全 文 ：第 26卷第 4期
2006年 4月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vo1．126．No．4
Apr．，2006
厦门港纤小裸甲藻 (Takayama pulchelum)
的形态、生长及分子特征
顾海峰 ，孙 军。，邹迎麟4，方 琦 ，蓝东兆
(1．中国海洋大学，青岛 266003；2．国家海洋局第三海洋研究所，厦门 361005；3．中国科学院海洋研究所
海洋生态和环境科学重点实验室，青岛 266071；4．国家海洋局第一海洋研究所，青岛 266011)
摘要：在 2003年厦门港发生的一次裸甲藻赤潮中分离得到了纤小裸甲藻(Takayama pulchelum)，并对其形态学进行了光镜和电
镜的观察，该株藻细胞个体较小，长约 20—23tm，宽约 14—20 m。藻细胞外表卵圆形，细胞上壳有一条明显的 S形顶沟，顶沟是
特异性的反 S形。与模式种相比，这一株裸甲藻细胞核更靠上部，大部分细胞横沟都没有偏移。纤小裸 甲藻在盐度为 28时比
生长率最大，达到 0．42，随着盐度下降，比生长率也跟着下降，当盐度下降到 l6时，生长率为 0。盐度范围在 8 l6时，超过 80％
的藻类能存活48h；当盐度低于4时，生长率和存活率都为0。24．-27E是纤小裸甲藻的最适生长温度，比生长率超过0．50，当温
度升到 30~C时，生长率急剧下降到约0．35。毒素测定结果显示该株裸甲藻不含麻痹性贝毒和神经性贝毒。本株纤小裸 甲藻大
亚基 D1．-D2区序列长度为 721bp，与基因库中该种的一株相似种同源性超过 99％。对 18株裸甲藻转录间隔区(ITS)序列建立
的系统进化树显示，纤小裸 甲藻和 Karlodinium micrum的距离最近，通过 ITS 序列建立的系统发育树大致能够把 Akashiwo属、
Karenla属、Kadodinium属和 Takayama属与Gymnodinium属区分开来。
关键词：厦门港；纤小裸甲藻；形态；生长；分子特征
文章编号：1000．O933(2OO6)O4．1021．07 中圈分类号：Q178 文献标识码：A
M orphology，growth and molecular character of Takayama pulchelum from Xiamen
Harbor
GU Hai．Feng ～，SUN Jun ，ZOU Ying-Lin4，FANG Qi ，LAN Dong．Zhao (1．0 ily of Chi Qf，础 。。Q ，础 。，
266003，China；2．ThirdInstituteofOceanographyXiamen，361005，China；3．Key LaboratoryofMarineEcology＆Environmental Science，Chinese Academyof
Sciences，Qingdao，266071，China；4． e FirstInstitueofOceanography，Qingdao，266011，China)．ArmEeologiea Sinica，2006，26(4)：1021—1027．
Abstract：A strain of Takayama pulchelum was isolated during a bloom in Xiamen Harbor in 2003．Morphology was observed
under LM and SEM．The vegetative cells are relatively small in size，ranging from 20—23 m long and 14—20b~m wide．Cels are
broadly oval with a conspicuous and wel—defined sigmoid apical groove present on the epitheca．The apical groove is a
characteristic reversed S—shape．The nucleus is located in the top part of the cell and most cells’cingulum do not displace．which
are diferent from the type species．The growth mte reached the highest value，about 0．43，at salinity of 28 and dropped when
