全 文 ：第 26卷第 8期
2006年 8月
生 态 学 报
ACTA EC0L0GICA SINICA
Vo1．26．No．8
Aug．，2006
恩诺沙星对小型模型水生态系统中微生物的影响
吴银宝 ，汪植三 ，廖新悌 ，陈杖榴
(1．华南农业大学动物科学学院，广州 510642；2．广东省兽药研制与安全评价重点实验室，广州 510642)
摘要：恩诺沙星是畜禽养殖业中广泛应用的抗菌药，它进入畜禽体后 ，会随畜禽的排泄物进入环境，对生态环境造成影响。通过
人工构建的小型模型水生态系统，研究了恩诺沙星在水体的降解及其对水生态系统微生物的影响，为其生态风险评价提供数
据 。试验设 5个浓度系列 ，1个空 白对照 。结果表 明 ：在试验 中，恩 诺沙 星的降解速 度很 快 ，经 5h后就 已降到原 始浓度 的 50％
以下，之后随时间推移，降解速度逐步减慢。在试验初始浓度0．2～5mg／L的范围内，恩诺沙星对水体中的好氧细菌、真菌、放线
菌、氨化细菌和硝化细菌的数量均无显著影响。讨论了恩诺沙星进入水环境后的生态效应。
关键词 ：恩诺沙 星；小型模 型水生生态系统 ；微生物
文章编号：1000 0933(20o6)08．2640．06 中图分类号 ：S811．5 文献标识码 ：A
Efects of enroflixacin on microorganisms in wetlands
WU Yin-Bao ，WANG Zhi San ，HAO Xin-Di ，CHEN Zhang．Liu (1． A "mf＆ n∞，som^Chiw Ag cⅡmf ，
Guangzhou 510642，Ch／na ；2．GuangdongKey 6or oryfor VeterinaryDrugO~ lopmel~t and SafetyEvaluation，South China Agricultural University，Guangzhou，
510642，China)．Acta Ecologica Sinica，2O06，26(8)：264O一2645．
Abstract：Enrofloxacin iS a widely used antibiotics in animal production． Animal excreted residual enrofloxacin which can
adversely affecting the environment．The efects of 5 concentrations of enrofloxacin(0，0．2，0．5，1，2，5mg·L )on the
aquatic microorganisms and their degradation rates were determined in a constructed wetland to assess the ecological risk of
enrofloxacin on aquatic ecosystem．Th e results showed that enrofloxacin was rapidly degraded in the wetland environment in the
initial stage，with more than 50％ degraded within the first 5 hours．And thereafter the degradation rate of enrofloxacin slowed
down．Th e results indicated that enrofloxacin concentrations of 0．2 ～5 mg‘L一 had no significant efects on the population of
aerobic bacteria，fungus，actinomycetes，nitrite bacteria and nitrate-reducing bacteria under aquatic environment．The ecological
efects of enrofloxacin on aquatic ecosystem were also discussed．
Key words：enrofloxacin；aquatic microcosmos；microorganisms
兽药进入畜禽机体后 ，其原形和代谢产物除以游离和结合 的形式残留在畜禽机体组织 和畜禽产品中外 ，
还会随粪、尿等排泄物排出体外，进入水域及陆域生态系统中，可能对生态系统中的生物群落构成威胁，对系
统的结构和功能产生直接或间接的影响。国外对兽药的生态风险评价非常重视 ，对兽药在环境 中的含量及其
降解 ‘ 、进入环境后的行为 及其对生态系统的影响 方面的研究也越来越多。国内对兽药 的生态风险
