因 LFY以及花器
官特异基因A P1、P I 和 A G 的表达模式和表达量。
2.2 AP1基因的表达模式
组织学切片结合GUS 染色分析显示, AP1启动子驱动
的GUS最早在花分生组织中表达, 随着花原基的发育而
逐渐集中于第 1、2轮花器官原基中表达, 这与已有的
研究结果相一致(图 1C, D, H) (Mandel et al., 1992)。
实验结果证明细胞分裂素合成酶基因 IPT4主要集中在
早期的花原基以及后期的花第 1、2轮花器官原基中表
达, 在 pAP1:: IPT4转基因植株的花分生组织和花的第
1、2 轮花器官中可能积累了较高浓度的细胞分裂素。
pAP1:: IPT4转基因植株的花和花器官中细胞分裂素总
浓度是野生型的 10 倍左右(未发表资料)。
2.3 pAP1::IPT4转基因植株中花分生组织特征
决定基因LFY和AP1的表达上调
在拟南芥中, LFY 和 AP1都是花分生组织特征决定基
因, 其中 AP1同时也是第 1、2轮花器官特异的MADS-
box基因(Mandel et al. , 1992; Weigel and Nilsson,
1995; Mandel and Yanofsky, 1995)。l fy突变体的花
分生组织转变为花序分生组织(Schultz and Haughn,
1991), 异位表达LFY基因, 花序分生组织转变为一个末
端的花分生组织(Weigel and Nilsson, 1995)。LFY 在
很大程度上通过激活AP1来促进花序向花分生组织转变
(Mandel and Yanofsky, 1995; Wagner et al., 1999)。
LFY不仅能够激活AP1的表达, 而且能够在花分生组织
形成后继续促进花器官特征决定基因AP 3、PI 和 AG
的表达(Weigel and Meyerowitz , 1993)。为了研究
LFY在 pAP1:: IPT4转基因植株中的表达变化, 我们对
野生型和pAP1:: IPT4转基因植株43号株系进行了原位
杂交。结果表明, 在野生型的花序分生组织中, LFY 的
表达起始于花序分生组织中将要形成花原基的侧翼部位,
即与花分生组织的起始同步, 随后在花分生组织中特异
表达(Weigel et al., 1992; Weigel and Nilsson, 1995)。
在 pAP1::IPT4转基因植株中, LFY 在花分生组织中的
表达部位没有明显变化, 但表达量显著提高, 并且这种提
高贯穿于整个花发育过程(图 2A, B, E, F)。GUS 分析
结果显示, pAP1::IPT4×pLFY::GUS转基因植株中GUS
的表达模式与原位杂交结果一致(图2C, G), 表明异位表
达 IPT4基因可显著提高 LF Y 的表达水平。
AP1/CAULIFLOWER (CAL)是花分生组织启动的
充分必要条件, 在花原基刚出现时即开始表达。ap1-1
cal-1突变体的花序分生组织侧翼产生的花原基被新的
花序分生组织所替代(Bowman et al., 1993), 过表达
AP1则使转基因植株的花序分生组织只产生一朵末端花
62 植物学报 44(1) 2009
(Mandel and Yanofsky , 1995)。花序分生组织特征决
定基因TERMINAL FLOWER1(TFL1)在花序分生组织正
下方表达, 能够抑制 AP1/CAL和 LFY 在花序分生组织
中的表达(Bradley et al. , 1997; Kobayashi et al. ,
1999)。AP1与 TFL1相互拮抗, 以保证 LFY 在花分生
组织中的表达(Li ljegren et al. , 1999)。原位杂交结果
显示, AP1在 pAP1:: IPT4转基因植株中总体表达量略
有提高, 并且在时期 4的第 3、4轮花器官原基中持续
表达(图 3C, D), 而在野生型时期 4的花中, AP1只在萼
片基部和将要产生花瓣原基的部位表达(图 3B )。
2.4 pAP1::IPT4转基因植株中花器官特征决定
基因PI和AG的表达量提高
AP3和 PI 是拟南芥第 2、3轮花器官特征决定基因, 突
变体 ap3与 pi 的花瓣和雄蕊分别被萼片和心皮所代替
(Jack et al. , 1992; Goto and Meyerowitz, 1994)。在
野生型拟南芥的时期 3的花中, AP3在即将分化出雄蕊
和雌蕊的部位起始表达, 之后贯穿于雄蕊和雌蕊的整个
发育过程(Jack et al., 1992; Weigel and Meyerowitz,
1993)。PI 最初在花发育至时期 3的花瓣、雄蕊和雌
蕊原基中表达, 在时期4的雌蕊原基中表达量降低, 时期
图 1 pAP1::IPT4转基因植株的表型及 AP1的表达模式
(A) 野生型拟南芥花序顶面观; (B) 野生型拟南芥花的结构(白色箭头所示): 4片萼片, 4片花瓣, 6枚雄蕊, 1枚由 2个心皮构成的雌蕊;
(C), (D) GUS染色分析AP1表达模式: 在发育后期的花中, AP1的表达主要集中于萼片和花瓣; (E) pAP1::IPT4转基因植株花序顶面观;
(F) pAP1::IPT4转基因植株的花, 具有5片花瓣, 8枚雄蕊; (G) pAP1::IPT4转基因植株的花, 具有6片萼片, 7片花瓣; (H) GUS染色分析
