全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2013, 48 (4): 398–410, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2013.00398
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收稿日期: 2013-01-25; 接受日期: 2013-03-12
基金项目: 国家转基因生物新品种培育重大专项(No. 2011ZX08004-004)和天津市自然科学基金(No.12JCZDJC23200)
* 通讯作者。E-mail: shuzhenmen@nankai.edu.cn
植物固醇合成途径关键基因CPI1的功能进化
马学敏1, 孙爽莉2, 杨海灵1, 门淑珍2*
1北京林业大学生物科学与技术学院生物化学与分子生物学系, 北京 100083
2南开大学生命科学学院植物生物学和生态学系, 天津 300071
摘要 固醇是真核生物膜的重要组分, 在生长发育中具有重要作用。CPI1 (CYCLOPROPYL STEROL ISOMERASE1)基
因是植物特有的固醇合成途径基因, 其编码产物为环丙基固醇异构酶。目前只有拟南芥(Arabidopsis thaliana)的CPI1基因
被克隆并解析。研究发现, 从藻类到高等开花植物中均存在单一拷贝的CPI1基因。陆生植物CPI1的基因结构及其所编码的
氨基酸序列均高度保守, 蛋白质序列相似性范围为48%–90%, 但陆生植物CPI1与绿藻CPI1的蛋白序列之间存在显著差
异。蛋白质结构预测发现CPI1具有非常相似的拓扑结构, 均具有7个跨膜结构域和6个亲水环。组织表达模式分析显示, 陆
生植物CPI1在不同组织中均表达, 是组成型表达基因。为了验证CPI1基因的功能, 克隆了二穗短柄草(Brachypodium
distachyon)BdCPI1基因, 并转化拟南芥cpi1-1突变体。结果表明, BdCPI1能完全回补cpi1-1突变体的表型。基于单拷贝基
因数目、保守的基因结构和蛋白质拓扑结构及基因表达模式, 推测CPI1基因的功能可能在陆生植物中高度保守。
关键词 CPI1基因, 功能进化, 基因表达, 突变体, 植物固醇
马学敏, 孙爽莉, 杨海灵, 门淑珍 (2013). 植物固醇合成途径关键基因CPI1的功能进化. 植物学报 48, 398–410.
固醇(又称甾醇)是真核生物细胞膜的重要成分,
有调节细胞膜的通透性和流动性的作用, 而且还能间
接影响细胞膜内蛋白质、离子通道等的分布和活性
(Hartmann, 1998; Fischer et al., 2004; Boutté et al.,
2010)。在高等植物、动物和昆虫中, 固醇还是甾醇
类激素合成的前体。植物、真菌和动物中的固醇都是
以乙酰辅酶A为前体, 在一系列酶的催化下合成的。
三者的固醇合成途径从乙酰辅酶A到环氧鲨烯
(2,3(S)-oxidosqualene)阶段是相同的。但是, 植物中
下游的合成途径与真菌和动物中的不同。在动物和真
菌中, 环氧鲨烯分子环化成羊毛脂甾醇(lanosterol),
此时固醇的骨架已形成。而在植物中则环化形成具有
环丙烷环的环阿屯醇(cycloartenol), 然后在下游途径
中再打开环丙烷环 , 形成固醇的骨架 (张喜春等 ,
2001; Rahier, 2011)。植物中催化环丙烷环打开的酶
为环丙基固醇异构酶(CYCLOPROPYL STEROL ISO-
MERASE1, CPI1), 又称环桉油醇-钝叶鼠曲草醇异
构酶(cycloeucalenol-obtusifoliol isomerase, COI)。
该酶是植物特有的酶, 也是植物固醇合成途径的一个
限速步骤(Men et al., 2008)。但是, 关于CPI1的研究
报道却相对较少 , 目前只有拟南芥 (Arabidopsis
thaliana)的CPI1基因被克隆并进行了功能研究。
Lovato等(2000)克隆了拟南芥的CPI1基因, 其编码
一个分子量为 36 kDa 的蛋白质。在大肠杆菌
(Escherichia coli)中表达CPI1基因, 其表达产物能在
体外将环桉油醇转变为钝叶鼠曲草醇。Men等(2008)
筛选到拟南芥CPI1基因的转座子插入突变体, 将其
命名为cpi1-1; RT-PCR检测结果表明该突变体中没
有CPI1基因的转录。利用GC-MS对突变体的固醇成
分进行分析, 结果表明该突变体中几种主要的植物固
醇含量几乎降为零, 并且大量积累环丙基固醇类。
cpi1-1突变体植株极其矮小, 几乎没有花序茎, 只有
几朵不育的花; 另外, cpi1-1突变体根的向重力生长
缺陷。该突变体的表型不能被外源施加油菜素甾醇
(brassinosteroid, BR)回复, 表明其严重的缺陷表型
不是由于BR缺陷引起的。进一步的研究发现, cpi1-1
突变体中胞吞作用受到抑制, 造成生长素外输载体
PIN2的极性定位不能正确建立, 从而导致根向重力
缺陷的表型(Men et al., 2008)。这些结果表明CPI1在
植物的发育中具有重要功能。Boutté等(2010)的研究
·研究报告·
马学敏等: 植物固醇合成途径关键基因 CPI1 的功能进化 399
发现 , 胞质分裂特异的囊泡融合蛋白KNOLLE在
cpi1-1突变体中的定位发生侧向扩散。在野生型拟南
芥中, KNOLLE定位在进行胞质分裂的细胞的细胞板
及其周围的囊泡中; 而在cpi1-1突变体中, KNOLLE
除了定位于以上区域外, 还定位在侧向细胞膜上。进
一步的研究发现, KNOLLE的极性定位是靠胞吞作用
维持的。目前关于CPI1基因突变后造成植株矮小的分
子机理未见报道。CPI1基因突变后, 根的分生区大小
没有受到影响; 但是, 根伸长区明显缩短, 成熟根毛
细胞的长度也显著缩短, 表明至少在根中, CPI1基因
突变主要影响细胞的伸长(Men et al., 2008)。
目前仅仅对拟南芥CPI1进行了比较详细的研究,
尚未见关于其它植物CPI1的报道。迄今除了裸子植物
外, 大量代表不同植物类群的植物物种的基因组被测
序。已测序的基因组信息有利于我们从早期的低等苔
藓植物到高等开花植物探测CPI1的拷贝数目、基因结
构等一系列信息。本研究选取了多个代表不同进化历
史且已完成全基因组测序的植物物种为研究对象, 包
括双子叶植物拟南芥、毛果杨(Populus trichocarpa),
单子叶植物水稻(Oryza sativa)、二穗短柄草(Brachy-
podium distachyon), 蕨 类 植 物 江 南 卷 柏 (Sela-
ginella moellendorffii), 苔藓植物小立碗藓 (Phys-
comitrella patens) 以及 3 种绿藻 Chlamydomonas
reinhardtii 、 Volvox carteri 和 Coccomyxa sube-
