全 文 ：< 『-，三6
第 19卷第 6期
]999年 u 月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vo【l19，No．6
N ov ，l999
选择性呼吸抑制技术在土壤细菌和真菌生物
量测定中的应用
(中国农业大学土壤和水科学系，北京，i00094
／j’
擒蔓 ：放线菌酮和链霉豪可 选择性地抑制土壤中真苗和细菌的葡萄糖诱导呼吸作用，但抑制效果仅 5o％左右 二者的
最适用量每克土分别为 8～12mg和 4~8mg．培养时间 低于 4h为好。在两十土壤上选择性呼吸抑制方法测定的结皋与
直接显徽镱计数法所得的结果相当，但是 ，加入链霉紊时，一十粘性土壤的葡萄糖诱导呼吸量不但 不被抑制．反而随链霉
豪加入量的增加，诱导呼吸量增加，是否与其商的牯粒含量有关乃需要敢进一步的研究 另还详细地讨论 了应用此方法
的有关问题
关量词：细菌生物量·真菌生物量{选择性诱导呼吸抑制作用 ：壕
The application of selective inhibition technique in the measure—
ment of soil bacterial and fungal ratio
LIN Qi-Mei (Depdn，w of．SoilⅡ d Warer Sde fP ，Chi d Agricultural Uni~wrMty．Beoing 100094，Chi 口)
Abstract：Glucose induced respiration can be selectively inhibited by cycloheximide and streptomycin．The
optimal quantities used in the three soils were 8～l 2 mg／g soil for cycloheximide and 4～8 mg／g soil for
streptomycin．The incubation time following glucose addition was less than 4 hours．The total inhibition
was about 5O of glucose—induced respiration．The bacterial and fungal ratios for soil samples No．1 and
No．2 were comparable with these measured by agar—film direct microscopy． It fafled in determining the
proporfon of bacteria and fungi for a clay soil siroce suhstrate induced respiration increased as streptomycin
addition W hether the high clay content results in the failure measurement needs more study The precau—
tion using this techniques is discussed too．
Key words：bacterial biomass{fungal biomass；selective inhibition
文章鳙号：1000 og33(i999)06 0921 06 中圈分类号：Q958 文献标诅码：A
一 般来说 ，由于缺乏碳源，土壤 中的微生物呼吸量很低。如果向土壤加入易分解的有机物，如葡萄糖，
则微生物的呼吸量在极其短的时间 内迅速增加 ，并且可维持近 4h投有大的变化 ，遗 时的呼吸量与土壤原
有的微生物生物量之间存在直线关系，叉称为基质诱导呼吸量．可作为土壤微生物生物量的指标 。如果
在加入葡萄糖的同时 ，向土壤加入细菌或真菌的抗生素，基质诱导呼吸就受到选择性 的抑制 ，使土壤中细
菌和真菌的生物量被分别测定出来 。Anderson＆Domsch 发现在一定的用量范围，放线菌酮只抑制真菌
的生长，对细菌和放线菌的生长没有影 响；而链霉素其抑制细菌和放线菌的生长，对真菌的生长没有影响 ，
并且成功地测定出几个耕地土壤细菌和真菌的生物量 ⋯ 一。用此方法．根际和根表土壤 。 及腐烂植物’ 中
的细菌和真菌生物量也被测量出来。但是 Ross等 报道这两种抗生素对基质诱导 o 的消耗没有选择性
抑制作用 ，WestIn：没有测定出一十生物量低的土壤的细菌和真菌生物量 ，Bewley段Parkinsonn 在一十有
机质含量很高的土壤也遭到失败 。因此．Insam 等 ” 提出．必须十分谨慎地应用此技术。
真接显微镜计数法是一十比较传统的方法 ‘．尽管非常繁琐费时．但仍然被广泛用于土壤中细菌和真
菌生物量的测定[is．16 。本项研究将用选择性诱 导呼吸抑制技术．测定 3种 不同土壤 中的细菌和真菌生物
基盘项 目 BBSRC和 BASF的资助项 目
本文在 P C Brookes博士的指导下完成．在此探表谢意
收辘日期：1997-08-24；修订 日期 ：1998—06 22
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生 态 学 报 19卷