AP1表达模式: 在发育早期的花中, AP1主要在花分生组织中表达(图中数字代表花的发育时期)。se: 萼片; pe: 花瓣; s t: 雄蕊; ca: 心
皮。Bar=100 mm
Figur e 1 Flow er phenotypes of pAP1::IPT4 transgenic plants and expression pattern of AP1 in w ild-type plants
(A) Top view of the inf lorescence of w ild-type plant; (B) Structure of w ild-type f low er (w hite ar row heads) : four sepals, four
petals , s ix s tamens, a pistil of tw o carpels; (C) , (D) GUS staining analysis of AP1 promoter activity , GUS signals w ere detec ted in
sepals and petals during late f low er s tages; (E) Top view of an inf lorescence of the pAP1::IPT4 transgenic plant; (F) Flow er of
pAP1::IPT4 transgenic plant, w ith f ive petals and eight stamens; (G) Flow er of pAP1::IPT4 transgenic plant, w ith s ix sepals and
seven petals; (H) Histological section of GUS staining. GUS w as expressed in f loral mer istems during early f low er stages (the
numbers represent developmental stages of f low er). se: Sepal; pe: Petal; s t: Stamen; ca: Carpel. Bar=100 mm
63于明明等: APETALA1(AP1)启动子驱动AtIPT4在转基因拟南芥中表达导致花和花器官发育异常
5以后 PI 只在雄蕊和雌蕊中表达(图 4A, B) (Goto and
Meyerowitz , 1994)。原位杂交结果显示, 在 pAP1::
IPT4转基因植株的花序分生组织中有PI mRNA信号出
现, 在时期2的花中有较强表达(图4C), 在时期3及以后
发育阶段的花中, PI在雄蕊中的表达量较野生型明显提
高(图 4D)。
AG编码了第 3、4轮花器官特异的MADS-box 同
源基因, 并且是花分生组织的终结基因(Bowman et al.,
1989; Yanofsky et al., 1990)。强表型的 ag突变体,
雄蕊变为萼片, 心皮变为新一轮的萼片-花瓣-萼片结构,
依次循环, 说明该突变体的花分生组织特性不能被抑制,
从而产生无限循环的第 1、2 轮花器官。在 ag -1 突变
体中, 干细胞维持基因W US 在花分生组织中持续表
达。相反, 在野生型拟南芥中, WUS 随着 AG 的表达
而逐渐减弱, 并在心皮原基出现时完全消失。因此可以
推测, AG是通过抑制WUS的途径结束花分生组织的功
能的(Sablowski, 2007)。在野生型拟南芥花发育至时
期 3和时期 4时, AG在雌蕊和雄蕊原基中开始表达, 随
后持续在分化的雌蕊和雄蕊中表达(图 5A, B)(Bowman
et al., 1989, 1991; Yanofsky et al. , 1990)。在pAP1::
IPT4转基因植株中, AG mRNA在时期1和时期2的花
中有较强的表达, 时期3和时期4的雄蕊和雌蕊原基中
表达量明显增加 , 并且在萼片中也发现表达信号(图
5C, D)。
3 讨论
本文的研究结果表明, 在拟南芥花中表达细胞分裂素合
成酶基因 IPT4会影响转基因植株花及花器官的正常发
育。进一步的原位杂交结果表明, 转基因植株中的花分
生组织特征决定基因 L F Y 以及花器官特征决定基因
AP1、PI 和 AG的表达水平均有显著提高。我们推测,
图 2 pAP1::IPT4转基因植株中 LFY的表达模式
(A), (B) 野生型拟南芥中 LFY的原位杂交结果; (C), (D) 野生型拟南芥中LFY的GUS染色结果; (E), (F) pAP1::IPT4转基因植株中LFY
的原位杂交结果; (G), (H) pAP1::IPT4转基因植株中GUS染色结果。se: 萼片; st: 雄蕊; ca: 心皮。数字代表花的发育时期。Bar=100
mm
Figur e 2 Express ion patterns of LFY in pAP1::IPT4 transgenic plants
