全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2016, 51 (2): 210–217, www.chinbullbotany.com
doi: 10.11983/CBB15053
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收稿日期: 2015-03-12; 接受日期: 2015-07-14
基金项目: 十二五国家科技支撑项目(No.2012BAD21B03)
* 通讯作者。E-mail: wangjh@caf.ac.cn
黄金树B类MADS-box基因表达特征分析
景丹龙, 夏燕, 张守攻, 王军辉*
中国林业科学研究院林业研究所, 国家林业局林木培育重点实验室, 国家林木种质资源平台, 北京 100091
摘要 采用同源克隆技术, 从黄金树(Catalpa speciosa)花芽中克隆得到B类MADS-box基因CaspAP3和CaspPI的cDNA序
列。序列分析表明, CaspAP3基因cDNA序列的完整开放阅读框(ORF)为696 bp, 编码231个氨基酸残基; CaspPI基因cDNA
序列的ORF为639 bp, 编码212个氨基酸残基。蛋白质序列相似性比对和分子系统发生分析表明, CaspAP3属于AP3/DEF进
化支, 其C末端包含保守的euAP3基序和PI-derived基序, 而CaspPI聚类于PI/GLO进化支, 其C末端包含保守的PI基序。半定
量RT-PCR分析结果表明, CaspAP3和CaspPI基因均仅在花瓣和雄蕊中表达。实时荧光定量PCR分析表明, CaspAP3和
CaspPI基因在花瓣和雄蕊原基分化期至成熟期均有表达, 这2个基因在雄蕊中表达高峰出现的时间均早于花瓣; 且花瓣中的
CaspAP3和CaspPI基因表达高峰均出现在快速伸长阶段; 这与花瓣和雄蕊的形态发育阶段相吻合。
关键词 黄金树, 花发育, B类基因, 基因克隆, 基因表达
景丹龙, 夏燕, 张守攻, 王军辉 (2016). 黄金树B类MADS-box基因表达特征分析. 植物学报 51, 210–217.
黄金树(Catalpa speciosa)又名白花梓树, 为紫
葳科(Bignoniaceae)梓树属落叶乔木, 原产美国, 20
世纪初引种到我国多个地区。由于其树形通直, 冠形
优美, 花冠白色, 花大且具有芳香味, 在我国各地常
作为庭院观赏植物(陈晓, 2002)。花是被子植物特有的
器官, 其大小、形态和颜色等性状常与植物的演化联
系起来作为植物分类的重要依据(Endress, 2011)。近
年来, 国内外对黄金树花器官发育的研究主要集中在
花原基分化、花药、胚珠发育的形态观察和大、小孢
子发生及雌、雄配子体发育的细胞学观察等方面(陈旭
辉等, 2009; 李利平等, 2013), 而对B类MADS-box基
因调控其花瓣和雄蕊发育的分子机理仍缺乏研究。
AP3 (APETALA3)和PI (PISTILLATA)基因是调
控拟南芥(Arabidopsis thaliana)花瓣和雄蕊发育的重
要B类MADS-box基因, 其表达模式具有很强的时空特
异性。在花发育过程中, AP3基因在萼片原基出现时开
始表达, 并在花瓣和雄蕊原基出现后达到较高的水平,
其转录主要限制在花瓣和雄蕊中(Jack et al., 1992);
而PI基因转录略晚于AP3基因, 且与AP3基因表达相互
依赖(Jack et al., 1992; Goto and Meyerowitz, 1994;
Krizek and Meyerowitz, 1996)。由于B类MADS-box基
因的表达模式可能与被子植物花器官的形态多样化相
关(Viaene et al., 2009), 同时林木植物具有较长的幼
龄期, 且对木本植物的花器官发育研究比草本植物薄
弱(张冰玉等, 2008), 因此对调控林木植物花发育的B
类MADS-box基因进行研究具有重要的学术意义。
本研究利用同源克隆技术从黄金树花芽中分离出
CaspAP3和CaspPI基因的cDNA序列, 并分析了它们
与已知AP3和PI基因的系统进化关系, 进一步检测了
CaspAP3和CaspPI基因在不同组织及器官中的表达
特征, 进而探讨和推测这2个基因在黄金树花瓣与雄
蕊生长发育过程中的可能作用。
1 材料与方法
1.1 材料
于4−5月在北京林业大学校园内采集黄金树(Catalpa
speciosa (Ward. ex Barney) Engelm)花芽。采集的不
同长度花芽先放入液氮中冷冻, 然后置于−80°C冰箱
中保存备用。
1.2 方法
1.2.1 CaspAP3和CaspPI基因的克隆
从NCBI网站下载黄金树近缘物种的AP3和PI同源基
·研究报告·
景丹龙等: 黄金树 B类MADS-box基因表达特征分析 211
因的cDNA序列 , 并利用DNAMAN软件进行序列比
对。根据这些同源基因cDNA序列5′和3′非翻译区
(untranslated region, UTR)的保守部位, 用Oligo 6软
件分别在5′-UTR和3′-UTR设计包含黄金树AP3和PI
同源基因完整开放阅读框(open reading frame, ORF)
的上、下游引物FLAP3F与FLAP3R及FLPIF与FLPIR
(表1)。
使用EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒
(Aidlab, China), 提取黄金树花芽的总RNA, 用
DNase I (TaKaRa, Japan)在37°C条件下反应30分钟,
消化总RNA中混有的少量DNA, 使用M-MLV逆转录
酶(TaKaRa, Japan)反转录成cDNA。PCR反应程序:
94°C预变性5分钟; 94°C45秒, 56°C45秒, 72°C45秒,
30个循环; 72°C延伸10分钟。PCR反应产物用琼脂糖
凝胶电泳检测 , 回收片段并连接到pmd18-T载体
(TaKaRa, Japan)上, 转入Top10大肠杆菌感受态细胞,
挑取单克隆菌落, 扩大培养后测序。