llipsoidea (The Arabidopsis Genome Initiative,
2000; Goff et al., 2002; Tuskan et al., 2006; Mer-
chant et al., 2007; Rensing et al., 2008; The In-
ternational Brachypodium Initiative, 2010; Proch-
nik et al., 2010; Banks et al., 2011; Blanc et al.,
2012)。利用TBLASTN方法从这些物种的基因组数据
库中挖掘CPI1基因, 并系统性地研究CPI1基因在这
些物种中的拷贝数目、基因结构、蛋白质拓扑结构以
及基因表达模式 , 从而揭示植物CPI1的功能进化
特征。
1 材料与方法
1.1 植物材料和生长条件
拟南芥(Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.)cpi1-1突变
体为转座子Ds元件插入突变的Ler生态型。拟南芥、
毛果杨(Populus trichocarpa Torr. & A. Gray)、二穗
短柄草(Brachypodium distachyon (L.) P. Beauv.)、
江南卷柏(Selaginella moellendorffi Hieron.)和水稻
(Oryza sativa L. ssp. japonica S. Kato)种植在盛有
植物培养用土的方盆中并放置在温室, 光照周期为
16小时光照/8小时黑暗, 光照强度为120–150 μmol·
m−2·s−1。其中拟南芥、毛果杨、二穗短柄草和江南卷
柏的培养温度为23°C, 水稻的培养温度为30°C。小立
碗 藓 (Physcomitrella patens (Hedw.) Bruch &
Schimp.)在BCDATG固体培养基上进行无菌培养 ,
温度为23°C, 16小时光照/8小时黑暗, 光照强度为
120–150 μmol·m−2·s−1。拟南芥无菌培养采用MS培养
基, 附加0.05%MES、1%蔗糖和0.8%琼脂(pH5.8)。
植物培养用土为德国Klasmann泥炭土(购自北京家美
丽园园艺科技有限公司)。
1.2 CPI1基因的鉴定
以拟南芥CPI1蛋白序列为模板, 利用TBLASTN检索
Phytozome v9.0(http://www.phytozome.net/)中玉米
(Zea mays L.)、小米(Setaria italica (L.) P. Beauv.)、
猴面花 (Mimulus guttatus Fisch. ex DC.)、菜豆
(Phaseolus vulgaris L.)、盐芥(Thellungiella halo-
phila (C.A. Mey.) O.E. Schulz)、毛果杨、二穗短柄
草、水稻、江南卷柏、小立碗藓和3种绿藻Chlamy-
domonas reinhardtii P.A. Dangeard、Volvox carteri
F. Stein和Coccomyxa subellipsoidea E. Acton的全
基因组数据库, 获得的序列与拟南芥CPI1序列均具
有较高相似性。
1.3 系统发生关系分析和蛋白拓扑结构的模拟
将各物种的CPI1蛋白序列通过Bioedit进行氨基酸序
列比对, 然后进行手动校对。利用MEGA v.4.0软件的
neighbour-joining (NJ)模型构建进化树, Bootstrap值
为1 000。蛋白质拓扑结构的模拟参考Barbez等
(2012)的方法。
1.4 CPI1基因的组织表达谱
为了解CPI1基因的组织表达谱, 采用Bio-Rad公司总
RNA提取试剂盒Aurum Total RNA Kit分别提取培养
1个月的二穗短柄草和2个月的水稻的根、茎、成熟叶、
幼叶和叶鞘的总RNA, 培养2个月的杨树的根、茎、
叶、芽和韧皮部的总RNA, 以及培养6个月的小立碗
400 植物学报 48(4) 2013
藓和培养2年的江南卷柏的根、茎和叶的总RNA。用
DNase I (Promega)处理总RNA以去除基因组DNA,
并以处理后的总RNA为模板 , 用Revert Aid First
Strand cDNA试剂盒(TaKaRa)合成cDNA。分别根据
BdCPI1、OsCPI1、PtCPI1、SmCPI1和PpCPI1的核
苷酸序列设计引物BdCPI1-SP1/2、OsCPI1-SP1/2、
PtCPI1-SP1/2、SmCPI1-SP1/2和PpCPI1-SP1/2(表
1), 进行RT-PCR扩增。PCR反应体系为25 μL, 其中
含有1 μL cDNA、2.5 μL TaKaRa 10×PCR buffer、
0.125 μL TaKaRa Ex Taq (5 U·μL−1)、2 μL dNTP (每
种dNTP浓度为2.5 mmol·L−1)以及浓度为10 μmol·L−1
的引物各1 μL, 剩余体积以去离子水补足。以各物种
Actin基因作为内标。PCR反应程序是: 94°C预变性3
分钟; 94°C30秒, 60°C40秒, 72°C1分钟, 35个循环;
最后72°C延伸3分钟。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝
胶电泳进行检测, 电泳上样量为2 μL。
1.5 CPI1基因的克隆、载体构建及拟南芥转化
以二穗短柄草cDNA为模板, 利用BdCPI1 cDNA的特
异引物扩增得到目的片段。将BdCPI1 cDNA片段克
隆到植物表达载体pBA002(Kost et al., 1998)(由蔡南
海教授惠赠)的AscI和SpeI限制性内切酶位点之间,
使BdCPI1 cDNA片段位于35S启动子的下游, Nos终
止子的上游。将构建好的载体转化入农杆菌菌株
C58C1中。由于纯合的cpi1-1突变体为苗期致死, 不
能收获种子, 因此将上述农杆菌侵染杂合的cpi1-1/+
突变体。获得转基因种子后播种到土中并喷洒Barsta
进行筛选, 然后对抗性苗进行目的基因鉴定和遗传背
景分析。cpi1-1突变体的鉴定参考Men等(2008)的文
章。所用引物序列见表1。
1.6 转基因拟南芥幼苗的表型分析
为了研究BdCPI1对拟南芥cpi1-1突变体表型回补的
程度, 将转基因种子消毒后播种在MS平板上, 对拟
南芥幼苗的表型进行分析。培养室温度设为22–25°C,
在光照16小时 /黑暗8小时、光照强度为120–150
μmol·m−2·s−1的条件下培养5天, 取幼苗经扫描仪扫
描后, 利用ImageJ软件进行根长和下胚轴长度的测
量。然后将幼苗移栽至土中 , 观察4周大植株的表
型。
2 结果与讨论
2.1 植物CPI1基因的系统发生和序列分析
选取多个代表不同进化历史而且已完成全基因组测
序的植物物种为研究对象, 包括双子叶植物拟南芥、

