全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2013, 48 (3): 303–312, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2013.00303
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收稿日期: 2013-02-01; 接受日期 2013-04-12
基金项目: 国家自然科学基金(No.31070242)、教育部博士点基金(No.20114407110006)及广东省领军人才专项(粤人才办[2010] 1号)
† 共同第一作者。
* 通讯作者。 E-mail: lishsh@scnu.edu.cn
Cu2+对拟南芥根的局部毒性及诱导DNA损伤和细胞死亡
魏志琴1, 2†, 陈志勇2†, 秦蓉2, 王宇涛2, 李韶山2*
1遵义师范学院生命科学学院, 遵义 563002
2华南师范大学生命科学学院, 生态与环境科学广东省高校重点实验室, 广州 510631
摘要 该文探讨了不同浓度的Cu2+胁迫对拟南芥(Arabidopsis thaliana)根生长、活性氧(ROS)积累、抗氧化酶活性、质膜
完整性和细胞活性的影响, 通过分根实验初步分析了Cu2+毒性效应的影响范围。结果表明, Cu2+胁迫可显著抑制拟南芥主根
伸长, 诱导ROS积累及DNA损伤, 促发抗氧化酶活性升高, 破坏质膜完整性, 且Cu2+浓度越高, 毒性效应越明显, 在高浓
度Cu2+胁迫下细胞活性显著降低。分析各参数之间的关系, 表明ROS的积累与超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、
过氧化物酶(POD)及抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性呈显著正相关; ROS积累与DNA损伤、质膜完整性、细胞活性之间具
有显著的近线性关系。分根实验结果表明, 只有在添加重金属Cu2+(75 μmol·L–1)一侧培养基中的根生长受抑制, 并出现
ROS积累、细胞死亡, 暗示Cu2+对拟南芥根系的局部毒性效应可能是由于ROS的局部性积累导致受胁迫根系一侧的细胞死
亡所引起的。
关键词 拟南芥, 细胞死亡, 重金属, 局部毒性
魏志琴, 陈志勇, 秦蓉, 王宇涛, 李韶山 (2013). Cu2+对拟南芥根的局部毒性及诱导DNA损伤和细胞死亡. 植物学报 48,
303–312.
铜(Cu)是植物正常生命活动所必需的微量矿质
元素, 是多种调节蛋白和氧化还原酶的组成部分, 广
泛参与植物生长发育过程中的多种代谢反应
(Schützendübel and Polle, 2002)。然而, 当Cu2+浓
度超过一定范围时, 则会对植物产生严重的毒害作
用, 使植物代谢紊乱, 生长发育受阻, 甚至导致植物
死亡(王庆仁等, 2001)。Cu2+对植物的毒害作用表现
为通过Fenton反应诱导产生活性氧(reactive oxygen
species, ROS) (Rana, 2008)。在细胞正常代谢过程
中, 细胞内ROS的产生和清除处于一种动态平衡, 不
会对细胞产生伤害; 但当ROS的产生大于清除时, 则
会导致氧化胁迫。ROS可诱导DNA损伤、氧化蛋白质
和脂类, 造成生物膜透性增大, 导致酶失活及基因突
变等(Ott et al., 2007)。Cu2+胁迫对拟南芥细胞氧化还
原平衡的影响与氧化信号和损伤有关(Cuypers et al.,
2011)。在任何时候, 细胞内的ROS水平都决定着细
胞的命运, ROS在低水平时能够诱导程序性细胞死亡
(programmed cell death, PCD); 在高水平时则加速
细胞坏死或者导致程序性细胞死亡定型细胞转向类
坏死(Fleury et al., 2002)。此外, 近年来的研究表明,
ROS也是生物开启防御机制的重要信号(Pitzschke
et al., 2006), 它能够通过诱导抗氧化酶, 如超氧化物
歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶
(catalase, CAT)、过氧化物酶(peroxidase, POD)、抗
坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)等的
活性变化来响应氧化胁迫(Drążkiewicz et al., 2004)。
单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis,
SCGE)是一种快速检测单细胞DNA损伤的细胞分子
生物学实验技术, 已广泛应用于检测分析重金属对植
物DNA的损伤程度(Li et al., 2008)。很多研究表明,
重金属Cu2+能够损伤植物DNA。例如, Cu2+胁迫能够
诱导拟南芥(Arabidopsis thaliana)细胞的原生质体
(聂志刚等, 2009)、豌豆(Pisum sativum)根(Hattab et
al., 2009)细胞的DNA损伤、水稻(Oryza sativa)根细
胞的DNA断裂(Hung et al., 2007)。此外, 细胞质膜作
为控制离子进出细胞的重要屏障, 其完整性被用作定
·研究报告·
304 植物学报 48(3) 2013
义细胞活性的一个标准 (Machado and Soares,
2012)。过量的Cu2+能够诱导细胞质膜氧化损伤, 破
坏膜的完整性及细胞内的离子平衡(Janicka-Russak
et al., 2012)。
分根实验是通过局部控制外界环境来分析植物
根及其作用机理的一种方法。Gansel等(2001)通过分
根实验, 局部控制拟南芥根的氮素营养, 探讨了6周
龄的拟南芥根系在不同氮素营养条件下, 植物的氮素
营养信号。Vert等(2003)通过分根实验揭示了整株植
物对根高亲和性铁(Fe)吸收系统的信号调节。但目前
通过分根实验来研究重金属对植物根毒性的报道并
不多见。虽然已有学者通过分根实验来探究Cu2+对拟
南芥根系生长的影响, 发现Cu2+对根的毒性效应可能
主要表现为局部性影响(Lequeux et al., 2010)。但这
一局部性影响尚需要进一步的实验来验证和阐释。
本研究通过探讨Cu2+胁迫对拟南芥根生长、DNA
损伤、ROS积累、抗氧化酶活性、质膜完整性及细胞
活性的影响, 并分析这些指标之间的相关性, 进而揭
示Cu2+对植物根的毒害机理。另一方面, 通过分根实
验初步揭示Cu2+毒性效应的影响范围, 进一步阐明
Cu2+胁迫对根的ROS积累和细胞死亡是局部性影
响, 这些结果为深入研究Cu2+毒害的分子机制奠定了
基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料及培养
拟南芥(Arabidopsis thaliana L. Heynh.)为哥伦比亚
生态型(Columbia-0)。以1/2MS为基本培养基, 添加
3%蔗糖和1%琼脂, 再额外添加CuSO4, 使得Cu2+浓
度分别为0、25、50、75和100 μmol·L–1, 调节pH值
至5.8。将拟南芥野生型种子于4°C黑暗条件下春化处
理3天, 经5%次氯酸钠溶液消毒10分钟后, 用无菌水
冲洗4次。将种子种植在含有不同浓度Cu2+的培养基
上, 用封口膜封口后, 转移到温室中垂直培养。培养
条件为: 温度22°C, 相对湿度80%, 光周期为16小时
光照/8小时黑暗, 光合有效辐射(photo-synthetically
active radiation, PAR)强度为 100 µmol·m–2·s–1
(Quantithern Light Meter, Hansatech, 英国)。取植
株的根作为实验材料, 进行相关指标测定。
1.2 主根长度的测定
分别在材料培养至4、6、8、10、12、14天时进行拍
照, 根据所得图片并应用ImageJ软件测定主根长度。
1.3 DNA损伤的单细胞凝胶电泳检测
DNA损伤的单细胞凝胶电泳检测方法参照本实验室
已发表的文献(Jiang et al., 2007; 聂志刚等, 2009)并
稍做修改。铺制第1层胶: 将洁净载玻片垂直浸入1%