salinity decreased．The cels ceased growing when salinity went down to 16，however，more than 80％ of the cells could survive
for 48h when salinity ranged from 8 to 16．Survival was not observed at salinity lower than 4．Best growth rate of Takayama
pulchelum occured at temperature of 24 and 27℃ 。which was above 0．50．Growth rate dropped sharply to about 0．35 when
temperature increased to 30~C．PSP(paralytic shellfish poisoning)and NSP(neurotoxic shellfish poisoning)analysis did not
基金项目：国家重点基础研究发展规划资助项目(2001CB409702，2001CB4O9709)；国家 自然科学基金资助项目(40476053)；国家海洋局海底科学重
点实验室资助项目(2004—2OO5)
收稿Et期；2005．01．18；修订Et期：2005．09．04
作者简介：顾海峰(1971～)，男，浙江平湖人，硕士，主要从事有害藻类生态学研究．E-mail：haifenggu@yahoo．tom
Foundation item：This project wa8 supposed by State Key Basic Research and Development Plan(No+2001CB409702，2001CB409709)，National Natural Science
Foundation of China(No．40476053)and SOA Sea Floor Science Key Ia~omtory(2004-2005)
Re0eiw}d date：2005·0l-18；Accepted da te：2005-09-04
Biography：GU Hai-Feag ，Master，mainly engaged in harnful algae ecology．E·mail：haifenggu@yaho．com
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生 态 学 报 26卷
reveal any toxin in this strain．The D1-D2 region of LSU(1arge subunit)rDNA and total ITS1-5．8S-ITS2 were amplified，cloned
and sequenced．The partial LSU has 721 bp and shares more than 99％ similarity to the same species whose data was deposited in
the Genbank．A phylogenetic tree was constructed using ITS sequence of 1 8 species，showing that Takayama pulchellum is closely
related to Karlodinium micrum．The genus of Akashiwo， Karenia， Karlodinium and Takayama could be separated from
Gymnodinium genus approximately using ITS sequence．
Key words：Xiamen harbor；Takayama pulchellum；morphology；growth；molecular character
甲藻的一个重要特征是皮层有一层外围小泡，称之为皮层小泡 ¨ 。小泡通常包含着纤维素组成的板，它
们形成了甲藻的细胞壁或称之为甲板。甲板的排列模式即甲板方程式是甲藻分类的主要依据 。甲板的排
列方式具有很大的稳定性，下壳通常比上壳更保守，而最保守的是纵沟和横沟 。裸甲藻的皮层小泡很小，只
在顶部、横沟和纵沟等部位形成可分辨的结构 ]，因此裸甲藻没有甲板方程式，这给它们的鉴定增加了困难。
裸甲藻是一类重要的赤潮生物，其中有多种种类可以产生麻痹性毒素、神经性毒素和鱼毒素。最近很多
研究人员利用大亚基序列、色素组成并结合形态学特征对裸甲藻属重新划分，把原来这个属的种类归到 5个