表1 研究中所用的引物序列
Table 1 Primers used in this paper
Primer name Primer sequence (5–3) Use
BdCPI1-SP1 GAGAGGTTCACGGAGTTGGAGT RT-PCR
BdCPI1-SP2 GTGAGCTGTGGAGTGACGTAATCT RT-PCR
OsCPI1-SP1 CGGAGCTGGAGTACCTAGTTGTT RT-PCR
OsCPI1-SP2 CCAGGTAAGCTATGAAGTATGAGAGT RT-PCR
PtCPI1-SP1 CCTTCTTTCTTGATACCAATGATGT RT-PCR
PtCPI1-SP2 GAATCAACAGCCACTCTTGGTAACT RT-PCR
SmCPI1-SP1 GTGCTGTGTCTCGGAATCATAGT RT-PCR
SmCPI1-SP2 GGCGTAGAATAGCGATCCAAT RT-PCR
PpCPI1-SP1 GTCGTTGTCCCTCTCAAACTCTAT RT-PCR
PpCPI1-SP2 CGGCATGGTACAGAAGGAAGT RT-PCR
Ds5-1 ACGGTCGGGAAACTAGCTCTAC
Identify the Ds insertion in
Arabidopsis
CPI1_LP CTCGGCTCACTCACTCACACT
Identify if the cpi1-1 mutants
are homozygous
CPI1_RP CTGCCGAGATAATGCTGTGCTT
Identify if the cpi1-1 mutants
are homozygous
BdCPI1_cF2 GCTTGGCGCGCCGGAATCGGACAATGACAGCTG Cloning of BdCPI1 cDNA
BdCPI1_cR2 AGGTACTAGTTTAGACGCTTTCGTTCTGCAC Cloning of BdCPI1 cDNA

