全 文 ：第1 8卷第4期
1 9 9 8年 7月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGKA SINICA
／ VOI-18．No．4
Ju1． 1 gg8
Pb 、Cd 、Hg 对蚕豆(Vicia faba L．)
乳酸脱氢酶的影响 (．
． ／
段昌群 王焕校
(云南大学生物系 云南大学进化生态学研究实验宣 昆明 650091)
■要 Pb～、Cd 、Hg"浓度分别小于5．00mg／kg、2．00mg／kg，0．50mg／kg时，蚕豆 (Viola矗ba L．)乳酸聪
氲蔫(LDH)的活性高于对照组，当处理剂量分捌升高超过上逮剂量时，LDH活性显著地降低．分析不同圬染
处理条件下的LDH同工酶，发现其5种同工蔫在不同金属以及同一金属的不同剂量处理条件下．有差异表达
的特性．其中 LDH{在小剂量重金属作用下被诱导表达|LDH·对金属离子反应比较敏感，LDH，和 LDHs对金
属其有较好的抗逆性．由于各同工酶生理功能的差异性．从而认为重金属作用下 LDH的适应性变化 ，只是一
种生理功能的补偿．降低了植物对物质和能量的利用效率．显示出 适应代竹 ．幸文还讨论了重金属对植物
生理过程的髟响方式和机理．
关■调t 己豇 如L-)!星垒曼， 望 睦遣丝· 回三蔓·运宣堡垒-
THE EFFECTS oF LEAD，CADM IUM AND M ERCURY
IONS ON LDH IN Vicia faba
Duan Changqun W ang Huanxiao
(Biology Dt．aartmtnt＆ E咖 “彻4 geology Laboro~ry-Yunnan University，Kunming·650091·China)
Abstract The activity of Lactate dehyderogenase(LDH)in broadbean was enhanced un—
der the treatment by Pb”，Cd ，Hg”at the concentration of 5．00mg／kg、2．00mg／kg and
0．50 mg／kg respectively ver the concentrations stated above，it went down．using elec—
trophoresls，5 LDH isozymes were presented differentially under treatment by different
metal ions at different dosages．Among them ，LDH：was induced by lower concentration of
meta1 ions．LDH．was sensitive to meta1 ions and dispeared when treated with enhanced
concentrations．LDHa AND LDH 5 were tolerant to metaIions．the effect of the differentia1
expression of LDH isozymes on the total activities of LDH and their impact on physiologi—
ca1 ecological precesses in plants were discussed．Adaptation cost was put forward as a con-
cept．
Key words： Vicia丘ba L．，LDH activity，isozyme of LDH．molecular ecological differen—
tialtion，heavy meta1 ions，adaptation COSt．
*国家自然科学基金和云南省应用基础研究基金资助项目
幸文成稿过程中得到蔓龊侨，普瑞光教授的指导．特此致谢
收稿日期：1 995—12-21．修改稿收到日期：1996 10—27．
—√，
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90年代以米，不少研究发现环境对生物的塑造作用和生物对 环境的适应性往往在生物体内大分子的
功能括性与结构特性上也有所俸现，并把分子标记作为主要突破口，促使宏观与微观生物学相互融合并孕
育出了一门新型分支学科——分子生态学 ]。目前，在分子生态学中常用的分子标记有NDA印迹(fin
gerprinting)、散星体(mierosatellite)序列分析、随机引物扩增的DNA多态性(PRPD) 及结构蛋白和酶蛋