正常熔点琼脂糖(NMPA)溶液中, 取出后水平放置,
干燥过夜。分别切取对照组和不同浓度Cu2+处理组
(胁迫14天)拟南芥根在冰上冷冻, 加入500 μL细胞核
提取缓冲液(Galbraith’s buffer: 45 mmol·L–1 MgCl2·
6H2O, 30 mmol·L–1C6H5Na3O7·2H2O, 20 mmol·L–1
MOPS, 0.1% Triton X-100, pH 7.0), 用刀片迅速将
其充分切碎, 经600目筛过滤后得细胞核悬液。将50
μL细胞核悬液和50 μL1%低熔点琼脂糖(LMAP)于
37°C充分混匀后, 滴加到已铺制好第1层胶的载玻片
上, 于4°C水平静置30分钟。然后将上述制片放入裂
解 液 (2.5 mol·L–1NaCl, 0.1 mol·L–1EDTA, 0.01
μmol·L–1 Tris-HCl, 1% Triton X-100, pH10)中, 4°C
避光裂解1小时。用超纯水冲洗玻片后再将其放入4°C
预冷的碱性电泳缓冲液(0.03 mol·L–1NaOH, 0.001
mol·L–1EDTA, pH>13)中浸泡30分钟, 以使DNA变性
解螺旋, 之后于4°C下电泳30分钟(19 V, 300 mA)。电
泳结束后, 用0.4 mol·L–1Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中和
3次后放入预冷的无水乙醇中浸泡5分钟。待制片自然
干燥后 , 加30 μL10 000倍稀释的荧光染料SYBR
Gold (Molecular Probe, 美国), 染色5分钟。在荧光
显微镜(Nikon ECLIPSE 50i, 日本)下观察并拍照。每
组随机选取25个彗星图像, 用CASP软件定量分析,
并以OTM值 (Olive tail moment)表示DNA的损伤
程度。
1.4 活性氧的测定
活性氧的测定参照Jiang等(2011)的方法并稍做修改。
将培养基中培养14天的拟南芥幼苗根用缓冲液冲洗
干净, 用最终浓度为10 μmol·L–12′,7′-二氯二氢荧光
素二乙酯(CM-H2DCFDA)荧光染料标记10分钟, 然
后在缓冲液中漂洗5分钟, 以充分消除背景。将处理
好的样品置于荧光显微镜(Nikon ECLIPSE 50i, 日
魏志琴等: Cu2+对拟南芥根的局部毒性及诱导 DNA损伤和细胞死亡 305
本)下观察并拍照。
1.5 细胞活性的测定
细胞活性参照Lequeux等(2010)的方法进行测定。
1.6 抗氧化酶活性的测定
抗氧化酶SOD、CAT、POD、APX的提取及活性测
定参照Tang等(2010)的方法。蛋白质含量的测定参照
Bradford(1976)的方法。以每毫克酶蛋白表示酶活性。
1.7 细胞质膜完整性的测定
细胞质膜完整性的测定参照Baker和Mock(1994)的
方法。
1.8 分根实验
分根实验参照Lequeux等(2010)的方法并稍做修改。
将额外添加的Cu2+(浓度分别为0和75 μmol·L–1)与
1/2MS培养基分别放入同一个培养皿中。培养皿中的
培养基分为两部分: 一部分培养基含有额外添加的
75 μmol·L–1Cu2+; 另一部分是1/2MS基本培养基(没
有额外添加Cu2+)。拟南芥在不同浓度的培养基中生
长14天后, 把幼苗的主根剪掉, 只保留最初生长的两
侧根, 将两侧根分开, 分别置于不同的培养基中生长
5天后进行观察并拍照, 然后取根进行ROS测定及细
胞活性测定。
1.9 数据统计
实验中数据均采用Excel统计标准差。通过单因素方
差分析(One-way ANOVA)、LSD多重比较和Pearson
相关系数评价检验对比数据差异是否显著以及不同
因子间的相关关系。
2 结果与讨论
2.1 Cu2+胁迫对主根生长的影响
在实验过程中, 拟南芥主根在25 μmol·L–1Cu2+胁迫
下其长度与对照组相比无显著差异(P>0.05)。在高浓
度(50、75和100 μmol·L–1) Cu2+胁迫下, 拟南芥主根
长度显著缩短, 与对照组相比差异显著(P<0.05), 且
抑制作用随Cu2+浓度的升高而加剧(图1)。主根长度与