马学敏等: 植物固醇合成途径关键基因 CPI1 的功能进化 401
盐芥、毛果杨、菜豆和猴面花, 单子叶植物水稻、二
穗短柄草、玉米和小米, 蕨类植物江南卷柏以及苔藓
植物小立碗藓, 利用TBLASTN方法从这些物种的基
因组数据库中挖掘CPI1基因。在拟南芥、盐芥、毛果
杨、菜豆、猴面花、水稻、二穗短柄草、玉米、小米
和小立碗藓基因组中仅仅发现1个CPI1基因。江南卷
柏基因组包含2个CPI1拷贝, 但是序列分析发现其中
1个拷贝含有多个终止密码子, 预示着这个基因可能
是假基因。因此, 在后续的分析中, 不再分析这个假
基因。另外, 从3种绿藻Chlamydomonas reinhardtii、
Volvox carteri和Coccomyxa subellipsoidea基因组
中分别鉴定出1个CPI1基因。这些结果说明CPI1基因
的拷贝数目在进化上可能是非常保守的。利用这14
个物种的CPI1基因构建系统进化树, 发现3个藻类
CPI1基因(CrCPI1、VcCPI1和CsCPI1)单独聚成一支,
而其它陆地植物聚成另一支(图1)。
由于所有陆地植物聚成一支, 因此在接下来的分
析中, 仅仅选取6个代表不同植物类群的陆地植物物
种(拟南芥、毛果杨、水稻、二穗短柄草、江南卷柏
和小立碗藓)和3个藻类植物的CPI1基因为研究对象。
序列比对分析发现, CPI1蛋白的氨基酸序列相似性较
高(图2), 6种陆生植物的CPI1蛋白序列相似性范围是
48%–90%。其中水稻与二穗短柄草CPI1蛋白的序列
相似性最高(90%), 小立碗藓与拟南芥CPI1蛋白的序
列相似性最低(48%)。3种绿藻的CPI1蛋白序列相似
性范围是55%–87%(表2)。然而6种陆生植物的CPI1
蛋白与3种绿藻的CPI1蛋白的序列具有显著性差异
(independent-sample t-test, P<0.0001)(图3)。
2.2 植物CPI1基因结构分析
拟南芥、毛果杨、水稻、二穗短柄草和江南卷柏的CPI1
基因均包含8个外显子和7个内含子。这5个CPI1基因
的外显子长度均高度保守, 但内含子的长度差别则比
较大(图4)。如水稻OsCPI1基因的第5个内含子长度最
长, 为1 866 bp。江南卷柏SmCPI1基因的内含子长
度最小, 所有7个内含子的长度均小于92 bp。相比拟
南芥、毛果杨、水稻、二穗短柄草和江南卷柏CPI1
基因, 小立碗藓PpCPI1基因多了1个外显子, 具有9
个外显子和8个内含子的基因结构。这个外显子可能
是由于拟南芥、毛果杨、水稻、二穗短柄草和江南卷
柏中的第6个外显子插入一段DNA而形成的。
绿藻Chlamydomonas reinhardtii和Volvox car-
teri的CPI1基因与拟南芥、毛果杨、水稻、二穗短柄
草和江南卷柏的CPI1基因一样, 都包含8个外显子和
7个内含子。但是这2个绿藻CPI1基因的外显子长度
与拟南芥、毛果杨、水稻、二穗短柄草和江南卷柏CPI1
基因显著不同。经序列比对发现, 拟南芥、毛果杨、
水稻、二穗短柄草和江南卷柏CPI1基因的第3个外显
子与CrCPI1和VcCPI1的第2个外显子相对应。这可能
是由于CrCPI1和VcCPI1的第1个外显子中插入一段

