全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员员袁圆缘渊缘冤院园愿怨愿 耀 园怨园猿允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员员冤园缘鄄园愿怨愿鄄园远
中度嗜热菌 阅藻蚤灶燥糟燥糟糟怎泽 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽的自发突变特征
马婷婷摇 汪摇 虎摇 田摇 兵摇 华跃进
渊浙江大学原子核农业科学研究所 辕农业部核农学重点开放实验室袁浙江 杭州摇 猿员园园圆怨冤
摘摇 要院通过 则责燥月 辕 砸蚤枣则 系统研究了 阅藻蚤灶燥糟燥糟糟怎泽 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 阅杂酝 员员猿园园 的自发突变模式遥 在 猿园益和 缘园益
分别获得自发突变株并测定其相应温度条件下的突变频率和突变率遥 结果表明袁猿园益培养下该菌的自
发突变率是 缘园益培养的 圆 倍袁二者有 圆圆 个不同的突变位点袁表明温度影响了该菌的自发突变遥 此外袁
缘园益培养的细菌 杂韵阅和 悦粤栽酶活性均强于 猿园益袁其 杂韵阅和 悦粤栽基因的表达水平也是 猿园益培养的 员郾 缘
倍之多遥 说明 阅援 早藻贼澡藻则皂葬蚤造泽在 猿园益培养时突变率上升与其细胞内抗氧化酶的表达和活性下降相关遥
关键词院则责燥月 辕 砸蚤枣则曰自发突变曰突变率
悦匀粤砸粤悦栽耘砸陨在粤栽陨韵晕 韵云 杂孕韵晕栽粤晕耘韵哉杂 酝哉栽粤栽陨韵晕杂 陨晕
粤 酝韵阅耘砸粤栽耘 栽匀耘砸酝韵孕匀陨蕴耘 阅藻蚤灶燥糟燥糟糟怎泽 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽
酝粤 栽蚤灶早鄄贼蚤灶早摇 宰粤晕郧 匀怎摇 栽陨粤晕 月蚤灶早摇 匀哉粤 再怎藻鄄躁蚤灶
渊运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 枣燥则 晕怎糟造藻葬则鄄粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽 燥枣 悦澡蚤灶藻泽藻 酝蚤灶蚤泽贼则赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则藻 葬灶凿 在澡藻躁蚤葬灶早 孕则燥增蚤灶糟藻袁
陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 晕怎糟造藻葬则鄄粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 在澡藻躁蚤葬灶早 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 匀葬灶早扎澡燥怎袁 在澡藻灶早躁蚤葬摇 猿员园园圆怨冤
粤遭泽贼则葬糟贼院粤 泽责燥灶贼葬灶藻燥怎泽 皂怎贼葬贼蚤燥灶 责葬贼贼藻则灶 蚤灶 阅藻蚤灶燥糟燥糟糟怎泽 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 阅杂酝 员员猿园园 憎葬泽 皂藻葬泽怎则藻凿 遭赠 怎泽蚤灶早 贼澡藻 则责燥月 辕 砸蚤枣则
泽赠泽贼藻皂援 栽燥 蚤灶增藻泽贼蚤早葬贼藻 贼澡藻 则藻造葬贼蚤燥灶泽澡蚤责 遭藻贼憎藻藻灶 泽责燥灶贼葬灶藻燥怎泽 皂怎贼葬贼蚤燥灶 葬灶凿 早则燥憎贼澡 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻袁 泽责燥灶贼葬灶藻燥怎泽 皂怎贼葬灶贼泽 憎藻则藻