属中，它们是：Gymnodinium属(有 1个马蹄形的顶沟和多甲藻素)、Akashiwo属(有 1个顺时针螺旋形的顶沟和
多甲藻素)、Karenia属(有 1个直线型的顶沟和墨角藻黄素)、Karlodinium属(有 1个较短的直线型顶沟、1个腹
孔和墨角藻黄素)和 Takayama属(有 1个 s型的顶沟和墨角藻黄素) J。
纤小裸甲藻最早发现于日本，被认为是能产生鱼毒素、溶血性毒素和神经性毒素的种类 ，1994年 IAtlgen
对它正式描述并定名为 Gymnodinium pulchelum 。纤小裸甲藻在美国和澳大利亚都引发过赤潮，并导致大量
鱼类死亡 ]。最近纤小裸甲藻被更名为 Takayama pulchelum，由于缺少模式种的分子数据，这个种的定名上
还有不清楚的地方 。
在厦门港采样分离到了纤小裸甲藻这种可能有毒的裸甲藻，研究了其形态学和生长特性，测定了该种的
转录间隔区和大亚基 Dl～D2片段序列，为裸甲藻的分子分类提供了资料。
1 材料与方法
1．1 藻株的培养
藻株(TPxM)2003年从厦门港九龙江口的赤潮水样中单细胞分离获得。藻细胞在不加硅的 f／2培养液 叫
中培养，其他条件为 20 oC，30001x，12h：12 h光照：黑暗。
1．2 形态学观察
藻细胞在奥林帕斯相差显微镜下活体观察。电镜样品的制备步骤为：离心收集指数期的细胞，采用终浓
度2％的戊二醛固定，系列酒精脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，喷金，用 Philips EC30扫描显微镜观察和
照相 。
1．3 生长速率和存活率
在 7个温度组(12，l5，l8，21，24，27，30℃)和 7个盐度组(4，8，12，16，20，24，28)下测定生长速率，温度用控
温箱调节，误差在 ±l℃，不同盐度的海水用正常海水和蒸馏水调配而成，其他共同的条件是光照强度 30001x，
光照周期 12h：12h，温度 20℃(当温度不是变量)。在进行温度梯度试验时，藻细胞在试验温度附近驯化 7d，盐
度试验时则不驯化。藻细胞接种到3个装有 lOOml f／2培养液的烧杯中，使密度达到4000个细胞／ml。每两天
计数细胞，至少计数 200个细胞。比生长速率用公式：V=in(N ／N。)／t来计算。存活率 =两天后的细胞密度／
起始细胞密度x 100。
1．4 麻痹性贝毒(PSP)和神经性贝毒 (NSP)的检测
PSP的检测采用小鼠毒性检测法和神经受体结合毒素检测法。小鼠毒性检测采用 AOAC标准化方法n 。
受体结合检测方法如下：藻细胞以0．Imol／L乙酸提取毒素，超声破碎细胞后离心留取上清液。提取6周大鼠
脑突触体准备液 ¨，并通过蛋白测定来定量受体浓度。受体准备液分装于 2ml冻存管置 一40~C保存。STX毒
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4期 顾海峰 等：厦门港纤小裸甲藻(TakayamapH m)的形态、生长及分子特征
素标准在实验中按照 1000，100，30，10，3，1，0．1，O．01nmol／L的浓度梯度制成标准曲线溶液。实验在特制的
Milipore 96孔微量培养盘(孔底部垫有一层滤膜)中进行，在培养盘中加入一定量的 H3一STX，STX标准毒素或
样品和受体准备液，4~C条件下培养 1h，使受体与毒素充分结合。然后清洗并真空抽滤掉未结合的毒素，载有
毒素受体结合体的滤膜被转移至闪烁瓶，加闪烁液后通过液体闪烁计数仪进行放射性计数，做出竞争曲线，计
算未知样品中毒素含量。
NSP的检测采用的是受体结合毒素检测法。藻细胞以甲醇提取毒素，超声破碎细胞后离心留取上清液。
受体的准备同PSP受体方法。标准毒素采用短裸甲藻毒素PbTx3，按照10000，1000，100，10，0．1，O．O1nmol／L浓
度梯度制成标准曲线溶液。实验步骤如 PSP。
1．5 PCR扩增、纯化及克隆 ．
离心收集 50ml指数期末期的细胞，用 DNA提取试剂盒(Sangon)提取总 DNA。ITS1—5．8S—ITS2片段用 ITSA
和 ITSB引物扩增_1 。PCR反应程序为94~C变性4min，然后是 94 oC lmin，50~C 2min，72~C 3min循环25次，最
后在 72~C延伸7min。大亚基 D1～D2区域用D1R和D2C引物扩增n ，PCR程序与上述的相同，只有退火温度
改为 42 oC。PCR产物用 DNA纯化试剂盒(华美)纯化，然后克隆到 pGEM．T质粒(Promega)，蓝白斑筛选，菌落
PCR确定为阳性反应后送生工测序，序列存放在基因库中，序列号为AY764718—19。