图1 植物CPI1基因的系统发生分析
构建系统发生树的基因如下: CsCPI1 (Locus name: estExt_
Genemark1.C_50307)、VcCPI1 (Locus name: Vocar20010-
586m.g)、CrCPI1 (Locus name: Cre16.g657300)、PpCPI1
(Locus name: Pp1s34_401V6) 、 SmCPI1 (Locus name:
135190)、OsCPI1 (Locus name: LOC_Os11g19700)、BdCPI1
(Locus name: Bradi4g20160) 、 ZmCPI1 (Locus name:
GRMZM2G053397)、SiCPI1 (Locus name: Si022820m.g)、
MgCPI1 (Locus name: mgv1a011213m.g)、ThCPI1 (Locus
name: Thhalv10014300m.g)、AtCPI1 (Locus name: AT5G-
50375)、PtCPI1 (Locus name: Potri.015G093500)和PvCPI1
(Locus name: Phvul.009G167500)。

Figure 1 Phylogenetic tree of plant CPI1 genes
The genes used to construct the phylogenetic tree are as the
followings: CsCPI1 (Locus name: estExt_Genemark1.C_
50307), VcCPI1 (Locus name: Vocar20010586m.g), CrCPI1
(Locus name: Cre16.g657300), PpCPI1 (Locus name:
Pp1s34_401V6), SmCPI1 (Locus name: 135190), OsCPI1
(Locus name: LOC_Os11g19700), BdCPI1 (Locus name:
Bradi4g20160), ZmCPI1 (Locus name: GRMZM2G053397),
SiCPI1 (Locus name: Si022820m.g), MgCPI1 (Locus name:
mgv1a011213m.g), ThCPI1 (Locus name: Thhalv10014-
300m.g), AtCPI1 (Locus name: AT5G50375), PtCPI1 (Locus
name: Potri.015G093500) and PvCPI1 (Locus name: Phvul.
009G167500).
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图2 植物CPI1蛋白的序列比对
绿色阴影部分表示所有CPI1蛋白均保守的序列, 蓝色阴影部分表示陆生植物CPI1蛋白的保守序列, 黄色阴影部分表示藻类CPI1蛋
白的保守序列, 棕色方框表示跨膜结构域。

Figure 2 Sequence alignment of plant CPI1 proteins
Conserved residues in all CPI1 proteins are marked in green. Residues marked in blue and yellow indicate conserved residues in
terrestrial and green alga CPI1 proteins, respectively. Brown boxes indicate plasma membrane domains.

DNA而形成的。绿藻Coccomyxa subellipsoidea的CPI1
基因具有6个外显子和5个内含子的基因结构(图4)。
2.3 植物CPI1蛋白的结构模拟
对拟南芥CPI1蛋白的定位研究发现, 其定位于细胞
的内质网 , 因此CPI1蛋白很可能是膜蛋白。利用
Barbez等(2012)的方法, 预测了9个CPI1蛋白的拓扑
结构。发现9个CPI1蛋白具有非常相似的拓扑结构,
均具有7个跨膜结构域和6个亲水环(图5)。但是N-端
和C-末端亲水结构域的长度有较大差异。
2.4 植物CPI1基因的表达模式分析
为了检测毛果杨、水稻、二穗短柄草、江南卷柏和小
立碗藓中CPI1基因的表达情况, 选取不同组织进行

马学敏等: 植物固醇合成途径关键基因 CPI1 的功能进化 403
表2 植物CPI1蛋白的序列相似性分析
Table 2 Protein sequence identity of plant CPI1 proteins
AtCPI1 PtCPI1 BdCPI1 OsCPI1 SmCPI1 PpCPI1 CrCPI1 VcCPI1 CsCPI1
AtCPI1
PtCPI1 0.77
BdCPI1 0.73 0.71
OsCPI1 0.70 0.69 0.90
SmCPI1 0.56 0.54 0.53 0.51
PpCPI1 0.48 0.49 0.50 0.49 0.50
CrCPI1 0.48 0.48 0.47 0.47 0.48 0.44
VcCPI1 0.49 0.48 0.48 0.48 0.46 0.44 0.87
CsCPI1 0.47 0.44 0.45 0.45 0.44 0.41 0.57 0.55