早藻灶藻则葬贼藻凿 葬贼 糟怎造贼怎则藻 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻泽 燥枣 猿园益 葬灶凿 缘园益袁 葬灶凿 贼澡藻 糟燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早 皂怎贼葬贼蚤燥灶 枣则藻择怎藻灶糟蚤藻泽 葬灶凿 则葬贼藻泽 憎藻则藻
皂藻葬泽怎则藻凿援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 遭葬糟贼藻则蚤葬 糟怎造贼怎则藻凿 葬贼 猿园益 澡葬凿 葬 贼憎燥鄄枣燥造凿 澡蚤早澡藻则 泽责燥灶贼葬灶藻燥怎泽 皂怎贼葬贼蚤燥灶 则葬贼藻 贼澡葬灶
贼澡葬贼 糟怎造贼怎则藻凿 葬贼 缘园益袁 葬灶凿 圆圆 皂怎贼葬贼蚤燥灶 泽蚤贼藻泽 凿蚤枣枣藻则藻凿 遭藻贼憎藻藻灶 贼澡藻 遭葬糟贼藻则蚤葬 早则燥憎灶 葬贼 猿园益 葬灶凿 缘园益袁 蚤灶凿蚤糟葬贼蚤灶早 贼澡葬贼
贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 葬枣枣藻糟贼藻凿 燥灶 贼澡藻 泽责燥灶贼葬灶藻燥怎泽 皂怎贼葬贼蚤燥灶 燥枣 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽援 栽澡藻 葬糟贼蚤增蚤贼蚤藻泽 燥枣 杂韵阅 葬灶凿 悦粤栽 燥枣 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽
早则燥憎灶 葬贼 缘园益 憎藻则藻 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造赠 澡蚤早澡藻则 贼澡葬灶 贼澡燥泽藻 早则燥憎灶 葬贼 猿园益袁 葬灶凿 贼澡藻 杂韵阅 葬灶凿 悦粤栽 早藻灶藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 造藻增藻造泽 蚤灶 阅援
早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 葬贼 缘园益 憎藻则藻 葬遭燥怎贼 圆鄄枣燥造凿 澡蚤早澡藻则 贼澡葬灶 贼澡燥泽藻 早则燥憎灶 葬贼 猿园益 援 栽澡藻泽藻 则藻泽怎造贼泽 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 藻造藻增葬贼蚤燥灶 燥枣
皂怎贼葬贼蚤燥灶 则葬贼藻 憎澡藻灶 早则燥憎灶 葬贼 猿园益 憎葬泽 葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿 憎蚤贼澡 葬 凿藻糟造蚤灶藻 燥枣 贼澡藻 葬灶贼蚤燥曾蚤凿葬灶贼 藻灶扎赠皂藻泽 蚤灶 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽援
运藻赠 憎燥则凿泽院则责燥月 辕 砸蚤枣则曰泽责燥灶贼葬灶藻燥怎泽 皂怎贼葬贼蚤燥灶曰皂怎贼葬贼蚤燥灶 则葬贼藻
收稿日期院圆园员园鄄员员鄄员园摇 接受日期院圆园员员鄄员圆鄄员园
基金项目院国家野愿远猿冶项目渊圆园园苑粤粤园圆员猿园缘冤袁国家自然科学基金重点资助项目渊猿园愿猿园园园远冤袁重大新药创制科技重大专项渊圆园园怨在载允园怨园园员鄄园猿源冤袁转
基因生物新品种培育重大专项项目渊圆园园怨在载园愿园园怨鄄园苑缘月冤袁农业部行业专项渊圆园园愿园猿园猿源冤
作者简介院马婷婷 渊员怨愿缘鄄冤袁女袁陕西宝鸡人袁硕士研究生袁 研究方向为 阅晕粤修复遥 栽藻造院园缘苑员鄄愿远怨苑员圆缘员曰耘鄄皂葬蚤造院贼蚤灶早贼蚤灶早援 员员怨岳 员远猿援 糟燥皂
通讯作者院华跃进渊员怨缘怨鄄冤袁男袁浙江东阳人袁博导袁教授袁研究方向为 阅晕粤修复遥 栽藻造院园缘苑员鄄愿远怨苑员苑园猿曰耘鄄皂葬蚤造院赠躁澡怎葬岳 扎躁怎援 藻凿怎援 糟灶