1.2.2 分子系统发生分析和蛋白质序列同源比对
将推导的黄金树CaspAP3和CaspPI基因cDNA序列
编码的氨基酸残基序列在NCBI数据库中进行BLAST
分析。用Clustal W程序将这2个蛋白质序列与NCBI
数据库中B类MADS-box同源基因的蛋白质序列进行
多重比较(Thompson et al., 1994)。使用MEGA 5.0软
件(Kumar et al., 2008; Tamura et al., 2011), 选择最
大似然法(maximum like-lihood)构建系统进化树
(Jones et al., 1992)。参数设置: 自展(bootstrap, BS)
分析执行500次重复, 选用Jones-Taylor-Thornton
(JTT)模型。涉及比对的26条蛋白质序列(NCBI基因登
录号)如下: 矮牵牛(Petunia x hybrida) TM6 (AAS-
46017); 百脉根(Lotus japonicus) LojaAP3 (AAX13-
301); 番茄(Solanum lycopersicum) SolyDEF
(CAJ53871); 风信子(Hyacinthus orientalis) HPI1
(AF134114); 辐射松(Pinus radiata) PrDGL (AAF28-
863); 红花玉兰(Magnolia wufengensis) MAwuAP3
(AFM75880); 黄金树CaspAP3 (KP876026), CaspPI
(KP876027); 金粟兰(Chloranthus spicatus) Chs-
pAP3 (AAR06664); 金鱼草(Antirrhinum majus)
GLO (CAA48725), DEF (CAA44629); 康乃馨(Dian-
thus caryophyllus) CMB2 (AAB05559); 拟南芥
PI (NM_122031), AP3 (NP_191002); 葡萄(Vitis
表1 引物序列
Table 1 The sequences of primers
Primer name Primer sequences (5′→ 3′)
FLAP3F GCAAACTCAAATCTTGAAAATC
FLAP3R CACATTATGCGACAGAATTCAT
FLPIF GAGAACCAAATTAAGAGAAAGACCA
FLPIR GCACCAAGACAACCACATACGTA
RTactinF ATGATGCTCCAAGAGCTGTG
RTactinR AGCAAGATCGAGACGTAGGA
RTAP3F TACATCAGCCCCATTATAACGA
RTAP3R TTATTCAAGCAAGGCAAACGTG
RTPIF ACCACAAGTTGTCTGGGAAGAG
RTPIR AATCTGCAACTCCCTGATGATC
qRTactinF GATGATGCTCCAAGAGCTGT
qRTactinR TCCATATCATCCCAGTTGCT
qRTAP3F CTTGAAGAAGCTGAAGGAGGTT
qRTAP3R CTTGCTGGTATCAATCTGGTTG
qRTPIF GAGAATGACAGCATGCAGATTG
qRTPIR ATTATCGTCCATTGGATCCAGA