图1 Cu2+胁迫对拟南芥幼苗主根生长的影响
(A) 不同浓度Cu2+胁迫14天后拟南芥幼苗主根(Bar=1 cm); (B)
Cu2+胁迫下拟南芥幼苗主根长度(不同字母代表在0.05水平上
差异显著)

Figure 1 Primary root length of Arabidopsis seedlings after
Cu2+ exposure
(A) Primary root length of seedlings after 14 days of Cu2+
exposure (Bar=1 cm); (B) Primary root length of seedlings
after Cu2+ exposure (Different letters on the bar indicate the
values were significantly different at the P<0.05 level)


Cu2+浓度之间存在显著的负相关关系(r=–0.942, P<
0.05, n=15)。
2.2 Cu2+胁迫诱导根DNA损伤
图2A为不同浓度Cu2+胁迫14天对拟南芥根细胞核
DNA损伤的单细胞凝胶电泳荧光图。收集植物细胞核
悬液进行彗星电泳, 增加了该实验的效率和敏感度。
如图2A所示, 随着Cu2+浓度的增大, 彗星的彗尾也
逐渐增加, 表明Cu2+胁迫对拟南芥根DNA的损伤存
在浓度效应。即随着处理浓度的增大, 根细胞内DNA
损伤量增大。以OTM (Olive tail moment)代表DNA
损伤量, 经分析得出各处理组的OTM值明显高于对
306 植物学报 48(3) 2013



图2 Cu2+胁迫14天对拟南芥根细胞DNA损伤的影响
(A) 单细胞凝胶电泳荧光图像; (B) 以OTM值(Olive tail mo-
ment)作为DNA损伤量(不同字母代表在0.05水平上差异显著)

Figure 2 DNA damage of Arabidopsis root cells after 14
days of Cu2+ exposure
(A) Fluorescence images of single cell gel electrophoresis
(SCGE); (B) The OTM (Olive tail moment) was used as the
metric for DNA damage (Different letters on the bar indicate
the values were significantly different at the P<0.05 level)


照组, 差异达到显著水平, 且Cu2+的浓度与根细胞
OTM值呈极显著正相关(r=0.956, P<0.01, n=15) (图
2B)。
2.3 Cu2+胁迫诱导根活性氧积累
如图3所示, 用10 μmol·L–1CM-H2DCFDA对根进行
染色 , 绿色荧光强度表示 ROS积累水平。 25
μmol·L–1Cu2+胁迫14天后, 根内ROS含量较低, 与对
照组相比无显著差异(P>0.05)。在高浓度(50、75和
100 μmol·L–1)Cu2+胁迫14天后, 显示荧光强度增加,
且荧光强度随Cu2+浓度的升高而增大, 与对照组相比
差异均达显著水平(P<0.05)。后续分析表明, ROS积
累与DNA损伤、质膜完整性及细胞死亡率均呈显著正
相关(表1)。



图3 Cu2+胁迫14天对拟南芥根活性氧(ROS)积累的影响
(A) CM-H2DCFDA (10 μmol·L–1)染色10分钟后的荧光图像;
(B) ROS相对荧光强度(%), 设定对照组的荧光强度为100%(不
同字母代表在0.05水平上差异显著)

Figure 3 Reactive oxygen species (ROS) accumulation of
Arabidopsis roots after 14 days of Cu2+ exposure
(A) Fluorescence images after staining with CM-H2DCFDA
(10 μmol·L–1) for 10 min; (B) The ROS relative fluorescence
intensity (%), fluorescence intensity of control was 100%
(Different letters on the bar indicate the values were signifi-
cantly different at the P<0.05 level)

2.4 Cu2+胁迫对根抗氧化酶活性的影响
Cu2+胁迫14天后, 与对照组相比, 拟南芥根中4种抗
氧化酶活性均表现不同程度的升高。随着Cu2+浓度的
增加, 拟南芥根SOD活性相应增加, 各处理组与对照
组相比均差异显著(P<0.05) (图4A)。CAT活性随着
Cu2+浓度的增加而升高, 与对照组相比, 除25 μmol·
L–1Cu2+处理组差异不显著外(P>0.05), 其它浓度
Cu2+处理组均具有显著差异(P<0.05) (图4B)。25、50、
75和100 μmol·L–1 Cu2+胁迫14天后, 拟南芥根的
POD活性与对照组相比均差异显著(P<0.05), 比对
照组分别增加了14.2%、20.5%、21.9%和25.9%(图
4C)。随着Cu2+浓度增加, APX活性逐渐增加, 25和50
魏志琴等: Cu2+对拟南芥根的局部毒性及诱导 DNA损伤和细胞死亡 307
表1 Cu2+胁迫下拟南芥根不同参数之间的线性关系
Table 1 Correlation coefficients between different parameters of Cu2+ treatment of Arabidopsis roots
* P<0.05; ** P<0.01。PRL: 主根长度; DD: DNA损伤量; RRF: 活性氧相对荧光强度(%); CDRF: 细胞死亡相对荧光强度(%); EBU:
伊文斯蓝吸收值; SOD: 超氧化物歧化酶活性; CAT: 过氧化氢酶活性; POD: 过氧化物酶活性; APX: 抗坏血酸过氧化物酶活性
* P<0.05; ** P<0.01. PRL: Primary root length; DD: DNA damage; RRF: Reactive oxygen species relative fluorescence intensity
(%); CDRF: Cell death relative fluorescence intensity (%); EBU: Evans blue uptake; SOD: Superoxide dismutase activity; CAT:
Catalase activity; POD: Peroxidase activity; APX: Ascorbate peroxidase activity