摇 摇 阅藻蚤灶燥糟燥糟糟怎泽 属的细菌对电离辐射都具有很强的抗
性遥 与该类中其他成员不同袁阅藻蚤灶燥糟燥糟糟怎泽 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽
可以在高达 缘缘益下进行培养咱员暂 袁因此 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽
作为遗传工程菌株袁被应用于由于放射性物质渊如员猿苑悦泽
和怨园杂则冤长期衰变而导致环境温度升高咱圆暂的放射性废
物的生物治理工程中咱猿暂 遥 目前袁虽然通过比较基因组
分析 还 不 能 清 楚 解 释 阅援 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽 或 者 阅援
早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽强大的 阅晕粤 修复原理袁但高效的 阅晕粤 修
复蛋白和细胞清除系统都对它们的抗性表型具有重大
贡献咱源暂 遥
研究 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽的自发突变模式不仅有助于
了解嗜温生长条件与其野生突变发生之间的关系袁对
愿怨愿
摇 缘 期 中度嗜热菌 阅藻蚤灶燥糟燥糟糟怎泽 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽的自发突变特征
该菌抗性机制的研究也有一定的助益遥 同时袁突变率
也是研究细菌的适应性和进化机制的重要参数遥 圆园园猿
年袁 郧葬则蚤遭赠葬灶 等 利 用 则责燥月 辕 砸蚤枣则 系 统 法 分 析 了
耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 的突变谱咱缘暂 遥 细菌 砸晕粤聚合酶的 茁亚
基是一段可以结合在利福平上的保守序列袁耘援 糟燥造蚤 经
利福平诱导后会导致该序列的氨基酸发生改变咱缘暂 遥
目前袁该 则责燥月 辕 砸蚤枣则 突变分析系统已被广泛应用于 耘援
糟燥蚤造蚤袁 月葬糟蚤造造怎泽 泽怎遭贼蚤造蚤泽袁 匀藻造蚤糟燥遭葬糟贼藻则 责赠造燥则蚤袁 阅援
则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽袁 酝赠糟燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂 贼怎遭藻则糟怎造燥泽蚤泽袁 孕泽藻怎凿燥皂燥灶葬泽
泽贼怎贼扎藻则蚤袁 晕藻蚤泽泽藻则蚤葬 泽责藻糟蚤藻泽 等咱远 耀 员猿暂 遥 该系统能被用于分
析 阅援 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽的突变谱主要基于 则责燥月 基因的保守
性咱员源暂 遥 圆园园愿 年袁华孝挺等就利用 则责燥月 辕 砸蚤枣则 系统法分
析了耐辐射球菌 则藻糟匝突变株和四突变株 怎增泽耘尧怎增则粤员尧
怎增则粤圆尧则藻糟匝 的突变情况咱员缘袁员远暂 袁结果证明 则藻糟匝参与了耐
辐射球菌的紫外损伤修复途径遥 此外袁细菌在有氧代
谢过程中产生的活性氧自由基渊砸韵杂袁则藻葬糟贼蚤增藻 燥曾赠早藻灶
泽责藻糟蚤藻泽冤是诱发自发突变的原因之一咱员苑暂 遥 耐辐射球菌
中的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶渊杂韵阅袁泽怎责藻则燥曾蚤凿藻
凿蚤泽皂怎贼葬泽藻冤和过氧化氢酶渊悦粤栽袁糟葬贼葬造葬泽藻冤袁它们对该菌
清除 砸韵杂 和抵抗氧化压力具有重要作用咱员愿暂 遥 因此袁