1．6 数据处理
序列首先用 BLAST程序_l 与基因库中的序列比对，然后用 CLUSTAL W[161程序进行多重比对，系统进化
树用 Mega2．1软件中的最大似然法建立 ¨。
2 结果和分析
2．1 形态学
藻细胞个体较小，长约 20～23,um，宽约 14～20,zm。藻细胞外表呈卵圆形，背腹部稍有压缩。腹面较扁平，
而背面较圆。细胞上壳有一条明显的S形顶沟(图a～c)。顶沟是特异性的反 S形。上壳比下壳略小一点。
纵沟很深，向上侵入到上壳接近顶沟的位置，形成一个食指形的形状(图d)。细胞核很大，几乎占据了整个细
a背面观Dorsal view
b侧面观 Lateral view
c顶面观 Apical view
d．e腹面观Ventral view
图1 纤小裸甲藻的扫描电镜照片(标尺代表 ltm)
Fig．1 SEM photos of Takayama pulchellum (bar represent lfxm)
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胞上半部。大部分细胞横沟都没有偏移(图b，d)-，但个别细胞横沟偏移也能够达到横沟宽度的1倍多(图e)。
2．2 生长特征
盐度对纤小裸甲藻生长酌影响较大，当盐度为28时生长率最大，达到0．42，随着盐度下降，比生长率也跟
着下降，当盐度下降到16时，生长率为0。盐度范围在 8～16时，裸甲藻虽然不能生长，但依然有超过 80％的
藻类能存活下来；而当盐度下降到 4时，生长率和存活率都为 0(表 1)。
表 1 在不同盐度下纤小裸甲藻的生长速率和存活率(括号中的数据为标准差)
Table 1 Growth rate and survival of Takaymna pulch~lum at diferent Salinity(The data in bracket日re SD)
温度对纤小裸甲藻生长的影响很大，24～27~C是它的最适生长温度，比生长率超过 0．50，当温度升到
30~C时，生长率急剧下降到约 0．35(图2A)。厦门港各个季节海水温度的变化不大，冬季最低约为 15~C，夏季
最高可达到 30~C(图2B)，因此理论上厦门港周年都适合纤小裸甲藻的生长。
S
茎
图2 A：温度对纤小裸甲藻生长的影响，B：厦门港水温的季节性变化
Fig 1．2 A：Efect of temperature Oil growth。f Takayama pttlchellttm，B：Seasonal variation of water temperature in Xiamen Harbo
2．3 毒性
在本株裸甲藻的细胞提取液或藻培养液中未检测出麻痹性贝毒和神经性毒素。
2．4 分子特征
本株纤小裸甲藻大亚基 D1～D2区序列长度为721bp，与基因库中该种的一株相似种同源性超过99％，证
明了分离得到的确实是纤小裸甲藻。
纤小裸甲藻 ITS1长211，5．8s长 159，ITS2长 217，对 18株裸甲藻 ITS序列建立的系统进化树显示(图 8)，
纤小裸 甲藻和 Karlodinium miclIzm这两个种的距离最近，共 同组成 了一颗子树。Akashiwo sanguinea和
Gyrodinium instriatum以及两株 Gymnodinium sp．共同组成了一颗子树。这两株 Gymnodinium sp．可能也属于
Akashiwo属。Karenia属的两个种和Gymnodinium maguelonnense以及一株Gymnodinium sp．，这一株 Gymnodinium
sp．在用大亚基序列建立的系统树中也是与 Karenia属距离最近(结果未显示)，因此可能也属于 Karenia属。
Gymnodinium corii似乎是它们共同的祖先。
3 讨论
3．1 形态学
与 Larsen描述的模式种相比，这一株裸甲藻形态上主要在两个地方有差异。模式种的横沟有偏移，幅度
为横沟宽度的 1～1．5倍，而本株只有个别细胞横沟有偏移；模式种细胞中央偏左位置处有一个椭圆形、较大
的细胞核，而本株的细胞核靠上部。由于是在细胞分离一年之后才进行了电镜观察，在培养过程中细胞形态
孙∞” ，0
^ 《 A； 崔菅 啊*
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Gymnodinium sp．USA 29-9 Af201747
Heterocapsa triquetra Af527816
ScrippMellatrochoideaAy685009
Prorocentrurtl minimum Af352371
Gymnodinmm catenatumAy506592