vinifera) VvPI (AFR53063); 苹果(Malus domestica)
MdTM6 (BAC11907); 青 皮 木 (Schoepfia jasmi-
nodora) ScjPI (AFV74899); 三叶木通(Akebia trifo-
liata) AktPI (AAT46097); 麝香百合(Lilium longiflo-
rum) LMADS8 (AEI88009); 麝香兰(Muscari arme-
niacum) MaDEF (BAE48147); 水稻(Oryza sativa)
OsMADS4 (NM_001062125); 太 行 花 (Taihangia
rupestris) TrPI (CAB42988); 夏堇(Torenia fournieri)
TofoDEF (BAG24492); 烟草 (Nicotiana tabacum)
NTGLO (CAA48142); 玉米 (Zea mays) Zmm16
(AJ292959); 爪唇兰 (Gongora galeata) GogaDEF
(ACR16038)。

1.2.3 CaspAP3和CaspPI基因表达的组织特异性
分别提取黄金树的茎、幼叶、成熟叶、13 mm长花芽
(萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊)、蒴果和种子的总RNA, 用
DNase I去除总RNA样品中的微量DNA。第1链cDNA
的合成方法同1.2.1节。半定量PCR实验引物为RTac-
tinF和RTactinR、RTAP3F和RTAP3R、RTPIF和
RTPIR (表1)。PCR使用高保真Ex-Taq DNA聚合酶
(TaKaRa, Japan)。PCR反应程序: 94°C预变性5分钟;
94°C45秒, 57°C45秒, 72°C45秒, 25个循环; 72°C延
伸10分钟。每个植物组织设3个生物学重复, 且每个
cDNA样品设3个重复。反应结束后, 对产物进行琼脂
212 植物学报 51(2) 2016
糖凝胶电泳检测。

1.2.4 CaspAP3和CaspPI基因在花不同发育时期
花瓣和雄蕊中的表达量检测
将所采集的不同长度花芽(表2)用FAA固定, 逐次通过
70%、85%、95%、100%浓度梯度的乙醇脱水, 然后
依次经二甲苯:无水乙醇(1:1, v/v)、二甲苯透明, 将样
品取出后进行浸蜡和包埋处理。使用Leica RM2016
切片机切片, 切片厚度为6 μm, 固绿染色后在Leica
DM6000B显微镜下观察和拍照; 并使用尼康S9100
进行花器官形态拍照。
分别提取不同长度(表2)花芽的花瓣和雄蕊总
RNA。每个阶段的花芽设3个生物学重复。用DNase I
反应30分钟, 消化DNA。然后, 用M-MLV反转录酶将
RNA反转录成cDNA。使用Oligo 6设计实时荧光定量
PCR的引物, 分别为qRTactinF和qRTactinR、qRT-
AP3F和qRTAP3R、qRTPIF和qRTPIR (表1)。利用凯
杰Rotor-gene-Q Real-time PCR Detection System
(参考KAPA SYBR FAST Universal qPCR说明书), 采
用3步法进行qRT-PCR扩增 , 每个反应重复3次。
qRT-PCR反应程序: 94°C预变性3分钟; 94°C20秒,
55°C20秒, 72°C20秒, 40个循环; 之后将温度降至
60°C, 预溶解90秒, 然后以每秒1.0°C升至95°C, 每
升温1.0°C后, 保持5秒。
采用2–∆∆Ct方法(Livak and Schmittgen, 2001)分
别计算CaspAP3和CaspPI基因在花分化时期的混合
花芽、花芽延伸期至开花阶段的花瓣和雄蕊中的表达
量。在研究不同时期CaspAP3和CaspPI基因的相对表
达量时, 将该基因在5 mm花芽雄蕊中的表达量设为
对照, 其它时期设为不同处理。利用公式分别计算其
它不同时期黄金树花瓣、雄蕊中CaspAP3和CaspPI
基因的2−∆∆Ct值。
∆∆Ct=(CtTarget–CtActin)处理–(CtTarget–CtActin)对照
以上数据均使用Rotor-gene Q Series (Qiagen)
软件进行分析。
2 结果与讨论
2.1 CaspAP3和CaspPI基因的克隆
采用同源克隆技术, 分离得到包含黄金树CaspAP3和