(A), (B) In s itu localization of LFY expression in w ild-type plants; (C), (D) GUS s taining analysis of LFY promoter in w ild- type
plants ; (E), (F) In s itu localization of LFY expression in pAP1::IPT4 transgenic plants; (G), (H) GUS s taining analysis of LFY
promoter ac tivity in pAP1::IPT4 transgenic plants. se: Sepal; st: Stamen; ca: Carpel. The numbers represent developmental stages
of f low er. Bar=100 mm
64 植物学报 44(1) 2009
LFY 和 AP1表达量的提高可能促使花分生组织在花序
分生组织更多的部位起始, 最终产生排列密集的花。已
知 LFY能够促进 AP1、PI 和 AG的表达(Sablowski et
a l . , 2007) , LF Y 表达量的提高可能促进了这几类
MADS-box基因的表达, 从而有助于花器官分生组织活
性的提高, 促进更多花器官分化。
拟南芥细胞分裂素受体突变体 ahk2 ahk 3 ahk 4不
仅苗端分生组织变小, 而且花和根的发育也受到抑制, 主
根的生长速率只有野生型的20%, 维管系统的细胞束明
显减少, 根分生组织变小(H iguc hi e t a l . , 2004 ;
Nishimura et al., 2004)。拟南芥组氨酸磷酸转移蛋白
(Arabidopsis his tone-phosphotransfer protein, AHP)
突变体 ahp1 ahp2 ahp3 ahp4 ahp5的主根缺乏后生木
质部和韧皮部, 生长发育缓慢(Hutchison et al. , 2006)。
A类 ARR基因的功能缺失突变体的根伸长也受到抑制
(To et al., 2004)。而利用 35S 启动子在拟南芥中过量
表达细胞分裂素氧化酶基因AtCKX, 转基因植株的根系
发育受到促进, 根分生组织活性增强(Werner et al. ,
2003)。以上研究结果显示, 细胞分裂素在根中的作用
似乎是相互矛盾的。基于以上现象, Ferreira和 Kieber
图 3 pAP1::IPT4转基因植株中AP1的表达模式
(A), (B) 野生型拟南芥的AP1原位杂交结果, (B)中黑色箭头表示
AP1 在时期 4花中的表达信号; (C) , (D) pAP1::IPT4转基因植株
的AP1原位杂交结果, 黑色箭头表示AP1 在时期 4花中的异位表
达信号。se: 萼片。数字代表花的发育时期。Bar=1 00 mm
Figure 3 Expression patterns of AP1 in pAP1::IPT4 transgenic
plants
(A) , (B) In situ localization of AP1 expression in w ild-type plants,
and black arrow heads in (B) indicate the AP1 expression sig-
nal in stage 4 f low er; (C), (D) In s itu localization of AP1 ex -
pression in pAP1::IPT4 transgenic plants , and black ar row
heads indicate the ectopic AP1 expression s ignal in s tage 4
flow er. se: Sepal. The numbers represent developmental stages
of f low er. Bar=100 mm
图 4 pAP1::IPT4转基因植株中PI的表达模式
(A), (B) 野生型拟南芥的PI原位杂交结果, 黑色箭头表示PI在时
期 4花中的表达信号; (C) , (D) pAP1::IPT4转基因植株的PI原位
杂交结果, 黑色箭头表示 PI 在时期2和时期3花中的表达信号。
s t: 雄蕊。数字代表花的发育时期。Bar=100 mm
Figur e 4 Expression patterns of PI in pAP1::IPT4 transgenic
plants
(A) , (B) In situ localization of PI expression in w ild-type plants,
and black ar row heads indicate the PI express ion signal in
stage 4 f low er; (C) , (D) In si tu localization of PI expression in
pAP1::IPT4 transgenic plants, and black ar row heads indicate
the PI express ion signal in stage 2 and 3 f low er. st: Stamen.