量．井与直接 显微镜计数法所得的结果进行 比较 ，从而对选择性诱导呼呼抑制技术进行全面地评价 。
1 材料和方法
1．1 土壤
3个土壤 采自洛桑试验站长期定位试验地，用
荷兰土钻采集 ，土壤 1和土壤 2采 O～10cm土层土
壤 ，土壤 3采 0～23cm土层土壤．3种土壤的理化
性质见表 l。
采集的湿土迅速过 2mm 筛，去掉植物残体 和
可见的土壤 动物 ．将土壤湿度调节至 4O 的 田问
持水量 ，放入密封的铁桶 内．桶内有水和苏打 石灰
粉(以保持湿度 和吸收培养 过程中释放 的 COz)，
25℃下培养 7d，迅速分析或放在 5c的冷藏室中保
存 。
寰 1 土曩的理化性质
Table 1 s0．I p 0pentes
注：①Forage grasst②Winter wheat
1．2 选择性抑制基质诱导 CO 呼吸的测定
称取相当于 10～30g烘干土的湿土 ，放入 250ml藉 口三 角瓶中．分别加入(a)葡萄糖，(b)葡萄糖 十链
霉索 ，(c)葡萄糖一放线菌酮．(d)葡萄糖+链霉素十放线菌酮。葡萄糖用量为每克士6mg，用前按 1 4的比
例与柑石粉研细混匀 ，抗生素也一同研细混匀。与土壤充分混台 ．0．5h后，盖上盖子，在 25c下培养 ，定期
用气相色谱测定三角瓶 中 CO。浓度．井计算真菌和细菌的诱导呼吸量。
细菌生物量比例 ：(A—B)／(^ 一D)×100
真菌生物量比例 ：(A-C)／m —D)×100
^为仅加入葡萄糖土壤的呼吸量 ．B为加入葡 萄糖和链霉素土壤的呼吸量，C为加入葡萄糖和放线菌
酮土壤的呼吸量，D 为加入葡萄糖链霉素及放线菌酮土壤的呼吸量fA—B为细菌基质诱导呼吸量，A—C
为真菌基质诱导呼吸量 。
1．3 直接显微镜计数法测定土壤细菌和真菌的生物量
称少量湿土(0．5g左右)，加入融化的琼脂(1 )和土壤分散剂 ，在可控温超声波水浴土壤分散仪上处
理 15mln(水潜 60C左右)，用滴管吸取少量土壤悬浮液于血板池内，嗣成 lmm厚度的琼脂簿片．用台酚蓝
染色 ，在显微镜下计数，井测量个体大小．根据细胞密度 、干重和干物质 含碳量．计算细菌和真菌的生物量
碳．详细方法见林启美的文章 。
所有测定做 3次重复 ，用烘干土表示 ，但直接显微境计数做 4次平行 ，数据处理用 Genstat软件进行 。
2 结果
2．1 不同剂量抗生素对葡萄糖诱导呼吸的抑制作用
如图 1所示．当向土壤 加入一系列剂量的链霉素时．诱导呼吸受抑制作用呈 s型 ．大于 8mg／g土的用
量时 ．抑制作用提高．小于 4mg／g土的用量时，抑制作用降低．4～8mg／g土的用量，抑制作用程度保持不
变 ，为 l0 左右。诱导呼吸对加入放线菌酮的反应有所不同．用量超过 8mg／g土时．抑制作用迅速增加，达
到4o 。两个土壤结果非常一致。十分夸人不解的是，当向 3号土壤加入链霉索时，诱导 CO 呼吸量反而
随加入链霉素增加而增加(表 2)。
2．2 葡萄糖诱导呼吸的选择抑制作用
如果放线菌酮 用量为 8和 12rag／g土，链霉 素用量为 4和 6mg／g土 ．二者以不同配比加入土壤 中．在
连续培养时，分 阶段测定 CO 呼吸受抑制的程度 ．井计算细菌和真菌的百分 比 结果如表 3和表 4所示 。在
最初 的 2b(O．5～2．5h)，单独加入抗生素对诱导呼吸的抑制作用．与两抗生素同时加入时 ，其对诱导 呼吸抑
制作用的效果相同．亦即[(A—B)+(A—c)]，cA—D)的 比值接近 1 但随着培养时间的延长，比值增大
当两抗生索同时加入时．诱导呼吸作用仅抑制 50 ，且随着培养时间的延长而增加
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6期 林启美 ：选择性呼吸抑制技术在土壤细菌和真菌生物量测定中的应用 923
图 1 抗生素加入量与基质诱导 CO2呼吸抑制的关系(竖线表示标准误差
Fig·1 Relationship between antibiotic addition andinhibition of substrate—inducedCO2 respiration(B⋯ i rand d d
viatlon)
衰 2 抗生素对 3号土壤基质{I}导呼吸的抑制作用
Table 2 Inhibition of substrate-lnduced respiration by antibiotics in soil N0
． 3
*但加入葡萄糖 Only adding g[ucose ①Suhstrate induced respiration
衰 3 细曹和真曹生橱量比例的．删定(1号土壤)
Table 3 Measurement of the prol~ tlons bacterltl and fuagal blomass for soil No
． 1
I1c：投有计算 ，下同 Not calculated·same as other tables．①B且c 1a I fungi @Inhibition of sub tl-⋯i duced
respiration
3．3 直接显微镜计数法测定的细菌和真菌生物量
若微生物的 比重为 1．1，干物质含量为 2j ，干物质含碳量为 47％，镜捡法 测定的细菌和真菌生物量
的结果如表 5所示 =
船
； 髦 簦韭 ‰
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92t 1 9卷