白的电泳分析“ ]。本文 乳酸脱氢酶(LDH)的活性和同工酶电蔼=图谱的变化为分子标记，探讨了蚕豆
(V出 矗 L-)在重金属污染作用下LDH的变化及其生态学意义，为进一步研究重金属对植物的生态毒
理作用与植物的适应提供资料。
1 材料和方法
1．1 材料
蚕豆(Vicia ba L．)种植品系为4015连续多代筛选种，由云南省农业科学院豆科研究所提供。
1．2 方法
1．2．I 材料培养与重金属污染处理 各处理组均取蚕豆种子2o粒．经5 NaCIO~20min消毒后，放置在
培养皿中萌发。第3天，用作空白对照的处理组用去离子水继续培养，其它各组用预先以去离子水配制成的
重金属离子溶液(Pb抖、CA蚪、Hg抖分别由分析纯的 PbCI2、CACI。、HgCI 配制)更换原培养液，并达到实验设
计的最终浓度。分析LDH活性的实验中，P 、CA件、Hg}+各离子设计为5十浓度梯度．加上空白对照组共
计16十处理组。最终浓度设计分别为：Pb抖1．00mg／kg、5．00mg／kg、10．00mg／kg、15．00rng／kg、20．00rag／
kg，CA 0．50、2．00、3．50、5．00、10．00mg／kg，Hg 0．15、0．50 L．00、3．50、5．00mg／kgi电泳分析LDH同
工酶的实验中．3种金属离子各设计3十浓度，加上空白对照组共计1o十处理组。最终浓度设计分别为：Pb
5·00、10-00、20．00 mg／kg，Cd 2·00、5．00 10．00mg／kg—Hg”0．50、1．00、5．00 mg／kg。经模拟污染处理
72h后用去离子水冲洗 ，取子叶提取 LDH酶液
上述各组的培养条件为25c-pH 6．8，无光，除模拟污染处理以外，均以去离子水为种子发芽的外源
水 材料培养中不断打气保持种子所在的水介质为富氧条件。
1．2’2 LDH的括性测定 随机在同一处理组 的种子中各取子叶少许，共重1．00g，加入0．1mol／L pH 8．O
Tris—HCI缓冲液(古20 蔗糖、0．O06mol 抗坏血酸、0．006mol／L半胱氮酸、0．002mol／L琉基乙醇、
0-01mol／LNaPB)I．0ral，切碎 ．超声波破碎后 ，进行组织匀浆。匀浆液移至离心管中离心(4℃) 在2000×
g、4300×g、6500×g、8600×g和13500×g速度下均依次取上清液离心30min，除去上层悬浮的豆类蛋白
等，得到的 LDH提取液采用单位时间产物生成法测定 LDH酶的活性。LDH将催化底物乳酸脱氢 ．脱下的
萎可以把 NAD还原为 NADH，后者在340rim下有特征吸收峰，利用该特性分析 NADH的含量，从而测定
LDH的活性。具体步骤见文后参考文献[7]，井略改进。根据各提取酶液的活性状况，进行必要的稀释I缓冲
漓 pH为8 9，反应温度为邬℃-保温测定时间为5rain，用0．5 mol／L尿素使酶蛋白变性从而终止反应。
1·2-3 LDH同工酶的电泳分析 酶液提取方法同上-得到的酶液保存在一20X2冰箱中备用。实验参阅吴
鹤龄等方法 并作改 良。电蔼=采取聚丙烯酰胺凝胶非连续系统。浓缩腔2．5 、pH5．6，核黄紊光聚合1分离
腔6 -pH8．9-Tris一甘氨酸电极缓冲液(pH为8．0、内含抗坏血酸0．4mol／L、琉基乙酸0．02tool／L)。小电流
(等槽lmA)、长时间(16~24h)。染色用Heinaman配方．低温显色(28X2)、7~HAe固定，2o％乙酸一2 甘油
保存，测定各谱带相对位置-拍照-光密度自动扫描仪扫描(shimad叫一200型)分析各条带在该电泳样品中
自 相对含量。同一样品的酶谱中-经扫描得到各酶的相对含量(酶的总量以1oo 计，使不同次的实验结果
具有可比性和可加性)；取5次平行实验结果计算同一酶带的相对含量。
2 结果与分析
2—1 蚕豆子叶 LDH活性在不同重金属作用下的变化
经统计检验 +Pb 、Cd抖、Hg抖对 LDH活性的影响均达到了极显著水平(P
因处理元素的种类不同以及剂量不同，变化的幅度和作用的剂量曲线也不同 如 Pb抖在1．00mg／kg作用
下，LDH活性从来处理的对照值0-0482flmol／g·rain上升到0．0503,umol／g·min，升高了4．36 }当 Pb抖升
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4期 段昌群等 ：Pb 、cd 、Hgq对蚕豆(Vicia 【J-)乳酸脱氧酶的影响 ．115
高到5．00mg／kg，LDH活性上升到0．0576~mol／g-rain，
升高了19．5O |但当 Pb抖处理浓度上升 到10．00mg／