The numbers represent developmental s tages of f low er .
Bar=100 mm
65于明明等: APETALA1(AP1)启动子驱动AtIPT4在转基因拟南芥中表达导致花和花器官发育异常
(2005)提出了关于细胞分裂素信号输出与根发育关系的
钟罩模型。在这个模型中, 内源细胞分裂素信号输出存
在着一个阈值, 这个阈值低于野生型水平。当细胞分裂
素信号输出水平降至这个阈值时, 如过表达细胞分裂素
氧化酶, 根的生长受到促进; 继续降低细胞分裂素信号输
出水平使之低于这个阈值时, 如突变体ahk 2 ahk3 ahk4
和ahp1 ahp2 ahp3 ahp4 ahp5, 根的生长受到抑制; 而
增加细胞分裂素信号输出水平至高于野生型时, 如 A类
arr突变体, 根的生长也受到抑制(Ferreira and Kieber,
图 5 pAP1::IPT4转基因植株中AG 的表达模式
(A), (B) 野生型拟南芥的AG原位杂交结果, 黑色箭头表示AG在
时期 3和时期 4花中的表达信号; (C), (D) pAP1::IPT4转基因植
株的AG 原位杂交结果, 黑色箭头表示AG 在时期1、时期 2、时
期 3和时期 4的花中扩大了的表达信号。se: 萼片。数字代表花
的发育时期。Bar=100 mm
Figure 5 Express ion patterns of AG in pAP1::IPT4 transgenic
plants
(A) , (B) In situ localization of AG transcripts in w ild-type plants,
and black arrow heads indicate the AG express ion signal in
stage 3 and 4 f low er; (C), (D) In si tu localization of AG tran-
sc ripts in pAP1::IPT4 transgenic plants, and black arrow heads
indicate expanded AG expression signal in stage 1, 2, 3 and 4
flow er. se: Sepal. The numbers represent developmental stages
of f low er. Bar=100 mm
2005)。但这个模型是否适用于细胞分裂素对拟南芥花
和花器官发育的调控, 有待于进一步的证明。
早期的研究显示, 在烟草中将内源细胞分裂素的浓
度提高至100-1 000倍后能够导致花器官发生融合并失
去对称性, 同时使花器官特征决定基因表达量降低
(Estruch et al., 1993)。最近也有研究表明, 降低拟南
芥植株内的细胞分裂素浓度或抑制其信号转导, 会使植
株的花和花器官发育受阻(Werner et al., 2003; Higuchi
et al. , 2004; Nishimura et al. , 2004; Riefler et al. ,
2006)。以风信子的被片为外植体进行离体再生培养发
现, 高浓度的细胞分裂素和生长素只能诱导外植体产生
被片, 而较低浓度的细胞分裂素和生长素可诱导外植体
产生雌蕊和心皮; 与此同时, 在雌蕊和心皮特异表达的
MADS-box基因HAG1受高浓度的细胞分裂素和生长素
诱导 (Li et al., 2002)。而MADS-box 基因 HoMADS1
的表达和胚珠的再生则需要低浓度的细胞分裂素和生长
素的诱导(Xu et al. , 2004)。结合本研究结果, 我们推
测在对花和花器官发育的调控过程中, 细胞分裂素也存
在一个最适浓度范围。低于这个浓度范围, 花分生组织
及花的发育过程将延缓; 高于这个浓度, 过剩的细胞分裂
素及其信号转导就会扰乱正常的花发育过程, 造成其发
育异常。而在最适浓度范围内, 花分生组织及花器官特
征基因将随着细胞分裂素浓度的提高而逐渐受到诱导,
从而促进了花分生组织及花器官的发育。
参考文献
Ashik ari M, Sakakibara H, Lin SY, Yamamoto T, Takas hi T,
Nishimura A, Angeles ER, Qian Q, Kitano H, M atsuoka M
(2005). Cy tokinin oxidase regulates r ice grain produc tion.