图4 Cu2+胁迫14天对拟南芥根抗氧化酶活性和质膜完整性的影响(不同字母代表在0.05水平上差异显著)
(A) 超氧化物歧化酶; (B) 过氧化氢酶; (C) 过氧化物酶; (D) 抗坏血酸过氧化物酶; (E) 以伊文斯蓝吸收值表示的质膜完整性

Figure 4 Antioxidant enzyme activities and plasma membrane integrity of Arabidopsis roots after 14 days of Cu2+ exposure
(Different letters on the bar indicate the values were significantly different at the P<0.05 level)
(A) SOD; (B) CAT; (C) POD; (D) APX; (E) Evans blue uptake indicated plasma membrane integrity


μmol·L–1Cu2+胁迫时, APX的活性与对照组相比差异
不显著(P>0.05); 但75和100 μmol·L–1 Cu2+胁迫时,
APX活性与对照组相比差异显著(P<0.05) (图4D)。后
续分析表明, SOD、CAT、POD和APX活性与ROS的
积累均呈显著正相关(表1)。
2.5 Cu2+胁迫对根质膜完整性的影响
如图4E所示, 用Evans blue吸收值反映质膜完整性。
Item DD RRF CDRF EBU SOD CAT POD APX
PRL –0.948** –0.943** –0.949** –0.978** –0.976** –0.874** –0.857* –0.928**
DD 0.892** 0.983** 0.904** 0.940** 0.965** 0.763** 0.918**
RRF 0.973** 0.937** 0.925** 0.821** 0.721* 0.876**
CDRF 0.920** 0.949** 0.891** 0.699** 0.910**
EBU 0.927** 0.810** 0.823* 0.903**
SOD 0.870** 0.791** 0.914**
CAT 0.704* 0.839**
POD 0.693*
308 植物学报 48(3) 2013
Evans blue吸收值越大, 代表质膜受破坏程度越大。
结果显示, Cu2+胁迫对拟南芥根质膜完整性的影响存
在浓度效应, 即随着处理浓度的增大, 质膜完整性的
破坏程度增加。与对照组相比, 除25 μmol·L–1 Cu2+
胁迫时差异不显著外(P>0.05), 其它浓度(50、75和
100 μmol·L–1)的Cu2+胁迫处理组与对照组均差异显
著(P<0.05)。Cu2+的浓度与Evans blue吸收值呈近线
性相关(r=0.931, P<0.05, n=15)。
2.6 Cu2+胁迫对根细胞活性的影响
用3 mg·L–1碘化丙啶(PI)对根进行染色, 红色荧光显
示死亡细胞。结果显示, 25 μmol·L–1Cu2+胁迫14天后,
只能看到很弱的红色荧光; 在高浓度(50、75和100
μmol·L–1)Cu2+胁迫14天后, 红色荧光十分明显, 且荧
光强度随Cu2+浓度的升高而增加(图5A)。荧光强度的
统计学分析表明, 与对照组相比, 除25 μmol·L–1Cu2+
处理组差异不显著外(P>0.05), 其它3个浓度Cu2+处
理组均与对照组呈显著差异(P<0.05) (图5B)。
2.7 Cu2+对根的局部毒性
将生长14天的拟南芥幼苗最初长出的两侧根分开,
分别定植于不同的培养基中生长5天后, 观察根生长
并检测ROS积累和细胞死亡情况。分根实验结果如图
6所示。当两侧根都定植于没有额外添加Cu2+的培养
基时, 均能正常生长, 并且长出了很多新的根, 两侧