图3 CPI1蛋白的序列相似性统计
(A) 6种陆生植物CPI1蛋白的序列相似性; (B) 6种陆生植物
CPI1蛋白与3个绿藻CPI1蛋白的序列相似性

Figure 3 Protein sequence identity of plant CPI1 proteins
(A) Protein sequence identity of AtCPI1, PtCPI1, BdCPI1,
OsCPI1, SmCPI1 and PpCPI1; (B) Protein sequence identity
between terrestrial and green alga CPI1 proteins


定性RT-PCR检测。RT-PCR扩增后对PCR产物进行
测序验证。结果表明, 这些植物的CPI1基因在不同组
织部位均表达(图6A)。对于拟南芥AtCPI1基因, 利用
拟南芥在线数据库Arabidopsis eFP Browser中的
数据进行作图分析(http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/
efpWeb.cgi), 发现拟南芥AtCPI1基因在根中的表达
水平最高, 其次是茎尖生长点, 在果荚中的转录水平
也较高(图6B)。这些结果表明植物CPI1基因可能是组
成型表达的基因, 而且植物CPI1基因的功能可能很
保守。
2.5 二穗短柄草BdCPI1基因的功能研究
在不同的植物中CPI1基因均只有1个拷贝, 而且CPI1
的基因结构、蛋白质拓扑结构以及基因表达模式均高
度保守, 预示着植物CPI1基因的功能可能也高度保
守。为了验证这个假说, 以二穗短柄草BdCPI1基因为
例来探讨CPI1基因的功能。我们克隆了BdCPI1的
CDS片段, 并将其构建到植物表达载体pBA002中,
使其位于组成型强表达的35S启动子的下游及Nos终
止子的上游(图7A)。由于BdCPI1和AtCPI1的序列相
似性非常高, 因此为了验证所克隆的BdCPI1基因是
否具有环丙基固醇异构酶的功能, 我们将其转化拟南
芥的cpi1-1突变体, 研究其能否回补该突变体的表
型。由于纯合的cpi1-1突变体为苗期致死, 不能收获
种子, 因此将上述构建转化cpi1-1/+杂合突变体。共
获得了112个分子鉴定结果为阳性的T1代转基因株系
(图7B)。这些株系表型均与野生型相似, 暗示BdCPI1
基因能够回补拟南芥cpi1-1突变体的表型(图7C–F)。
对这些植株的遗传背景进行分析, 结果表明其中有
24个株系的遗传背景为cpi1-1纯合, 70个株系的遗传
背景为cpi1-1/+杂合, 18个株系的遗传背景为CPI1野
生型(表3)(图7B)。这表明BdCPI1基因确实能回补拟
南芥cpi1-1突变体的表型, 其编码蛋白具有环丙基固
醇异构酶的功能。
为了进一步分析BdCPI1基因能在多大程度上回
补拟南芥cpi1-1突变体的表型, 对6个cpi1-1纯合背景

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图4 CPI1基因的基因结构
相同颜色方框表示在6种陆生植物CPI1基因中保守的外显子。

Figure 4 Gene structures of the CPI1 genes
Conserved exons of CPI1 genes in six terrestrial plant species are indicated by the same color boxes.



图5 预测的CPI1蛋白拓扑结构示意图

Figure 5 The predicted topology of CPI1 proteins


的BdCPI1转基因株系幼苗的表型进行了统计分析(分
别为L7、L22、L29、L77、L102和L104)。对5日龄
幼苗的根长和下胚轴长度进行测量, 由图7C和图7G
可见, cpi1-1突变体的根长显著短于野生型(P<0.01),
大约为野生型根长的30%, 而6个转基因株系的根长
与野生型相比均没有显著差异(P>0.05)。由图7C和图
7H可见, cpi1-1突变体的下胚轴长度也显著短于野生
型(P<0.01), 大约为野生型下胚轴长的70%, 而6个
马学敏等: 植物固醇合成途径关键基因 CPI1 的功能进化 405


图6 植物CPI1基因的表达模式
(A) RT-PCR检测CPI1基因在毛果杨、江南卷柏、小立碗藓、水稻和二穗短柄草中的表达; (B) AtCPI1基因在拟南芥各组织中的转录
情况