Science 309, 741-745.
Blázque z M A, Soowal LN, Le e I, Weigel D (1997). LEAFY
expression and f low er initiation in Arabidops is. Development
124, 3835-3844.
Blázque z MA, Green R, Nilsson O, Sussman M R, Weigel D
(1998). Gibberellins promote f low ering of Arabidopsis by acti-
vating the LEAFY promoter. Plant Cell 10, 791-800.
66 植物学报 44(1) 2009
Bowman JL, Smyth DR, M eyer owitz EM (1989). Genes di-
recting f low er development in A rabidops is. Plant Cell 1, 37-
52.
Bow man JL, Smyth DR, Meyerowitz EM (1991). Genetic in-
terac tions among f loral homeotic genes of A rabidops is .
Development 112, 1-20.
Bow man JL, Alvare z J, Weigel D, Meyerowitz EM , Sm yth
DR (1993) . Control of f low er development in Arab idops is
thali ana by APETALA1 and interacting genes . Development
119, 721-743.
Bradley D, Ratcliffe O, Vincent C, Carpenter R, Coen E (1997).
Inflorescence commitment and architecture in Arabidopsis.
Science 275, 80-83.
Chaudhury AM, Letham DS, Craig S, Dennis ES (1993). amp1-
a mutant w ith high cy tokinin levels and altered embryonic
pattern, fas ter vegetative grow th, constitutive photomorpho-
genes is and precocious f low ering. Plant J 4, 907-916.
Clough SJ, Bent AF (1998) . Floral dip: a s implif ied method for
Agrobacter ium-mediated trans f ormation of Arabi dopsi s
thali ana. Plant J 16, 735-743.
Coen ES, Meyerowitz EM (1991). The w ar of the w horls: ge-
netic interactions controlling f low er development. Nature 353,
31-37.
Dr ews GN, Bowman JL, Meyerow itz EM (1991). Negative
regulation of the Arabidops is homeotic gene AGAMOUS by
the APETALA2 product. Cel l 65, 991-1002.
Eriksson S, Böhlenius H, Moritz T, Nilss on O (2006) . GA4 is
the active gibberellin in the regulation of LEAFY transcription
and A rabidopsis f loral initiation. Plant Cell 18, 2172-2181.
Estruch JJ, Granell A, Hanse n G, Prinsen E, Redig P, van
Onck elen H, Schwarz-Somm er Z, Sommer H, Spe na A
(1993). Floral development and express ion of f loral homeotic
genes are influenced by cytokinins. Plant J 4, 379-384.
Fer reira FJ, Kieber JJ (2005) . Cy tokinin s ignaling. Curr Opin
Plant Biol 8, 518-525.
Goto K, Meyerowitz EM (1994). Function and regulation of the
Arabidopsis f loral homeotic gene PISTILLATA. Genes Dev 8,
1548-1560.
Hem pel FD, Weigel D, Mandel MA, Dit ta G, Zambr yski PC,
Feldm an LJ, Yanofsky MF (1997) . Floral determination and
expression of f loral regulatory genes in Arabidopsis. Devel-
opment 124, 3845-3853.
Higuchi M , Pis chk e MS, M ähöne n AP, M iyaw ak i K,
Hashimoto Y, Seki M, Kobayashi M, Shinozaki K, Kato T,
Tabata S, Helariut ta Y, Sussman MR, Kakimoto T (2004).
In planta functions of the Arabidopsis cytokinin receptor family.
Proc Natl Acad Sc i USA 101, 8821-8826.