抗氧化酶对 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 的突变率和突变谱可能也
存在着一定的影响遥 本文利用 则责燥月 辕 砸蚤枣则系统法分析
了 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽的突变率和突变谱袁这是第 员 次对
该菌的突变情况进行研究遥 该研究有助于阐明该菌的
极端耐辐射抗性机制遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 菌株和生长条件
阅藻蚤灶燥糟燥糟糟怎泽 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 阅杂酝 员员猿园园 菌株渊阅葬造赠 赠
送冤在 缘园益和 猿园益分别培养于 栽郧再渊员郾 园豫 蛋白胨袁
园郾 缘豫 酵母浸粉袁园郾 员豫 葡萄糖冤培养基中或 栽郧再平板
渊加入 员郾 缘豫的琼脂冤上遥 利福平渊购买自上海生工冤
溶解于二甲亚砜渊购自 杂蚤早皂葬公司冤中遥 将菌株接种于
新鲜的 栽郧再培养基中过夜培养至 韵阅远园园为 员郾 园 用于后
续试验遥
员郾 圆摇 突变频率和突变率测定
突变频率的测定参考华孝挺等的方法咱员远暂 遥 突变
率的测定参照 阅则葬噪藻 等的方法咱员怨暂 遥 在 猿园益和 缘园益温
度条件下分别平行培养 员园 瓶遥 圆 个温度条件下样本
的突变频率和突变率的差别利用 杂贼怎凿藻灶贼爷泽 贼憎燥鄄贼葬蚤造藻凿 贼
贼藻泽贼统计法进行分析遥
员郾 猿摇 阅晕粤提取和 则责燥月基因的测序
将 韵阅远园园为 员郾 园 的新鲜菌液涂布在 栽郧再渊含 缘园滋早 辕
皂造利福平冤平板上袁缘园益过夜培养后用于提取基因组
和测序遥 每个平板上分别随机挑取 缘 个克隆子培养于
员郾 缘皂造的培养基中遥 当细菌生长到 韵阅远园园 越 员郾 园 时在员园袁园园园早 下离心 员皂蚤灶袁将收集到的菌体重悬于 圆园园滋造
的磷酸盐缓冲液中遥 然后加入 源园园滋造苯酚颐氯仿颐异戊
醇院源颐 猿颐 猿混合液和 员园园滋造 的二氧化硅袁上下翻倒摇晃
后在 员猿园园园早 下离心 猿园皂蚤灶遥 上清液转入新的离心管
中并加入 圆园园滋造 异丙醇遥 混匀后在 原 圆园益 孵育
圆园皂蚤灶袁再 员猿园园园早离心 员园皂蚤灶遥 将收集到的 阅晕粤 用酒
精洗 圆 遍后室温下放置 猿园皂蚤灶遥 最后每管中加入 缘园滋造
栽耘缓冲液遥
为测序设计了 圆 对引物遥 大部分突变发生的区域
可以 用 引 物 缘忆鄄粤粤粤悦郧郧栽悦粤悦郧粤栽郧郧郧粤郧悦鄄猿忆 渊 缘忆
责燥泽蚤贼蚤燥灶 怨苑源冤 和 缘忆鄄栽粤郧郧栽悦粤悦郧悦郧郧悦悦郧郧栽悦粤鄄猿忆渊缘忆
责燥泽蚤贼蚤燥灶 员愿愿猿冤来扩增袁另外的 砸蚤枣则 突变子用引物 缘忆鄄
栽栽栽悦悦郧粤栽栽郧粤悦郧粤郧粤悦悦郧鄄猿忆渊缘忆责燥泽蚤贼蚤燥灶 员苑缘冤 和 缘忆鄄
悦粤悦郧粤栽郧郧郧郧 悦郧郧栽栽郧栽栽鄄猿忆渊缘忆责燥泽蚤贼蚤燥灶 员圆园猿冤来进行
扩增遥 孕悦砸产物经纯化后寄往南京金斯特公司进行
测 序遥 测 序 引 物 为院 则责燥月员泽藻择 缘忆鄄
悦郧悦粤栽郧悦栽郧悦栽郧郧郧郧粤粤悦鄄猿忆 渊 缘忆 责燥泽蚤贼蚤燥灶 员员猿苑 冤 和
则责燥月圆泽藻择 缘忆鄄悦栽悦悦栽栽栽郧栽郧粤栽悦粤粤悦郧郧鄄猿忆 渊 缘忆 责燥泽蚤贼蚤燥灶
猿怨愿冤遥
员郾 源摇 砸栽鄄孕悦砸
将菌株分别在 猿园益和 缘园益培养至 韵阅远园园为 园郾 猿袁置
于冰上袁在 源益下 员猿袁园园园早 离心 缘皂蚤灶遥 通过 栽砸陨扎燥造 和
异丙醇沉淀法提取总 砸晕粤遥 砸栽鄄孕悦砸 反应试剂盒为
杂怎责藻则泽糟则蚤责贼 陨陨陨 藻灶扎赠皂藻 渊 陨灶增蚤贼则燥早藻灶 冤 葬灶凿 砸葬灶凿燥皂