kg时。酶的活性略有下降，但仍高于对照15．76 ：当处
理浓度上升到15．00mg／kg时t酶的活性下降到只有对
照的74．65 Cd“f也有与此类似的情况，但酶活性的
比降值 (酶活性 下降倍数／金属浓度升高倍数)大于 苫
Pb卜。Hg“十的作用剂量曲线变化的状况也基本类似，即 一
在低浓度处理条件下。酶 的活性升高 ，而当 H ”十浓度
升高到一定值时，酶的活性降低，“至于当 Hg抖浓度
进 到 5．00mg／kg时，酶 的 活性 只有 对 照 条 件下 的
2g．04 。而且 它 的 比 降值却 远 大 于 Cd抖，更大 于
z． 同工酶谱及相对含量的变化 ：： ⋯
LDH活性的测定反映了该酶对重金属作用在量上 。 ⋯
的变化·而通过同工酶分析可以看出质上的变化。 1
：Pb +作甩曲线 Pb 2+eft州 ， curve；2tCd2．作用曲
本实验表明 ·蚕豆总共有5种 LDH同工酶 ·但在正 线cd抖 fiecti e ；3
1Hg2一作用曲线 Ha 一 fiec
常条件下tLDH 只表进出4种即缺乏 LDHz。在不同重 ci
金属 及相同重金属离子的不同浓度作用下．各处理
条件下的酶谱种类和各同工酶的相对含量有很太差异(见图2、表1)
表l 蛋豆LDH同工酶特性爱在不同重金属作用下的差异分化
Talbe l The charactartstlcs of LDH and their differentiation on Vicia faba L treated with various heavy
metal ions
LDH同工酶谱各杀带及相对百分音量 LDH isozyme patern~and their re Lative percentage in Conte~l
同工酶
一 ⋯
Pb 处理浓度 (rag／kg)
phz concentration
cd 处理椎度(rag／"kg)
Cd Comterltyatioa
Hg 处理浓度(mg／kg)
Hg concent ration
5．00 10．00 20．00 2 O0 5 00 10．00 0．50 1 00 5 00
A B C D E F G H I
L嘣 } l8 O士6．2 2．6~1 4 3“2=6 3 4 1士Y3．2 29．O±6 3O 9士1O．1 57．2士12 6 28 =B 3 36．8±9 2 31 6i10．1
LDI 2 B 6士7 3 10 2士4 2 一 一 151士3．2 】6 5士5 8 — 36 5士6 3 一 一
LD吼 26．9±8 9 2I．8±7 3 38 6：14 3 l8 5士7 6 17 7士6 2 3l 6士9 4 42．6=12 3 17．7士4 8 26 6~6 6 68 4=15 S
LDH2 — 14吐 6．4 】8 5：9 4 37 3士12 3 24 8_-9 i 一 一 】l O±3 3 16 6=4 6 一
LDH1 26．3=1 2 2 51 4土1 8 3 8．6士5 2 — 13 5士4．2 21 0士7．4 — 6 5=2 1 20 0士7．3 一
表中 表示该同工酵不存在 represeats on this isozyme exists in talble 1．
在低浓度金属离子作用下(Pb抖5．00mg／kg、Cd计2．Omg／kg、Hg抖o．50mg／kg)，5种同工酶 都表现出
来}但随着浓度的升高 ，部分酶带消失 ，如 Pb抖大于10．00mg／kg、Fig抖大于1．00mg／kg以及 Cd抖为lOmg／
kg时-LDH 消失；Cd 和 Hg抖分别大于5．00mg／kg处理下，LDH2消失；当Cd抖、Hg 处理浓度分别达到
1O．OO、5．0mg／kg时 ，强有 LDH。和 LDH s保持下来，其它均消失 在这一系列的变化过程中，相应各同工酶
的相对含量都有较大的变化(参见表1)
把各种处理条件下 LDH总活性与相应的同工酶谱进行对比分折可以看出，不同重金属处理条件下 ，
LDH酶的总活性得到了提高或降低，但在这种变化中，起主导作用的同工酶种类是不同的，表明各同工酶
的生态作用也是不同的 LDH。是一种诱导性同工酶 ，在低剂量的金属离子作用下诱导表现，并因此提高了
LDH酶的总活性。如当 Pb叶浓度为5．00mg／kg、Cd 浓度为2．00mg／kg、Hg抖浓度为0．50mg／kg时，它都
‰． J言
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416 生 态 学 报 l8卷
表现出程度不同的活性 }LDH．在提高了的金属离子作
甩下，该种同工酶谱容易被抑翩，如Pb蚪浓度为大于或
等于10．00mg／kg、Cd 浓度为10．00mg／kg、Hg 浓度