Hutchison CE, Li J, Argueso C, Gonzale z M, Lee E, Lewis
MW, Maxwell BB, Per due TD, Schaller GE, Alonso JM,
Eck er JR, Kie be r JJ (2006) . The A rabidops is hist idine
phosphotrans fer proteins are redundant positive regulators
of cy tokinin signaling. Plant Cell 18, 3073-3087.
Jack T, Brockm an LL, M eyerowitz EM (1992). The homeotic
gene APETALA3 of Arab idopsis thaliana encodes a MA DS-
box and is expressed in petals and stamens . Cel l 68, 683-
697.
Kakimoto T (2001). Identif ication of plant cytokinin biosynthetic
enzymes as dimethylallyl diphosphate: ATP/ADP isopentenyltr-
ansferases. Plant Cell Physiol 42, 677-685.
Kobayashi Y, Kaya H, Goto K, Iwabuchi M, Araki T (1999). A
pair of related genes w ith antagonistic roles in mediating f low -
ering signals. Science 286, 1960-1962.
Leibfried A, To JP, Busch W, Stehling S, Ke hle A, Demar M,
Kie ber JJ, Lohmann JU (2005). WUSCHEL controls mer-
istem f unction by direct regulation of cytokinin-inducible re-
sponse regulators. Nature 438, 1172-1175.
Li QZ, L i XG, Bai SN, Lu WL, Zhang XS (2002). Isolation of
HAG1 and its regulation by plant hormones dur ing in vitro
f loral organogenesis in Hyac inthus oriental is L. Planta 215,
533-540.
Liljegren SJ, Gustafson-Br own C, Pinyopich A, Dit ta GS,
Yanofsky MF (1999). Interactions among APETALA1, LEAFY,
and TERMINA L FLOWER1 specify meristem fate. Plant Cell
11, 1007-1018.
67于明明等: APETALA1(AP1)启动子驱动AtIPT4在转基因拟南芥中表达导致花和花器官发育异常
Mande l MA, Gustafson-Brown C, Savidge B, Yanofs ky MF
(1992). Molecular charac terization of the Arabidopsis f loral
homeotic gene APETALA1. Nature 360, 273-277.
Mande l MA, Yanofsky MF (1995). A gene triggering f low er
formation in A rabidops is. Nature 377, 522-524.
Mok DW, Mok MC (2001). Cytokinin metabolism and action. Annu
Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 89, 89-118.
Molier P, Montoro P, Delar ue M , Bechtold N, Be llin i C,
Pelletier G (1995). Promoterless GUSA expression in a large
number of Arabidopsis thaliana transf ormants obtained by
the in planta inf iltration method. C R Acad Sci Paris 318, 465-
474.
Nishimur a C, Ohashi Y, Sato S, Kato T, Tabata S, Ueguchi C
(2004) . Histidine kinase homologs that act as cytokinin recep-
tors possess overlapping functions in the regulation of shoot
and root grow th in Arabidopsis. Plant Cell 16, 1365-1377.
Rief le r M , Novak O, Str nad M, Schm ül l ing T (2006) .
Arabidops is cytokinin receptor mutants reveal functions in
shoot grow th, leaf senescence, seed size, germination, root
development, and cytokinin metabolism. Pl ant Cel l 18, 40-
54.
Sablows ki R (2007). Flow ering and determinacy in Arabidopsis.
J Exp Bot 8, 899-907.
Schultz EA, Haughn GW (1991). LEAFY, a homeotic gene that
regulates inflorescence development in Arabidopsis. Plant Cell
3, 771-781.
Sundström JF, Nakayama N, Glimelius K, Irish V F (2006).
Direct regulation of the f loral homeotic APETALA1 gene by
APETALA3 and PISTILLATA in Arabidops is. Plant J 46, 593-
600.
To JPC, Habe rer G, Fer reira FJ, Der uère J, Mason MG,
Schaller GE, Alonso JM, Ecker JR, Kieber JJ (2004). Type-
A Arabidopsis response regulators are par tially redundant
negative regulators of cytokinin signaling. Plant Cell 16, 658-
671.