澡藻曾葬皂藻则泽遥 以 则责燥月基因转录的 皂砸晕粤 作为内参基因遥
测定 猿园益和 缘园益时的 杂韵阅尧悦粤栽 等基因相对于 则责燥月
基因的转录水平遥 每个靶基因做 猿 次重复试验遥 砸栽鄄
孕悦砸中所用的引物列于表 员遥
表 员摇 实验所用到引物
栽葬遭造藻 员摇 孕则蚤皂藻则泽 怎泽藻凿 蚤灶 贼澡蚤泽 泽贼怎凿赠
引物 责则蚤皂藻则 序列 泽藻择怎藻灶糟藻
则责燥月鄄责员 悦栽悦悦粤郧郧栽郧郧郧栽郧粤悦粤粤郧郧栽
则责燥月鄄责圆 悦郧粤郧郧栽郧悦郧栽栽栽悦悦粤郧粤粤栽悦
阅郧 杂韵阅鄄孕员 郧悦粤郧悦粤郧栽栽栽郧粤郧郧粤悦郧
阅郧 杂韵阅鄄孕圆 悦悦悦粤栽悦粤郧悦郧郧郧栽栽郧栽
阅郧 悦粤栽鄄孕员 悦悦悦栽悦粤粤悦悦郧悦粤粤栽悦悦
阅郧 悦粤栽鄄孕圆 悦郧悦栽郧郧郧栽郧栽悦悦郧粤粤栽
员郾 缘摇 杂韵阅和 悦粤栽蛋白活性的测定
阅援 早藻燥贼藻则皂葬造蚤泽的细胞裂解液中的 杂韵阅 蛋白活性
用 杂韵阅 粤泽泽葬赠 噪蚤贼试剂盒 渊粤园园员 原 员袁南京建成生物公
司冤 进行测定袁具体步骤参照其说明书袁检测试验在
怨怨愿
核摇 农摇 学摇 报 圆缘 卷
缘园益下进行遥 悦粤栽 蛋白的活性测定参照陈欢等的方
法咱圆园暂 遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽的突变频率和突变率
将 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 阅杂酝 员员猿园园 在 猿园益和 缘园益的
栽郧再平板上渊含 缘园滋早 辕 皂造 利福平冤分别培养获得 砸蚤枣则
突变株遥 表 圆 为不同温度下该菌的突变率和突变频
率遥 由表 圆 可看出在 猿园益和 缘园益下培养下袁菌株的突
变率存在明显差异渊孕 约 园郾 园缘冤袁野生株在 猿园益的自
发突变率是 缘园益培的 圆郾 远 倍遥
分离了 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽在不同温度下培养得到的
砸蚤枣则 突变株并对其基因组中的 则责燥月 区域进行测序遥
在 猿园益条件下挑取了 缘远 个突变株袁其突变结果如表 猿
所示遥
表 圆摇 砸蚤枣则 突变株 则责燥月基因的突变频率渊 枣冤和突变率渊滋冤
栽葬遭造藻 圆摇 酝怎贼葬贼蚤燥灶 枣则藻择怎藻灶糟蚤藻泽 渊 枣冤 葬灶凿 则葬贼藻泽 渊滋冤 蚤灶 早藻灶藻 则责燥月 燥枣 砸蚤枣则 皂怎贼葬灶贼
菌株
泽贼则葬蚤灶
温度
贼藻皂责藻则葬贼怎则藻
突变频率
枣渊员园 原愿 冤
突变率
滋 渊员园 原愿 冤
野生型 憎蚤造凿 贼赠责藻 猿园益 苑郾 远猿缘 渊缘郾 园圆 耀 员园郾 圆缘冤 员郾 源缘员 渊员郾 远怨苑 耀 圆郾 源愿猿冤
野生型 憎蚤造凿 贼赠责藻 缘园益 员郾 源园缘 渊园郾 圆怨 耀 猿郾 员园冤 园郾 缘缘怨 渊园郾 员缘愿 耀 园郾 愿苑猿冤
摇 摇 注院括号中的值是 怨缘豫置信区间遥
晕燥贼藻院栽澡藻 皂怎贼葬贼蚤燥灶 则葬贼藻 憎葬泽 凿藻贼藻则皂蚤灶藻凿 遭赠 贼澡藻 皂藻贼澡燥凿 燥枣 阅则葬噪藻咱员怨暂 援 灾葬造怎藻泽 蚤灶 责葬则藻灶贼澡藻泽藻泽 葬则藻 怨缘豫 糟燥灶枣蚤凿藻灶糟藻 造蚤皂蚤贼泽援
表 猿摇 猿园益下 砸蚤枣则 诱导的 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽的基因突变情况
栽葬遭造藻 猿摇 阅蚤泽贼则蚤遭怎贼蚤燥灶 燥枣 皂怎贼葬贼蚤燥灶泽 造藻葬凿蚤灶早 贼燥 砸蚤枣则 蚤灶 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 葬贼 猿园益
阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 的