评价刚起步 ，相关研究较少，是一个亟待加强的领域 。
恩诺沙星是目前广泛应用于畜禽养殖业的人工合成的抗菌药，为畜禽、水产养殖业的发展作出了很大贡
献，同时长期用药而导致的在畜禽产品中的残留、耐药性的增加以及在环境中的生态效应等方面已引起广泛
基金项目：国家自然科学基金重点资助项 目(31031040)；华南农业大学校长基金资助项 目(2005K105)
收稿 日期 ：2005．06．30；修订日期 ：2006．02．1 1
作者简介 ：吴银宝(1973一)，男 ，博士 ，主要从事家畜生 态学研究 ．E．mail：wuyinbao@scau．edu．ca
Foundation item：The p呻ject was supported by Key Program ofNational Natural Science Foundation of China(No．31031040)and President Fund of South China
A cultural University(No．2005K105)
Received date：2005-06-30；Accepted date：2006-02-1 1
Biography：WU Yin-Bao，Ph．D．，mainly engaged in domestic ecology．E-mail：wuyinbao@ scau．edu．ca
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8期 吴银宝 等：恩诺沙星对小型模型水生态系统中微生物的影响 2641
关注。研究表明 ，健康鸡灌服恩诺 沙星后 ，主要以恩诺沙星原形 、其次以环丙沙星 的形式随粪(尿 )排 出体外 ，
而且鸡粪中的恩诺沙星浓度要高于恩诺沙星对多种微生物的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC) 。
因此本文将构建小型模型水生态系统(微宇宙，Microcosm)，研究恩诺 沙星在其 中的降解及其对水生态系统中
微生物种类及数量的影响，评价这种人工合成物进入水环境后对水生微生物的生态效应，为恩诺沙星的生态
风险评价提供依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 仪器 高 效液 相色 谱仪 (HPLC)：Waters 600 Controler，Waters 717 plus Autosampler，Waters TM 474
Scanning Fluorescence Detector(美国)；SR2000色谱数据工作站 ：上海三锐科技
1．1．2 药品 恩诺沙星对照品 ：含量 100％，批号 H051200，中国兽药监测所 ；恩诺沙星原料药 ：含量 99．4％，
批号 20010515，浙江国邦制药厂；乙腈 ：Fisher scientific worldwide company，色谱纯 ；四丁基溴化铵 、胆盐 、乳糖 、蛋
白胨 、磷酸氢二钾 、七水硫酸亚铁 、七水硫酸镁等均为国产分析纯。
1．1．3 试剂和培养基 流动相 ：称取 4．8845g四丁基溴化铵溶于 850ml双蒸 水中 ，加 乙腈 150ml，混匀后用
85％的磷酸调 pH至 3．0，过滤脱气后待用。
好氧细菌采用营养琼脂培养基 ；真菌采用察氏培养基 ；放线菌采用高氏 1号培养基 ；氨化细菌采用氨氧化
细菌计数用培养基；硝化细菌采用硝酸还原菌计数用培养基 。上述微生物均采用 MPN(Most Probable Number)
法培养计数。
1．1．4 材料 试验用水 ：静置 10d以上的自来水 。玻璃水族缸 ：规格为 0．6m×0．3m×0．4m(长 ×宽 ×高)，容
积60L。塘泥：取自华南农业大学校外池塘，未经动物废弃物污染，池水经检验不含恩诺沙星。将塘泥风干粉
碎，去除较大的石子及杂物。
1．2 试验方法
1．2．1 水体微宇宙的建立 试验先培养 7个水体微宇宙 ，于大棚内进行。试验开始时 ，各缸底先铺 5cm厚的
塘土(重 23．75kg)，其 中含有多种水生生物的种子 、孢子和卵，每缸灌注 自来水 55L。每 3d用 自来水补充蒸发
失水。30d后 ，各缸底泥及四壁长出一些水生植物 (如水绵等)，水 中有较丰富的藻类 、原生动物 、枝角类及微
生物 ，各缸生物种类相似，代谢功能相近。
1．2．2 试验分组 水体微宇宙至少培育 2个月 ，待其稳定后取 其中功能相近的 6个微宇宙用作正式试验。
第 1组为空 白组(不加入恩诺沙星)，从第 2组到第 6组 ，水体 中恩诺沙星浓度分别为 0．2、0．5、1、2 mg／L和 5
mg／L。试验期间平均气温为 30．5cC。
1．2．3 采样 各组按相应的恩诺沙星浓度给药 、混匀后 ，在给定 时间采集水 样 ，采集水样 的时间为 0、0．25、