Venglat SP, Sawhney VK (1996). Benzy laminopurine induces
phoenocopies of f loral mer istem and organ identity mutants in
w ild-type Arabidopsis plants. Planta 198, 480-487.
Wagner D, Sablowski RW, Meye rowitz EM (1999). Transcrip-
tional activation of APETALA1 by LEAFY. Science 285, 582-
584.
Weigel D, Alvarez J, Smyth DR, Yanofs ky MF, Meyerowitz
EM (1992) . LEAFY controls f loral mer is tem identity in
Arabidopsis. Cell 69, 843-859.
Weige l D, Meyerowitz EM (1993). Activation of f loral homeotic
genes in Arabidopsis. Science 261, 1723-1726.
Weigel D, Nilsson O (1995) . A developmental sw itch suff icient
for f low er initiation in diverse plants. Nature 377, 495-500.
Werne r T, Motyka V, Laucou V, Smets R, van Onckelen H,
Schm ül l ing T (2003) . Cy tokinin-def ic ient transgenic
Arabidopsis plants show multiple developmental alterations
indicating oppos ite functions of cytokinins in the regulation
of shoot and root meris tem activity. Pl ant Cel l 15, 2532-
2550.
Xu HY, L i XG, Li QZ, Bai SN, Lu WL, Zhang XS (2004). Charac-
ter ization of HoMADS1 and its induction by plant hormones
during in vi tro ovule development in Hyac inthus orientalis L.
Plant Mol Biol 55, 209-220.
Xu YY, Wang XM, Li J, Li JH, Wu JS, Walker JC, Xu ZH, Chong
K (2005). Ac tivation of the WUS gene induces ectopic init ia-
tion of f loral meristems on mature stem surface in Arabidopsis
thali ana. Plant Mol Biol 57, 773-784.
Yanofs ky MF, Ma H, Bowman JL, Drews GN, Feldmann KA,
M eye r ow itz EM (1990). The protein encoded by the
Arabidopsis homeotic gene AGAMOUS resembles transc rip-
tion factors. Nature 346, 35-40.
Yu H, Ito T, Zhao YX, Peng JR, Kumar P, M eye rowitz EM
(2004). Floral homeotic genes are targets of gibberellin signal-
ing in f low er development. Proc Natl Acad Sci USA 101, 7827-
7832.
68 植物学报 44(1) 2009
Expression of AtIPT4 Gene Under the Control of APETALA1
Promoter Results in Abnormal Flower and Floral
Organ Development
Mingming Yu, Xingguo Li*, Xiansheng Zhang*
State Ke y o f Crop s B iol ogy La borato ry, Co lle ge of Life Scien ces, Shan don g Agri cul tural Uni versit y, Tai ’an 27 101 8, Chi na
Abstr act The plant hormone cy tokinin plays important roles in cell div ision and differentiation of f loral meris tem. To investigate the
relation betw een cytokinin and the f low er, as w ell as f loral organ development, w e investigated in Arabidopsis the expression of
the cy tokinin biosynthetic gene IPT4 under control of the promoter of APETALA1 (AP1) in the f loral mer istem and outer tw o w hor ls
of f loral organs. Transgenic plants w ith pAP1::IPT4 show ed abnormal phenotypes, inc luding a compact f low er arrangement and
increased number of f low er organs. In situ hybr idization and GUS s taining analyses revealed the up-regulation of LEAFY (LFY) ,
AP1, PISTILLATA (PI) and AGAMOUS (AG ) in pAP1::IPT4 transgenic plants. Thus , the expression of AtIPT4 under control of AP1
mediates the development of f low er and f loral organs in part via regulating the expression of LFY and f loral organ identity genes.
Ke y words Ara bido psi s, cytokin in, fl ora l de vel opm ent, fl ora l o rgan id ent ity gen es, LEAFY ge ne
Yu MM , Li XG, Zhang XS (200 9). Exp ression of At IPT4 g ene und er the con tro l of APETALA1 promoter resu lts in abn orm al f lower a nd
fl ora l organ de vel opme nt. Ch in Bull Bo t 44 , 5 9-68 .
* Author for correspondence. E-mail: lixg@sdau.edu.cn; zhangxs@sdau.edu.cn
(责任编辑: 白羽红)