根的ROS染色及细胞活性染色均呈现微弱荧光(图
6A)。当一侧根定植于额外添加75 μmol·L–1Cu2+的培
养基中, 另一侧根定植于没有额外添加Cu2+的培养基
中时, 75 μmol·L–1Cu2+胁迫下的侧根生长受到明显抑
制, ROS染色及细胞活性染色均能清楚地观察到很亮
的荧光, 而在没有额外添加Cu2+的培养基中的侧根能
够正常生长, ROS及细胞活性染色只能观察到微弱的
荧光(图6B)。当两侧根都定植于含75 μmol·L–1Cu2+
的培养基中时, 两侧根的生长都受到明显抑制, 且
ROS及细胞活性染色都能观察到很亮的荧光(图6C)。
上述结果表明, Cu2+对拟南芥根的毒害可能是局部性
的, 且根生长受抑制、ROS积累、细胞死亡具有同步
性。
2.8 讨论
根系通常是高等植物直接受到重金属毒害的主要器
官。以往研究结果表明, Cu2+影响植物的生长, 尤其
是根的生长(Wisniewski and Dickinson, 2003; Le-
queux et al., 2010)。其作用方式主要有以下几个方
面 : (1) 抑制根尖细胞分裂或根伸长(Kopittke and
Menzies, 2006); (2) 影响激素分布或细胞死亡
(Lequeux et al., 2010); (3) 改变营养元素的易位及
渗透(Murphy and Taiz, 1997)。Lequeux等(2010)研
究发现, 在低浓度(2.5和5 μmol·L–1)Cu2+胁迫时, 处
理组与对照组根生长无显著差异, 并指出在较低浓度
的重金属处理时, 根能够接受一种新的生长平衡来应
对重金属胁迫。本实验结果也表明 , 在低浓度(25
μmol·L–1) Cu2+胁迫下, 处理组与对照组相比根生长
无显著差异。然而高浓度(50、75和100 μmol·L–1)
Cu2+胁迫时, 根的生长明显被抑制(图1)。说明此时
Cu2+对植物的毒害已超过了其自身防御能力, 而且高
浓度Cu2+胁迫还伴随着ROS的积累(图3, 图6)及细胞
死亡(图5, 图6)。因此可以认为根生长的抑制可能是
由于ROS的积累导致细胞死亡引起的。
植物在生长过程中可通过光合、呼吸等过程产生
ROS, 它是机体代谢过程中产生的重要自由基, 如超
氧阴离子(O2–·)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(·OH)及
单线态氧(1O2)等。 植物本身具有的酶促系统(主要是
SOD、POD、CAT和APX)对ROS的防御能力非常重
要。在正常情况下, 酶促系统维持细胞内很低的ROS
水平, 不会对植物体造成伤害(Mutlu et al., 2009)。然
而, 当植物受到环境胁迫时, 比如生物必需重金属
(如Cu2+)或非必需重金属(如Cd2+)胁迫, 都会快速诱
导细胞产生过量的ROS, 这是植物在各种非生物胁
迫下的最早反应(Bhattacharjee, 2005)。当植物细胞
不能及时还原过量的ROS时, 便会产生氧化胁迫(杨
野等 , 2010)。孙胜等 (2010)的研究表明 , 西瓜
(Citrullus lanatus)叶片中超氧阴离子自由基产生速
率、过氧化氢含量随着土壤中Cd2+浓度的升高而增加,
且过氧化氢含量与Cd2 +浓度呈极显著正相关 (P<
0.01)。李建宏等(2004)发现, 随着Cd2+浓度的升高,
椭圆小球藻细胞内超氧阴离子含量大幅增加, 从而影
响细胞的正常生理代谢活动。Liu等(2012)的研究表
明, 重金属Pb2+、Cd2+和Cu2+能够导致细叶榕(Ficus
microcarpa)气生根中ROS过量累积。Schützendü-
bel和Polle(2002)则指出Cu2+毒害的一个重要特征是
产生氧化胁迫, 促使植物形成有害的ROS, 并诱发脂
魏志琴等: Cu2+对拟南芥根的局部毒性及诱导 DNA损伤和细胞死亡 309