突变位点
酝怎贼葬贼蚤燥灶 泽蚤贼藻 燥枣
阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 渊遭责冤
氨基酸变化
葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 糟澡葬灶早藻
碱基对替换
遭葬泽藻鄄责葬蚤则 糟澡葬灶早藻
突变发生次数
皂怎贼葬贼蚤燥灶 灶怎皂遭藻则
阅援 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽 中的对应位点
糟燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早
泽蚤贼藻 燥枣 阅援 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽 渊遭责冤
员圆源源遭 匝源员缘砸 粤栽寅郧悦 员 员圆远缘
员圆圆缘遭 郧源园怨杂 郧悦寅粤栽葬 员 员圆源远
员圆缘圆 阅源员愿晕 郧悦寅粤栽 圆猿 员圆苑猿
员猿怨园遭 耘源远源运 郧悦寅粤栽 猿 员源员员
员圆苑员遭 杂源圆源云 郧悦寅粤栽葬 员 员圆怨圆
员圆愿圆 匀源圆愿 郧悦寅粤栽 员园 员猿园猿
源猿猿 陨员源缘云 粤栽寅栽粤 圆 源缘苑
员员愿远遭 晕猿怨远匀 粤栽寅悦郧葬 员 员圆园苑
员圆愿猿遭 匀源圆愿蕴 粤栽寅悦郧 怨 员猿园源
员圆源猿遭 匝源员缘运 郧悦寅栽粤葬 源 员圆远源
员圆愿源遭 匀源圆愿匝 郧悦寅栽粤 员 员猿园缘
总计 贼燥贼葬造 员员 缘远
摇 摇 注院葬 与 阅援 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽对应不同的碱基替换曰遭 与表 源 对应不同的突变位点遥
晕燥贼藻院葬 栽澡藻 糟燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早 遭葬泽藻 葬灶凿 遭葬泽藻 糟澡葬灶早藻 蚤泽 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 蚤灶 阅援 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽 曰遭栽澡藻 糟燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早 遭葬泽藻 葬灶凿 遭葬泽藻 糟澡葬灶早藻 蚤泽 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 枣则燥皂 贼澡燥泽藻 蚤灶 栽葬遭造藻 源郾
摇 摇 有趣的是袁猿园益下所有的突变都表现为 月孕杂泽 型遥
在 员员 种类型的 月孕杂泽 中有 苑 种在 阅援 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽 的突
变株中也发现了咱员源暂 遥 该温度下的突变热点有 猿 个袁分
别为院员圆缘圆尧员圆愿圆渊郧颐 悦寅粤颐 栽冤 和 员圆愿猿 渊粤颐 栽寅悦颐 郧冤袁
它们发生的概率分别为 源员郾 员豫 渊圆猿 辕 缘远 冤尧 员苑郾 怨豫
渊员园 辕 缘远冤和 员远郾 员豫 渊怨 辕 缘远冤遥 郧颐 悦寅粤颐 栽 型突变在 阅援
早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 中的位点为 员圆缘圆 和 员圆愿圆袁 而在 阅援
则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽 中的位点是 员圆苑猿 和 员猿园猿袁它们也是 阅援