0．63、1、1．21、2、3、4、7、12、2O、30、41d，5点采样 ，每点采集从水面到水底 的水柱 ，所采样品混合均匀后 ，用于水
体 中恩诺沙星浓度检测。用于微生物数量检测的采样时间为 1、2、3、4、6、9、14、23、41d。
1．3 检测方法
1．3．1 水样前处理方法 水样混合均匀后 ，取 4ml于 12000r／min离心 10rain，再取上清液过 0．22 m的滤膜 ，
取所得滤液 1ml，用 HPLC法进样 50td测定其 中的药物浓度。
1．3．2 色谱条件及工作指标 检测器 ：荧光检测器 ，激发波长( )278nm，发射 波长( )452nm，衰减为 10，
增益为 64；色谱柱 ：Hypersil BDS C18(5 m，4．6×250mm)，大连依利特科学仪器有限公 司填装 ；流速 ：1．0ml／min；
最低检测限：恩诺沙星及环丙沙星均为 0．002mg／L。
在上述检测条件下 ，能将恩诺沙星 、环丙沙星与水样 中的其它成分分开 ，恩诺沙星和环丙沙星色谱峰保留
时间分别为 4．9min和 4．3min。
1．3．3 水样中恩诺 沙星及环丙沙星浓度测定 给药后不同时间获得 的水样 ，按 “1．3．1水样前处理方法”处
理后进行 HPLC分析 ，将恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星的峰面积代人标准曲线 回归方程中 ，计算出相应水
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样的药物浓度。对药物浓度过高超出检测限范围的样品，用流动相稀释后再进样测定其浓度。
15
0
20
l0
0
时I．司Time(min) 0 1 2 3 4 5
时间Time(min)
图 l 恩诺沙星和环丙沙星标准品色谱图 图
2 水样样 品色谱 图
Fig．1 chmm砒。graphy graph of the。 dard靼mpl。of。“ oflo acin and Fi
g．2 Chm哪t。graphy sr~oh of the sarTIples。f water
ciprofloxacin
1．4 统计分析方法
对试验所取得 的数据用 SPSSIO．0 for Windows进 行统 计分 析，多 重 比较 采 用邓 肯 氏新 复极 差检验 法
(DMRT法)，利用 Microsoft Excel 2000进行曲线拟合。
2 结果与分析
2．1 恩诺沙星在模型水生态系统中的降解
在微宇宙中加入不 同浓度的恩诺沙星溶液 ，测定不同采样时间水中恩诺沙星浓度的变化 ，结果如表 1所
示。试验开始时，恩诺沙星的降解速度很快，在试验开始后 5h左右浓度 已经降至原浓度 的 50％以下，之后随
时间推移 ，降解速度逐步减慢 ，并且在低浓度时维持较长的时间。初始浓度越高 ，恩诺沙星在低浓度时维持的
时间就越久。这种变化趋势与其在 自然水体中的降解结果相似 ]。
2．2 恩诺沙星对水中微生物的影响
2．2．1 好氧细菌 在不同时间，测定不同浓度恩诺沙星水 中的好氧细菌总数 ，并将其对数值与采样时间作图
可得图 3。由图 3可知 ，在试验浓度范围内，各试验组好氧细菌总数的变化趋势均与空 白组相似 ，水体 中好氧
细菌总数在开始加入恩诺沙星后下降较低快，但之后回升也较快，然后又逐步下降并趋于稳定 ，方差分析无显
著差异 (P>0．05)。对各试验组进行多重 比较 ，也得到相同结果。表明在试验浓度范围内，水体中恩诺沙星的
初始浓度对好氧细菌总数变化的影响较小。这可能与恩诺沙星在水环境 中消失较快有关 。
2．2．2 真菌和放线菌 在不同采样时间，各试验组测得 的真菌和放线菌的数量变化如表 2所示。
表 1 各试验组恩诺沙星的浓度变化
Table 1 Changes of enrofloxacin concentration in water in experimental trials
* ND为不可测得 ND nleans“Not Detectable
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由表 2可以看 出，从空 白组到试验组 ，真菌和放线
菌的数量都很少。将所测数据以1g(x+1)形式转换后，
进行方差分析和多重 比较，结果表 明，空 白组 与其它试
验组真菌的数量变化无显著性差异。这说明，在试验浓
度范围内，恩诺沙星对真菌和放线菌的发生与发展未产
生显著影响。
2．2．3 氨化细菌 恩诺沙星对氨化细菌的影 响如 图 4
所示。在试验前 5d，各试验组 氨化细菌总数呈先降后
升趋势 ，5d后各组变化较大，规律性不 明显。方差分析
表明，各试验组与空白组之间的氨化细菌总数无显著差
异(P>0．05)，这说明在试验浓度范围内，恩诺沙星对氨
化细菌总数变化的影响不显著。
2．2．4 硝化细菌 在不 同采样 时间，各试验组测得硝