Figure 6 Transcription patterns of plant CPI1 genes
(A) Transcription of CPI1 genes in Populus trichocarpa, Selaginella moellendorffii, Physcomitrella patens, Oryza sativa and
Brachypodium distachyon; (B) Transcription of AtCPI1 gene in different tissues of Arabidopsis thaliana


表3 BdCPI1转化拟南芥cpi1-1/+突变体T1代转基因株系遗传
背景鉴定结果
Table 3 The genotype of BdCPI1 transgenic T1 lines of
Arabidopsis thaliana
Back ground of transgenic
lines
Number of transgenic
lines
cpi1-1 24
cpi1-1/+ 70
CPI1 18
Total 112


转基因株系的下胚轴长与野生型相比均没有显著差
异(P>0.05)。这些结果表明, BdCPI1基因能够回补拟
南芥cpi1-1突变体的表型至野生型的水平。
2.6 讨论
拟南芥中植物固醇合成途径多数步骤的催化酶只有
一个编码基因。CPI1是植物固醇合成途径的关键酶,
也是植物固醇合成途径特有的酶。在单细胞的藻类
(例如小球藻和莱因衣藻)中就已经存在CPI1的同源
基因, 这说明植物固醇合成途径和动物固醇合成途径
在进化的早期就发生了分离。
拟南芥CPI1基因突变产生显著的表型变异, 突
变体表现为植株矮小, 叶片小而圆, 叶色深绿, 根向
重力生长缺陷(Men et al., 2008)。目前, 只有关于拟
南芥CPI1基因及其突变体的研究报道, 在其它植物
中还没有相关研究。本研究发现藻类、小立碗藓、水
稻、短柄草、玉米、小米、杨树、菜豆、猴面花、盐
芥和拟南芥中均存在单一拷贝的CPI1基因, 在江南
卷柏中虽然有2个拷贝, 但有1个拷贝是内部产生终
止密码子而不能正常翻译的假基因, 因此我们的研究
预示从藻类到陆生植物CPI1基因的拷贝数目均保守,
为单拷贝基因。在植物中, 大量基因以多拷贝的基因
家族的形式存在, 基因家族成员之间经常发生功能分
化 , 导致重复基因产生新的功能 (吕山花和孟征 ,
2007)。然而对于单拷贝基因, 其功能在整个真核生
物中经常是保守的(De Smet et al., 2013)。CPI1基因
在整个陆生植物中的单拷贝状态预示其功能在陆生
植物中可能是保守的。陆生植物CPI1基因的基因结构
高度保守, 除了小立碗藓的CPI1有8个内含子, 其它
陆生植物的CPI1基因均含有7个内含子, 且内含子的
位置也非常保守。CPI1所编码的氨基酸序列也高度保
守, 蛋白序列相似性范围是48%–90%。蛋白质结构
406 植物学报 48(4) 2013


图7 BdCPI1基因能够回补拟南芥cpi1-1突变体的表型
(A) 35S:BdCPI1植物表达载体示意图; (B) BdCPI1转基因植株的PCR鉴定, p为含有BdCPI1基因的质粒正对照, Ler为野生型对照;
(C) 5日龄拟南芥幼苗; (D–F) 4周龄拟南芥植株, D图为野生型拟南芥, E图红色框中的为cpi1-1突变体, 白色框中显示该突变体的放
大, F图示过量表达BdCPI1基因的纯合cpi1-1突变体; (G) 5日龄拟南芥幼苗根长的测定结果; (H) 5日龄拟南芥幼苗下胚轴长度的测
定结果。C图及E图的放大图中比例尺为0.5 mm, D、E和F图中右下角的比例尺为1 cm。

Figure 7 BdCPI1 gene can rescue the Arabidopsis cpi1-1 mutant
(A) Schematic of 35S:BdCPI1 construct; (B) Genotyping results of BdCPI1 transgenic plants, p is the plasmid containing BdCPI1
gene, and Ler is the wild-type Arabidopsis control; (C) 5-day-old Arabidopsis seedlings; (D–F) 4-week-old Arabidopsis plants,
figure D is the wild-type Arabidopsis, the red boxes in figure E show the cpi1-1 mutant, the white box shows cpi1-1 mutant in a
higher magnification, and figure F is homozygous cpi1-1 mutant overexpressing BdCPI1 gene; (G) Quantification of root length of
5-day-old Arabidopsis seedlings; (H) Quantification of hypocotyl length of 5-day-old Arabidopsis seedlings. Scale bars in figure C
and the inset in figure E are 0.5 mm, and the scale bars at the lower right corner in figures D, E and F are 1 cm.