Gyrodinium impudicum Afl31074
Gymnodinium叩 7一l5Aj534382
Takayamapulchellum Ay764719
Karlodinium micrum Af352367
Akashiwo sangulneaAfl31075
Gyrodinium instria~tm Aj534386
Gymnodinium ．Zheo Aj534385
Gymnodinium叩．Zhao8 Aj534384
Gymnodinium maguelonnense Af318225
Gymnodinium sp．Chil~
_
53／16Af318247
Karenia miMmotoi Af3l8224
Karenia brev捃 Af352369
Gymnodinium corii Af318226
图3 用最大似然法建立的基于转录间隔区序列的系统发育树(节点旁的数字代表 1000次计算的百分比)
FiB．3 Maximum parsimony consensus tree resolved from ITS-rDNA nucleotide sequence(Numbers next to branching points indica~percentage of 1000
bootstraps)
可能与真实的情况有一定的偏差，从细胞形态、大小和顶沟的形态学特征基本可以认为这一株裸甲藻应该是
纤小裸甲藻。
3．2 生长特征
九龙江口海水盐度的变化很大，随着与外海的距离不同而有差异，在退潮时最低的可降到4，而涨潮时又
回到28。本次赤潮持续时间超过了48h，虽然纤小裸甲藻在低盐度下不能生长，但大部分能存活下来，这为纤
小裸甲藻赤潮的形成和维持创造了条件。
6月初和 10月至 11月的海水温度在纤小裸甲藻的最适生长温度范围内，也是该种发生赤潮可能性最大
的时间。但是温度只是影响藻类生长的一个条件，其他如盐度、营养盐、光照条件都有一定的影响，而且藻类
的快速生长只是赤潮发生的一个基本条件 ¨，大部分的赤潮并不是藻类原地大量繁殖形成的，而是由其他区
域的藻类通过特殊的海流聚集才会形成 ，其他如浮游动物捕食的减少 ¨ 也对赤潮形成有一定的贡献，这可
能是厦门港仅仅在2003年6月发生了大规模裸甲藻赤潮的原因。
在过去的2O年中，裸甲藻在中国海域曾多次引发过赤潮。比如珠江口1998年发生大规模的米金裸甲藻
( ni口mikimoto )和红色裸甲藻(Akashiwo sanguenia)赤潮 ，烟台 1998年也发生大规模的红色裸甲藻赤
潮 。厦门海域曾在 1986年发生过一次裸甲藻赤潮，密度达到 1O 个／L ，据了解，沉寂了很多年后，2003
年7月再次发生了大规模的裸甲藻赤潮，密度达到了 1O 个／L，而 2004年也多次发生小规模的裸甲藻赤潮。
厦门海域裸甲藻赤潮发生的频率有增加的趋势。
3．3 本株裸甲藻未能检测到麻痹性贝毒和神经性贝毒，由于没有对当时的赤潮水样进行毒素检测，因此仍不
能排除其他株系也是无毒的。
3．4 分子特征
通过 ITS序列建立的系统发育树没有能够把 Karlodinium属和 Takayama属分开，而用 28序列建立的系统
发育树则能够把它们区分开 ，与 28S序列相比，ITS序列进化速度更快，也经常用来在属和种的水平上作进
化分析 ，并成功地区分亚历山大属和斯氏藻属下的各个种 ¨。 ，但得到的结果却有点令人费解。从 ITS 碱
基数来看，纤小裸甲藻与 Karlodinium micrum最为接近。分别是212，159和216。而裸甲藻科其他种类这3个片
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段的碱基数都和它们有较大的差异 ，这也再次证明了 ITS的长度可以作为一个有用的种类标志 。另外
这两个属都有墨角藻黄素 ，说明色素在分类上也具有重要的作用。通过 ITS序列建立的系统发育树大致能
够把 Akashiwo属、Karenia属、Karlodinium属和 ， 属与 Gymnodinium属区分开来，但多甲藻的种类和
Gymnodinium sp．混在一起，而 Gymnodinium属的种类并没有有效地聚合在一起，可能的原因是裸甲藻缺少有
效的分类依据，还有待人们发现并进一步的细分种类，这从最近 ， 属根据 s形的顶沟而从裸甲藻属分
离出来能够得到验证；另外一个原因是目前采用的包括 18s，28s和 ITS这些片段的序列用来区分裸甲藻都不
是很有效 0 ，需要寻找更适合的片段。
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