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时间Time(d)
图 3 恩诺沙星对好氧细菌总数的影响
Fig．3 Efect of enrofloxacin ON sum of water aerobic bacteria
化细菌对数值的变化如表 3所示。方差分析表明，各组间差异不显著(p>0．05)。这表明在试验浓度范围内，
恩诺沙星加入与否及其浓度大小不会影响水体中硝化细菌的数量变化。
时间 Time(d)
图4 恩诺沙星对水体氨化细菌的影响
Fig．4 Efect of enrofloxacin ON sum of water aminate bacteria
3 讨论
衰3 各试验组硝化细菌总数的对数值
Table 3 Logarithm of霸衄 of nitrobac“ ria in water in experimental trials
3．1 恩诺沙星对水体微生物数量的影响
影响水体微生物种类和数量的因素较多，如水温、外界气压、微生物可利用养分、水体中的 DO等 。在
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本试验 中，空白组与各试验组各类微生物的变化趋势均 相似 ，无显著差异 ，表明在试验浓度范围内，水体 中恩
诺沙星初始浓度的高低不会影响到水生微生物数量的变化，其原因可能与恩诺沙星在水环境中消失较快有
关 。本文中恩诺沙星在水体中的初始浓度为 0．2～5mg／L，主要原因为恩诺沙星是治疗 用兽药 ，在采用《中华
人 民共和国兽药典》规定的最大治疗用量时，恩诺沙星在鸡粪中排出的最高浓度为 41．45mg／L 。由于鸡粪进
入水体时会被稀释，因此实际水体中恩诺沙星的浓度要低于本试验所采用的最高浓度，这就表明按《中华人民
共和国兽药典》规定的治疗用量 ，随排泄物进入水体的恩诺沙星不会对微生物数量造成明显影响。
该结果与 Dijck等 。。的研究结果类似 ，他们通过研究认为饲料 中添加的抗菌素对土壤和水 中的微生物影
响较小。但也有不同的结论 ，王加龙等人 ¨的研究表 明，高浓度的恩诺沙星(1mg／kg土 )对土壤的呼吸作用、
氨化作用和硝 化作用 均 有不 同程度 的抑 制作 用，可 能 会影 响到 土壤 的特性 和土 壤 中 的一些 生态过 程。
Wolenberger等人 12]则报导畜禽常用的抗菌药甲硝唑 、喹乙醇 、土霉素、萘啶酸、泰乐菌素等对水环境有潜在 的
不 良效应。
3．2 恩诺沙星对水体的生态效应
水生生物和淤泥是水体微宇宙的重要组成部分。恩诺沙星进入水体后 ，可能通过水解、水体颗粒物吸附
沉降、底泥吸附、生物降解和生物富集等途径消除。本试验中，由于恩诺沙星在微宇宙中的降解与其在 自然水
(无淤泥)中的降解相似 ，表明在水体中恩诺沙星消失的主要途径是 降解。同时，土壤对恩诺 沙星的吸附试验
表明 ，土壤对水相中的恩诺沙星有吸附作用，在恒温振荡条件下的吸附平衡时间为 33h¨ ，本次试验表明在试
验开始后 5h左右水体中恩诺沙星的浓度已经降至原浓度的 50％以下 ，这也提示进入水 生微宇宙的恩诺沙星
在尚未被淤泥大量吸附时，就 已大部分被降解。但是 ，底泥 吸附对兽药 在水环境中消失的影 响也不容忽视 。
Kummerer 报道环丙沙星进入水体后 ，会被沉积物所 吸附，在水体中消失的环丙沙星 中有 65％进入 到污泥
中。因此恩诺沙星在水体 中被降解 的同时 ，有一部分将 进入底泥。由于恩诺 沙星的降解 以光解为主，因此进
入底泥的恩诺沙星可保持较长时间，并可通过底泥的解吸作用向水体缓慢释放恩诺沙星。这也解释了本试验
中，恩诺沙星在微宇宙中降解到较低浓度时 ，降解速率变慢 ，并可在低浓度维持较长时间。
恩诺沙星在低浓度下保持较长时间，虽然对水体微生物的数量没有形成显著影响 ，但微生物长时间与低
浓度药物接触，很容易导致微生物耐药性的产生；同时，根据恩诺沙星的正辛醇／水分配系数值可知，恩诺沙星
有一定的亲脂性 ，较易在生物体内累积 ，最终影响人类 的健康。Migliore等 ¨的研究表 明，恩诺沙星可 以在作
物中富集 ，并体现出一定的植物毒性 。由此可见，恩诺 沙星进入水体后 ，依然存在一定 的生态风险。
尽管水体微宇宙具备了 自然水生态系统的结构与功能 ¨，但与真实系统之间毕竟存在差异 ，因此在结果
外推时必须考虑野外 自然状况所存在的不确定性因素 ，如生物组成更加多样 ；群落更大更复杂 ；环境条件更加
复杂 ，往往不仅仅药物一个因素，甚至还有其它污染物 ；野外大面积的水生态系统所具有的水力学特征与微宇
宙有差异 ；野外光照条件与试验时有一定差异等，这样才能更准确地对恩诺沙星进行生态风险评价。
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