图5 Cu2+胁迫14天对拟南芥根细胞活性的影响
(A) 用碘化丙啶(PI) (3 mg·L–1)染色10分钟后的荧光图像; (B)
细胞活性的相对荧光强度(设定对照组的荧光强度为100%, 不
同字母代表在0.05水平上差异显著)

Figure 5 Cell viability of Arabidopsis roots after 14 days of
Cu2+ exposure
(A) Fluorescence images of roots after staining with
propidium iodide (PI) (3 mg·L–1) for 10 min; (B) Cell death
relative fluorescence intensity (%) of Arabidopsis roots
(Fluorescence intensity of control is 100%, and different
letters on the bar indicate the values were significantly dif-
ferent at the P<0.05 level)


质过氧化而破坏膜的结构和功能。本实验也证实, 在
高浓度Cu2+胁迫下, 拟南芥根内ROS代谢已处于失
调状态。本研究还发现, Cu2+胁迫诱导抗氧化酶SOD、
CAT、POD和APX活性的增加(图4A–D), 并且ROS
的积累与SOD、CAT、APX和POD的活性均呈正相
关(表1)。这是细胞对氧化胁迫的一种积极响应, 使氧
化损伤降到最低, 成为植物对Cu2+胁迫的一种防御机
制。但当植物体内积累的ROS过多时, 特别是抗氧化
酶系统没有能力还原过量的ROS时, ROS对根细胞
的毒害程度便会超过细胞对其的防御能力, 进而产生
氧化胁迫。
本实验利用一种检测重金属污染对植物遗传效



图6 Cu2+胁迫对拟南芥根的局部毒性
培养14天的幼苗最初生长的两侧根分开(黑线), 分别在不同的
培养基中生长5天后对根系形态、活性氧(ROS)积累、细胞死亡
的影响。(A) 两部分培养基都没有额外添加Cu2+(Bar=1 cm);
(B) 一半是含有75 μmol·L–1Cu2+, 另一半没有额外添加Cu2+;
(C) 两部分培养基都额外添加75 μmol·L–1Cu2+

Figure 6 Local toxicity on Arabidopsis root after Cu2+ ex-
posure
The two first emerged lateral roots (black line) of a 14 day-old
seedling were split onto two separated medium with different
concentration of Cu2+. After growth for 5 days, morphology of
root system, reactive oxygen species (ROS) accumulation,
and cell death were determined. (A) Control, both medium
compartments without extra addition of Cu2+ (Bar=1 cm); (B)
One medium compartment with extra supplementation of 75
μmol·L–1Cu2+ and the other medium compartment with normal
concentration of Cu2+; (C) Both medium compartments were
supplemented with 75 μmol·L–1Cu2+


应的快速且敏感的彗星检测方法(Li et al., 2008), 证
实Cu2+胁迫能够显著诱导拟南芥根部细胞的DNA损
伤(图2), 且Cu2+浓度与根细胞的OTM值呈显著正相
关。进一步分析表明, Cu2+胁迫诱导拟南芥根ROS的
积累与DNA的损伤呈显著正相关(表1), 说明DNA损
伤与ROS的增加密切相关。这与前文所述ROS的过
量积累导致DNA等大分子物质损伤的观点是一致的。
Schützendübel和Polle(2002)的报道也指出Cu2+胁迫
诱导DNA损伤可能是由Cu2+加速了通过自氧化和
Fenton反应产生ROS引起的。重金属通过氧化导致
310 植物学报 48(3) 2013