表2 黄金树的花芽长度
Table 2 The size of the flower buds of Catalpa speciosa
Length of flower
buds (mm)
The stages and morphology of
C. speciosa
1−3 In early stage of floral buds formation, the
petals and stamens differentiated and
elongated rapidly
4−13 At flower buds elongation stage, the size
of petals and stamens increased rapidly
30−55 At flowering phase, the stamens reached
mature stage, and the petals completely
opened


CaspPI基因完整开放阅读框的cDNA序列。 分析结果
表明, CaspAP3基因cDNA序列的完整开放阅读框为
696 bp, 编码231个氨基酸残基。通过在NCBI网站中
BLAST比对发现, 它与MADS-box家族中euAP3分支
成员的序列相似性最高, 在NCBI上的序列登录号为
KP876026。而CaspPI基因cDNA序列的完整开放阅
读框为639 bp, 编码212个氨基酸残基, 序列登录号
为KP876027。
2.2 CaspAP3和CaspPI的分子系统发生分析和
蛋白质序列同源比对
分子系统发生(图1)分析表明: CaspAP3聚类于AP3/
DEF进化支; 而CaspPI聚类于PI/GLO进化支。蛋白质
序列同源比对(图2)分析表明, CaspAP3和CaspPI均
属于B类MADS-box家族成员, 包含MADS结构域、I
区、K区和C区。CaspAP3的M区有57个氨基酸残基, I
区有29个氨基酸残基, K区有82个氨基酸残基, C区有
63个氨基酸残基, 其中C末端的转录激活区含有2个
保守的euAP3基序和PI-derived基序; 而CaspPI的M
区有59个氨基酸残基, I区有27个氨基酸残基, K区有
82个氨基酸残基, C区有55个氨基酸残基, 其中C末端
的转录激活区包含保守的PI基序。
2.3 CaspAP3和CaspPI基因表达的组织特异性
用半定量RT-PCR技术分别检测CaspAP3和CaspPI
基因在黄金树的茎、幼叶、成熟叶、萼片、花瓣、雄蕊、
雌蕊、蒴果和种子9种组织中表达的组织特异性(图3),
以Actin作为内参基因。结果表明, CaspAP3和CaspPI
基因均在黄金树的花瓣和雄蕊中表达, 而在茎、幼叶、
景丹龙等: 黄金树 B类MADS-box基因表达特征分析 213


图1 AP3和PI亚家族基因分子系统发生分析

Figure 1 Phylogenetic analysis of AP3 and PI subfamily

图2 CaspAP3和CaspPI基因编码的氨基酸序列与AP3和PI亚家族相关蛋白质序列的比较
比对中的第1个下划线区域表示MADS结构域, 第2个下划线表示K区, 在M区和K区之间的是I区, PI-derived、euAP3和PI基序用黑框
标出。

Figure 2 Comparison of deduced amino acid sequences encoded by CaspAP3 and CaspPI, and related members of AP3 and
PI subfamily
The first underlined regions represent the MADS domain and the second K domain, the region between the MADS- and
K-domain is I domain. The PI-derived motif, euAP3 motif and PI motif are boxed.
214 植物学报 51(2) 2016


图3 黄金树不同组织中CaspAP3和CaspPI基因的半定量
RT-PCR分析
ste: 茎; j-le: 幼叶; m-le: 成熟叶; sep: 萼片; pet: 花瓣; sta:
雄蕊; car: 雌蕊; cap: 蒴果; see: 种子

Figure 3 Semi-quantitative RT-PCR of CaspAP3 and
CaspPI gene in different tissues of Catalpa speciosa
ste: Stem; j-le: Juvenile-leaf; m-le: Mature leaves; sep: Sepal;
pet: Petal; sta: Stamen; car: Carpel; cap: Capsule; see: Seed