预测发现, CPI1蛋白具有非常相似的拓扑结构, 均具
有7个跨膜结构域和6个亲水环。组织表达模式分析发
现, 陆生植物CPI1基因的表达模式非常相似, 在不同
组织中均表达, 是组成型表达基因, 预示其在植物体
的各个部位均发挥重要作用。互补实验证明BdCPI1
基因能完全回补拟南芥cpi1-1突变体的表型。因此,
马学敏等: 植物固醇合成途径关键基因 CPI1 的功能进化 407
基于保守的单基因拷贝数目、基因结构、蛋白质拓扑
结构和基因表达模式, CPI1基因的功能可能在陆生植
物中高度保守。
我们发现在江南卷柏中除了1个能够正常翻译的
CPI1基因外, 还存在1个由于内部产生终止密码子而
不能正常翻译的CPI1假基因。这个假基因产生的原因
可能是: 基因重复之后额外拷贝的产生导致发生功能
冗余, 使其中1个拷贝由于没有受到选择压力而逐渐
积累了有害突变而产生(孙红正和葛颂, 2010)。另外,
也有可能是由于剂量效应, 额外拷贝的产生导致植物
产生过多的CPI1蛋白, 从而对植物产生危害, 因此在
江南卷柏进化过程中使其中1个拷贝以假基因的方式
丢失功能。
由于植物固醇与胆固醇的结构类似, 膳食中的植
物固醇能抑制小肠对胆固醇的吸收, 从而降低血清中
胆固醇的含量(Andersson et al., 2004)。研究发现,
膳食中含较多天然植物固醇的男性血清中的胆固醇
含量比膳食中植物固醇含量少的男性降低2.6%, 低
密度脂蛋白的含量降低3.1%; 对女性的测试结果也
显示两指标分别降低3.5%和3.2%(Klingberg et al.,
2008)。摄入富含植物固醇的食物是低度和中度高胆
固醇患者控制血液胆固醇含量的一种非常方便的非
药物疗法, 并且植物固醇具有抑制癌细胞增殖的作用
(Bradford and Awad, 2007; Laverias et al., 2012;
Maki et al., 2013)。因此, 通过基因工程手段提高粮
食作物中植物固醇的含量具有重要的应用价值。CPI1
基因是植物固醇合成途径的关键基因, 利用CPI1基
因的高度保守性, 克隆重要粮食作物的CPI1同源基
因, 验证其过表达是否能提高植物的固醇含量, 将为
提高农作物的植物固醇含量提供候选基因。
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410 植物学报 48(4) 2013
Functional Evolution of Plant CYCLOPROPYL STEROL
ISOMERASE1 Gene
Xuemin Ma1, Shuangli Sun2, Hailing Yang1, Shuzhen Men2*
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Biological Sciences and Technology, Beijing Forestry
University, Beijing 100083, China; 2Department of Plant Biology and Ecology, College of Life Sciences,
Nankai University, Tianjin 300071, China
Abstract Sterols are major components of the eukaryotic membrane and play important roles in development proc-
esses. CYCLOPROPYL STEROL ISOMERASE1 (CPI1) encodes a plant-specific key enzyme in the plant sterol biosyn-
thesis pathway. Only the CPI1 from Arabidopsis has been cloned and characterized. In this study, we identified sin-
gle-copy CPI1 genes from algae to flowering plants. All CPI1 genes from land plants have a conserved gene structure and
high protein sequence similarity ranging from 48% to 90%, with low protein sequence similarity between land plants and
algae. Protein structure prediction revealed that all CPI1 proteins have a similar protein structure, with 7 transmembrane
domains and 6 hydrophilic loops. RT-PCR revealed that the land plant CPI1 genes were constitutive expression genes.
To investigate the function of CPI1 genes, CPI1 from Brachypodium distachyon was cloned and transformed into the
Arabidopsis cpi1-1 mutant. The BdCPI1 gene could completely complement the function of AtCPI. Thus, our data for
single copy number, conserved gene structures, protein structures, and gene expression patterns suggest that the func-
tions of land plant CPI1 genes are highly conserved.
Key words CPI1 gene, functional evolution, gene expression, mutant, plant sterol
Ma XM, Sun SL, Yang HL, Men SZ (2013). Functional evolution of plant CYCLOPROPYL STEROL ISOMERASE1 gene.
Chin Bull Bot 48, 398–410.
———————————————
* Author for correspondence. E-mail: shuzhenmen@nankai.edu.cn
(责任编辑: 刘慧君)