大于或等于1．00mg／kg时，LDH．都不表现活性。LDHs
和 LDH 则是对环境胁迫具有较高抗性的同工酶，在本
实验条件下．无论处理条件如何，它都保持一定的水
平 。
3 讨论
从本实验中各重金属离子对盛豆 LDH活性的比
降值影响的结果来看，说明它们的毒性大小是不同的-
即Pb抖
的特性与生物自身的代谢条件。有关的机理在国内外
的相关研究中有过较多的讨论_1 ．这里不再赘述．
田2 不同剂量1垒属作用下蠢豆(Viela扫k L．)
LDH同工尊谁(圈中A、B⋯I意义见衰1)
F ．2 Z：rmogrsmg of LDH Llo~me in bro．db~mex-
posd to ^ do岫 heivy metals in dlf{ertnt do~e*ige．
(A、B⋯I in tifs f un expr~ies the the 8咖 e mean-
iI1g inm k 1)
重金属对LDH影响方式同对重金属于细胞分裂、染色体畸变、截檀的发生 及棱酸与棱酸酶活性的
謦响，具有相似的规律性[． ．国内外大量的研究都发现，小剂量与大荆量的同一重金属元素对同一生理生
态反应具有相反的效应 ，即小剂量的重金属离子对代谢有一定的“促进 作用．而大荆量重金属离子则抑制
正常的生理生态过程 。目前，对于重金属作用的二重性的解释是 t低浓度作用下 ．植物应澈反应产生
保护作用，通过加速新陈代谢活动，产生大量代谢产物整合进入的金属 离子 ，或离子系的功能加强对进入
盘属离子的排出，在这一过程中植物都表现出被“促进 了的代谢反应{但另一方面 ．擞活了的代谢系统也
加速 了重金属的进入．反过来又抑制了植物的代谢活动山“ ，重金属作用下植物反应的表观效果取决于这
一 过程中两种反应哪一十占上风．在小荆量时，植物的应激反应大于重金属的毒害作用，金属的作用表现
出“积极”的促进作用，在大剂量时，情况刚好相反 ．
从本实验中可以看出，在不同剂量的重金属作用下．盛豆LDH酶蛋白分子有差异表达的现象。虽然不
同的同工酶在不同剂量的重金属作用下-表达与否互有差别-但在总体上都保证了蚕豆体内LDH具有一
定的活性水平，这样有利于持续地保持对代谢 中间产物乳酸的分解，维持内环境的稳定性．不过 ，当作用的
重金属浓度超过一定值后，酶的活性大大降低．
LDH不同的同工酶具有不同的生理特性，即在缺氧条件下LDH 活性水平高．主要催化丙酮酸还原为
乳酸{在古氧丰富的条件下．LDH，古量高．主要催化乳酸脱氲氧化产生丙酮酸，其它各类同工酶的功能处
于上述二者之间 。正由于这个原因，各同工酶的差异表达也使该酶在植物体内的功能结果上出现了差
异．如果以LDH3为对氧反应中性的同工酶，把LDH．、LDHs作为缺氧条件下发生作用的酶，LDH 、LDH2作
为富氧条件下发生作用的酶 。剐正常条件下 ，在同一样品中，LDH 与 LDH：的相对古量之和为23．8 ，小于
LDH．与 LDH；相对古量之和48．6 ，这符合萌发种子子叶内缺氧条件下的代谢情况。在本实验中，对于每
一 个金属离子而言，随着处理浓度的升高，(LDH +LDHz)／(LDH．+LDHs)值总体上有不断降低的趋势，
说明重金属离子作用使种子萌发过程中LDH向无氧呼吸的方向功能变化更为突出，这同已有的研究结果
是一致的[1 “]。由于无氧呼吸对能量的利用率低于有氧呼吸，所 随着金属浓度的升高，导致种子萌发过
程中能量产生和利用效率降低，使正常种子中储藏的物质不能保证种子的萌发和幼苗的生长，所以在重金
■污染地带，常书种子的萌发率低，幼菌瘦小[1 ．
从上述的讨论中可以看出，蚕豆 LDH同工酶是在重金属作用下展现出来的多分子形式，在一定程度
上维持了植物体 LDH的活性水平 ，避免了代谢产物 的积累造成的生理伤害，这是一种生理生态适应机
御 。但由于各同工酶作用效果的差异，使这种变化不是简单的生理替换，而只是功能的一种补偿，井使植
物的呼吸方式有向无氧呼吸方向发展的趋势．降低了植物的物质能量和利用效率，从而导致植物整体生理
功能的衰减．即存在适应代价(RdaptRtion cost)阿题[1 ”]．虽然 适应代竹 在这里作为对本实验结果的一
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4期 段昌群等：Pb¨ 、Cd"、Hg 对蚕豆( 4血妇 L．)乳酸脱氢酶的影响 417
种解释，但可能它具有比较广泛的意义。倒如对寒冷、干旱等环境适应的植物生态型·其整体生物量产生水
平往往低于正常环境条件下的植物类型 当然有关“适应代价 的同题尚需要进一步的研究。
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