成熟叶、萼片、雌蕊、蒴果和种子中不表达。
2.4 CaspAP3和CaspPI基因在花瓣和雄蕊发育
过程中的表达变化
采用qRT-PCR对CaspAP3和CaspPI基因表达进行分
析, 结果表明, 这2个基因在黄金树的花瓣和雄蕊原
基分化期至开花期均有表达(图4, 图5)。在黄金树花
原基早期分化阶段(图4A−C), CaspAP3和CaspPI基
因的表达量均迅速上升(图5A), 此时花瓣和雄蕊迅速
分化和发育(图4D−F)。在开花阶段(图4G, H), Cas-
pAP3和CaspPI基因在花瓣中的表达高峰均出现在30
mm的花芽中(图5B), 此时的花瓣正在快速伸长。
CaspAP3基因在雄蕊中表达高峰出现的时间早于花
瓣; 同时CaspPI基因在雄蕊中表达高峰出现的时间
也早于花瓣(图5B)。
2.5 讨论
本研究结果表明, 黄金树CaspAP3和CaspPI基因均
属于B类MADS-box基因。蛋白质同源比对与分子系统
发生分析表明, CaspAP3聚类于AP3/DEF进化支, 而
CaspPI聚类于PI/GLO进化支。AP3/PI基因及其同源
基因在生物演化过程中扮演选择基因的角色, 来自共
同的祖先基因(Theissen et al., 2000; Kim et al., 2004;
Hernández-Hernández et al., 2007)。这个祖先基因



图4 黄金树花器官的形态学观察
(A)−(C) 1−3 mm的花芽, 刚分化出的花瓣和雄蕊; (D)−(F) 4−13 mm花芽的快速生长期; (G), (H) 30−55 mm的开花期花芽。pe: 花
瓣; sta: 雄蕊。Bar=500 μm

Figure 4 The characterization of the floral organ in Catalpa speciosa
(A)−(C) The flower buds of 1−3 mm, the newly differentiated petal and stamen; (D)−(F) The flower buds of 4−13 mm, the sizes of
petal and stamen increased rapidly; (G), (H) The flower buds of 30−55 mm, the petal and stamen reached mature stage, and the
flowers reached anthesis. pe: Petal; sta: Stamen. Bar=500 μm
景丹龙等: 黄金树 B类MADS-box基因表达特征分析 215


图5 黄金树CaspAP3和CaspPI基因在花芽不同发育时期的表
达量
(A) CaspAP3和CaspPI基因在黄金树花芽分化时期的相对表达
量; (B) CaspAP3和CaspPI基因在花芽延伸和开花时期的相对表
达量

Figure 5 Quantitative real-time PCR analysis of CaspAP3
and CaspPI expressed in floral buds of Catalpa speciosa at
different developmental stages
(A) Relative expression patterns of CaspAP3 and CaspPI at
differentiation stage of flowers; (B) Relative expression pat-
terns of CaspAP3 and CaspPI at elongation and flowering
stages of flowers