表 4 细菌和真翦生物量比例的_删定f2号 壤1
Table 4 M easurement 0f the proporlions of bacterial and rungal biomass for soil No 2
衰 5 镜捡法谢定的细菌和真菌生物量
Table 5 Bacterild and fungal biomass measured by direct microscopic method
3 讨论
放线菌酮仅抑制含有 80SRNA细胞的蛋 白质合成．真棱细咆中舍肯 8OS RNA-所 放线菌酮对真菌、
藻类厦原生动物起作用。一般土壤 中藻类和原 生动物的生物 量比起真菌生物量要低傅多-在此处忽略不
计。链霉素抑制含有 708和 80SRNA细胞的蛋 白质合成 ． 棱生物细咆中仅 宵70SRNA-所 链霉素不仅
对细菌起作用，而且对真菌也起作用 但是，原位培养和培葬基培养试验证实 -秤 一定的用虽范国内．链霉
素仅抑制原棱生物细咆蛋白质的台成 ⋯ ：放线菌酮量呈中性-吸咐于士壤颗粒上二较少。m J谜霄索 碱性，
可以强烈地吸附在土壤颗粒 ，由于 同的土壤吸附能 力 一佯．所 以在实际操肯时-必； 衙先确定每 ·
种土壤 的杭 生素最合适的用量。图 1的结果表明，如果每克 加八链霉素超过 8mg／g十- 导呼吸受抑制
增强 ．在 ～8mg／g土的用 量．抑制作用几乎不变化 +低于 4mg／g上的用量 -抑制作片]：且建降低。显然，1号
和 2号土壤 ．链霉素的合适用量为 4～8mg／g土 ，而放线前酮的最适用量凡f 8Wag．"g上。Anderson B Dora
sch 每 克土用链霉 幕 0．5～3 mg-放线菌酮 _ll 5～ mgtBew]ey＆Parkinson 社霉素f【 欣找 的l}]
分别为 1～1 6 mg／g土和 1～32mg，g土 ；Wa rdle 8 Parkinson“ 则每克士用 10 mg链带索f_i J m 般线
菌酮。可见不同的供试材料 ．抗生素的用量筹 异根夫。s 壤牯粒含量最离，尽管链霉 索用量加凡到
16rag／g土 ，诱导呼吸投有受到任何抑制作 ，反而随着链霉索加入量的增 加而量比例的提高。是 与 梧
粒 照高响* ．¨ 前迁没有直接的证摧 ，需要世 rj 研究
如 粜妓线茼酮和链霉 素选择性地抑制诱 呼嗡咋 01]． 1．[r j_B)+ (A一()： (A DⅦ々此fCt J2 1：
o． J 如 衷 3 走 I所，未．填}匕何 勾 ll_cl3 1．3 ．沣l_随l I、¨Iij近k⋯ ‘、．小 抑 似 flJ失l土
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6期 林启美 ：选择性 呼嗳抑制技术在土壤细菌和真菌生物量测定中的应用 925
了选择性 。Beare等0一也发现同样的现象。其原因不清楚 。
根据 AndersDn＆Domsch r 的方程．只有当 A一[(A-B)+(^ -C)]一D土5 时 ，计算出的细菌和真
菌的百分 比才有效 。据此，本文所用的 2个土壤细菌和真菌的比例 为 l号土壤 ，细菌占 12 ～24 ，真菌占
78～88 ．平均值分别为 l9 土4．2 和 82 土4．0 }2号土壤则为 25 ±1．2 和 76 土4．5 (表 3·表
4)。可见真菌是供试的两个土壤绝对优势的微生物群落．Anderson＆Domsch 和 Wardle＆Parkinson 也
得到相似的结果 。
Ivarson＆Sowden_] 发现如果向培养基加入
放线菌酮，细菌生长加快}如果培养基 中有链霉 素
存在时，真菌生长加快 。Anderson＆Domsch 也提
出抗生素抑制某一微生物的生长，同时刺激另一微
生物的生长，如果发生这 一现象，(^ -B)／(^ -C)
的 比值将大大改变 。但表 6的结果表明这一比值的
变化并不太大，尤其在短时间培养时．几乎投有变
化；这充分说明加入放线菌酮时，并投有 由于抑制
真菌呼嗳 ，而刺激细菌的呼吸作用，反之亦然。
综上所述，在一定的浓度范围内，放线菌酮和
链霉 素可以分别选择性 地抑制土壤 中的真菌和细
菌基质诱导呼吸作用 ，并 由此测定出土壤的细菌和
真菌的生物量 ，其测定的结果与真接显教镜计数法
寰 6 细■与真■呼吸的比值(A—B)／(A—c)(1争土
Tsble 6 The ra tio 0f 5~ lertal to fuagal respiration
f0r soil No．1
抗生紊配对浓度(mg 土) INNN~(h)Tim Lnterva[
Pafred ant1biotic
*S：链霉素 ．Streptomycin C}故线菌酮 ．Cycloheximide．
所得的结果极为接近。由于抗生素可以吸附于土壤颗粒上而失效，同时又可作为微生物 的 C源 ，所 在最
适用量范围内，尽可能地加大用量，同时缩短培养时间，以少于 4h为宜 但是由于仅一半左右的诱导呼吸
作用受到抑制 ，现在还没有直接的证据证实受与不受抗生素抑制的微生物生物量 ．是否有同样 比例的细菌
和真菌生物量 。所以正如 Bewley＆Parkinson：圳警告的那样．必须同时应用其它的方法 ．以检查结果的准
确定 。
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