图7 Cu2+对拟南芥根的毒性作用

Figure 7 Overview of toxicity of Cu2+ exposure in Arabidop-
sis roots


DNA损伤(Atha et al., 2012), 改变碱基配对, 破坏糖
残基, 最终导致DNA结构被破坏、链断裂, 这种不可
逆的DNA损伤能够干扰植物的正常生长发育(Moura
et al., 2012)。重金属离子过量将导致质膜透性改变,
离子泄露增加 (李福燕等 , 2010)。Ouzounidou等
(1995)的研究表明根尖在吸收了过量的Cu2+后, 细胞
膜及多种细胞器的膜系统易受损伤。本研究结果显示,
Cu2+胁迫可严重损伤细胞质膜的完整性。进一步的分
析表明, Cu2+诱导的拟南芥根细胞质膜完整性受破
坏、ROS积累、DNA损伤、细胞死亡之间均具有显著
正相关(表1), 这种一致性与Buckner等(2000)认为
ROS的产生与积累一般与诱导细胞死亡相同步的观
点一致。同时实验表明, Cu2+胁迫诱导的DNA损伤、
质膜完整性受破坏以及细胞死亡在一定程度上是由
ROS的产生与积累引起的。
植物受到Cu2+胁迫时, Cu2+大部分积累在根部并
在根尖局部积累过多。分根实验主要是通过局部控制
外界条件来研究不同条件下植物根的一种方法, 可用
来探究根到茎的信号途径(Gansel et al., 2001)。前人
用分根实验的方法对植物进行研究主要集中在通过
改变营养元素的供给来揭示根对营养元素的吸收方
式(Gansel et al., 2001)及通过改变营养元素的吸收
来进而发现整株植物的信号调节途径(Vert et al.,
2003)。分根实验用来研究重金属对植物根的毒性仅
有少量报道, 如Lequeux等(2010)发现Cu2+对根的毒
性效应可能主要表现为局部性影响, 但分根实验中重
金属毒性的作用范围尚需进一步验证和阐释。在本研
究的分根实验中, 对照组的根生长正常, Cu2+胁迫下
根生长受抑制(图6A), 这与Lequeux等(2010)的实验
结果相一致。说明Cu2+胁迫对根系的影响可能是局部
性的。此外, 荧光染色的结果显示ROS积累及细胞死
亡只出现在受Cu2+胁迫的侧根(图6B, C), 进一步暗
示Cu2+对拟南芥根系的局部毒性效应可能是由于
ROS的“局部积累”导致受胁迫根系一侧的细胞死亡
所引起。
综上所述, 本文提出Cu2+毒害作用模型(图7)。如
图7所示: Cu2+胁迫诱导拟南芥根ROS积累, 伴随着
细胞质膜完整性受破坏、DNA损伤以及细胞死亡。
Cu2+对拟南芥根的毒性是局部性的, 这种局部毒性可
能是由于ROS的局部积累导致细胞死亡引起的。
致谢 感谢瑞典皇家科学院院士、广东省领军人才
Lars Olof Björn教授对本研究的指导。
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Cu2+ Induced Local Toxicity and DNA Damage, Cell Death in Roots
of Arabidopsis thaliana
Zhiqin Wei1, 2†, Zhiyong Chen2†, Rong Qin2, Yutao Wang 2, Shaoshan Li 2*
1School of Life Sciences, Zunyi Normal College, Zunyi 563002, China; 2Key Laboratory of Ecology and Environmental Science in
Guangdong Higher Education, School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China
Abstract We investigated the effect of different Cu2+ concentrations in the root medium on root growth, reactive oxygen
species (ROS) accumulation, antioxidative response, DNA damage, plasma membrane integrity and cell viability in roots
of Arabidopsis thaliana, and the toxicity range was explored with split-root technique. Primary root length was significantly
inhibited. Cu2+ enhanced the activities of antioxidant enzymes, induced ROS accumulation and DNA damage, and re-
duced plasma membrane integrity. Cell death was significantly increased with increased concentration of Cu2+. ROS
accumulation was significantly and positively correlated with the activities of total superoxide dismutase, catalase,
peroxidase and ascorbate peroxidase. ROS accumulation increased linearly with DNA damage, plasma membrane
integrity and cell viability. In the split-root experiment, root growth was inhibited in culture medium supplemented with 75
μmol·L–1 Cu2+; however, roots were not inhibited in medium without supplementary Cu2+. ROS accumulation and cell
death took place in only half the dish, so Cu2+ toxicity was local, not systemic. Local ROS accumulation in roots likely
mediates the cell death caused by Cu2+ stress.
Key words Arabidopsis thaliana, cell death, heavy metal, local toxicity
Wei ZQ, Chen ZY, Qin R, Wang YT, Li SS (2013). Cu2+ induced local toxicity and DNA damage, cell death in roots of
Arabidopsis thaliana. Chin Bull Bot 48, 303–312.
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† These authors contributed equally to this paper.
* Author for correspondence. E-mail: lishsh@scnu.edu.cn
(责任编辑: 白羽红)