经过1次基因复制事件产生paleoAP3和PI基因, 而
paleoAP3基因经过再一次基因复制事件产生euAP3
和TM6基因(Kramer et al., 1998)。此结论在本研究的
AP3/PI同源蛋白质序列聚类中也被很好地展示(图2)。
真双子叶植物中euAP3和PI直系同源基因的表达异常
会导致花器官的同源异型转变。例如, 拟南芥AP3或
者PI基因缺失表达导致雄蕊缺失, 同时花瓣转化为萼
片(Goto and Meyerowitz, 1994)。而基部被子植物中
的paleoAP3和PI同源基因通过基因复制事件, 导致
基因的亚功能和非功能化产生。同时, 在决定器官形
成方面, ABCDE基因编码具有保守性MADS结构域的
转录因子, 根据各自的蛋白质结构形成蛋白质二聚体
与靶基因调控区的CArG元件(CC(A/T)6GG)特异性结
合(Riechmann et al., 1996), 然后2个蛋白质二聚体
通过C末端形成异源四聚体, 从而激活或抑制靶基因
的表达, 进而控制不同花器官的特性。在拟南芥中,
AP1-AP3-PI-SEP决定花瓣的形成, AP3-PI-AG-SEP
决定雄蕊的形成(Theissen and Saedler, 2001)。
在黄金树的花发育过程中, CaspAP3和CaspPI基
因均在黄金树的花瓣和雄蕊中表达。不同类型的植物
B类基因的表达模式不同。真双子叶模式植物拟南芥
和金鱼草的B类基因主要在花瓣和雄蕊中表达, 与本
研究中黄金树B类MADS-box基因的表达组织特异性
一致。在一些基部被子植物中, 由于AP3/PI同源基因
在相邻花器官中表达的“边界衰退”, 导致花被呈现
梯形变化, 即外轮的花被片类似苞片, 而最内轮的花
被片类似雄蕊, 如八角属(Illicium)和无油樟属(Cin-
namomum)植物 (Kim et al., 2005; Soltis et al.,
2007)。但是, 单子叶植物郁金香(Tulipa gesneriana)、
百合花和百子莲(Agapanthus africanus)等的B类基因
表达区向外“边界平移”, 导致花被片无花萼与花瓣
之分, 均为花瓣状结构(Bowman, 1997; Kramer et al.,
2003)。本研究中黄金树的B类MADS-box基因的表达
模式与这些基部被子植物和单子叶植物存在明显差
异。
在黄金树的花发育过程中, CaspAP3和CaspPI基
因的表达量与花瓣和雄蕊的分化、生长及成熟密切相
关。CaspAP3和CaspPI基因在黄金树的花瓣和雄蕊原
基分化期至成熟期均有表达。在开花阶段, CaspAP3
和CaspPI基因在花瓣中的表达高峰均出现在30 mm
的花芽中; 通过形态学观察, 此时的花瓣正迅速伸
长。这说明CaspAP3和CaspPI基因的表达与花瓣和雄
蕊的形态发育阶段相吻合。在其它相关研究中, 红花
玉兰(Magnolia wufengensis)的MAwuAP3_1/2基因
在花芽分化和开花期表达较高, 而在花芽休眠期表达
很低或者不表达(Jing et al., 2014)。百合的LMADS8
和LMADS9基因在花芽的早期发育阶段明显高于成熟
216 植物学报 51(2) 2016
期(Chen et al., 2012)。而重瓣楸树(Catalpa bungei)
花发育各阶段的CabuPI基因表达与单瓣楸树存在明
显差异(Jing et al., 2015)。这些研究结果与本研究结
论类似, 说明在花发育过程中B类MADS-box基因的
表达水平与花瓣、雄蕊的生长和发育状态保持一致。
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Expression Analysis of B-class MADS-box Genes from
Catalpa speciosa
Danlong Jing, Yan Xia, Shougong Zhang, Junhui Wang*
Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State Forestry Administration, China Forest Genetic Resource, Research
Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China
Abstract The cDNA sequence of B-class MADS-box genes CaspAP3 and CaspPI involved in flower development were
isolated from the flower bud of Catalpa speciosa by homology cloning. The open reading frame (ORF) of CaspAP3 was
696 bp, encoding 231 amino acids, and the ORF of CaspPI was 639 bp, encoding 212 amino acids. Molecular phylogeny
analysis and protein sequence alignment suggested that CaspAP3 groups with the AP3/DEF lineages and the C domain
of CaspAP3 contained two conserved motifs, euAP3 and PI-derived motifs. However, CaspPI grouped with the PI/GLO
lineages, and the C domain of CaspPI contained a conserved PI motif. CaspAP3 and CaspPI mRNA expression was
mainly concentrated in petals and stamens but occurred at the primordium to mature stages of petals and stamens during
morphological differentiation of organs. The expression of both factors peaked earlier in stamens than in petals, and the
peak expression for both in petals appeared at the stage of rapid elongation. Meanwhile, the time of expression was the
same with morphological differentiation of petals and stamens.
Key words Catalpa speciosa, flower development, B-class MADS-box genes, gene cloning, the expression of gene
Jing DL, Xia Y, Zhang SG, Wang JH (2016). Expression analysis of B-class MADS-box genes from Catalpa speciosa.
Chin Bull Bot 51, 210–217.
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* Author for correspondence. E-mail: wangjh@caf.ac.cn
(责任编辑: 白羽红)