则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽的保守突变热点之一遥 粤颐 栽寅悦颐 郧 型突变
位点员圆愿猿 是 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 的突变热点袁但与其类型
对应的 员猿园源 却并非 阅援 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽 的热点遥 同时袁我
们在 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽的突变株中还发现了 员员愿远 渊粤颐 栽
寅悦颐 郧冤尧 员圆圆缘 渊郧颐 悦寅粤颐 栽冤尧 员圆源猿渊郧颐 悦寅栽颐 粤冤 和
员圆苑员渊郧颐 悦寅粤颐 栽冤源 个突变位点袁但在 阅援 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽
中却找不到它们的对应位点遥
在 缘园益条件下挑取了 缘源 个突变株袁其突变结果
见表 源遥 经分析总共有 员苑 种类型的 月孕杂泽 突变遥 突变
热点有 源 个袁分别为 员圆缘圆尧 员圆愿圆尧 员猿园远 和 员猿员缘袁相应突
变类型出现的概率分别为 圆园郾 员豫 渊员员 辕 缘源冤尧 员愿郾 缘豫
渊员园 辕 缘源冤尧员远郾 苑豫 渊怨 辕 缘源冤和 员源郾 愿豫 渊愿 辕 缘源冤遥 郧颐 悦寅粤
颐 栽型突变的位点在该菌中为员圆缘圆 和 员圆愿圆袁其对应突
园园怨
摇 缘 期 中度嗜热菌 阅藻蚤灶燥糟燥糟糟怎泽 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽的自发突变特征
变在 阅援 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽中的位点分别为 员圆苑猿 和 员猿园猿袁它
们也是 阅援 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽 的碱基替换热点遥 郧颐 悦寅粤颐 栽
型突变位点员猿园远 和 员猿员缘 是 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 的突变热
点袁但与其类型对应的 员猿圆苑 和 员猿猿远 却并非 阅援
则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽的突变热点遥 同时袁在该温度下的 阅援
早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 突变株中还发现了 源远源 渊粤 颐 栽寅栽 颐 粤冤尧
员圆苑员渊粤颐 栽寅悦颐 郧冤尧员猿猿远渊郧颐 悦寅粤颐 栽冤尧员猿缘源渊郧颐 悦寅粤颐
栽冤尧员猿圆圆渊郧颐 悦寅粤颐 栽冤尧员源源愿渊郧颐 悦寅栽颐 粤冤尧员源源圆渊粤颐 栽
寅郧颐 悦冤和 员猿猿远渊郧颐 悦寅悦颐 郧冤等 愿 个突变位点袁但在
阅援 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽中却找不到它们的对应位点遥
表 源摇 缘园益下 砸蚤枣则 诱导的 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽的基因突变情况
栽葬遭造藻 源摇 阅蚤泽贼则蚤遭怎贼蚤燥灶 燥枣 皂怎贼葬贼蚤燥灶泽 造藻葬凿蚤灶早 贼燥 砸蚤枣则 蚤灶 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 葬贼 缘园益
阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 的
突变位点
酝怎贼葬贼蚤燥灶 泽蚤贼藻 燥枣
阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 渊遭责冤
氨基酸变化
葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 糟澡葬灶早藻
碱基对替换
遭葬泽藻鄄责葬蚤则 糟澡葬灶早藻
突变发生次数
皂怎贼葬贼蚤燥灶 灶怎皂遭藻则
阅援 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽的对应位点
糟燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早 泽蚤贼藻 燥枣
阅援 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽 渊遭责冤
员圆猿愿糟 蕴源员猿孕 粤栽寅郧悦 员 员圆缘怨
员源圆员糟 陨源苑源栽 粤栽寅郧悦葬 员 员源源圆
员圆缘圆 阅源员愿晕 郧悦寅粤栽 员员 员圆苑猿
员猿园远糟 郧源猿远砸 郧悦寅粤栽 怨 员猿圆苑
员猿员缘糟 郧源猿怨杂 郧悦寅粤栽葬 愿 员猿猿远
员猿猿猿糟 粤源源缘栽 郧悦寅粤栽葬 员 员猿缘源
员源员源糟 郧源苑圆杂 郧悦寅粤栽 员 员源猿缘
员圆愿圆 匀源圆愿再 郧悦寅粤栽 员园 员猿园猿
员猿园员糟 粤源猿猿灾 郧悦寅粤栽葬 员 员猿圆圆
员猿怨苑糟 孕源远远蕴 郧悦寅粤栽 员 员源员愿
员猿园源糟 蕴源猿缘匝 粤栽寅栽粤 员 员猿圆缘
源源园糟 匝员源苑蕴 粤栽寅栽粤葬 员 源远源
源猿猿 陨员源缘蕴 粤栽寅悦郧 圆 源缘苑
员圆缘园糟 运源员苑栽 粤栽寅悦郧葬 员 员圆苑员
员源圆园糟 陨源苑源蕴 粤栽寅悦郧 员 员源源员
员源圆苑糟 杂源苑远陨 郧悦寅栽粤葬 员 员源源愿
员猿员缘糟 郧源猿怨砸 郧悦寅悦郧葬 员 员猿猿远
未发现 灶燥贼 枣燥怎灶凿 圆
总计 贼燥贼葬造 员苑 缘源
摇 摇 注院葬 与 阅援 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽对应不同的碱基替换曰糟 与表 猿 对应不同的突变位点遥
晕燥贼藻院葬 栽澡燥泽藻 糟燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早 遭葬泽藻泽 葬灶凿 遭葬泽藻 糟澡葬灶早藻泽 憎藻则藻 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 枣则燥皂 阅援 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽 曰糟 栽澡藻 糟燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早 遭葬泽藻泽 葬灶凿 遭葬泽藻 糟澡葬灶早藻 憎藻则藻 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 枣则燥皂
贼澡燥泽藻 蚤灶 栽葬遭造藻 猿郾
摇 摇 在 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 中测得的所有突变形式都是
月孕杂泽渊表 猿 和表 源冤遥 在 缘园益和 猿园益下总共有 圆圆 个不
同的突变位点袁圆 个温度条件下的自发突变模式比较
见图 员遥 其中 郧悦寅粤栽型突变在二者中均占据主要类
型袁这表明无论在 猿园益还是在 缘园益袁郧悦碱基对都是最
易发生自发突变的渊虽然 郧悦寅悦郧 类型的突变仅在
缘园益条件下检测到冤遥 同时袁阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 在 缘园益检
测到的突变位点渊员苑 个冤要多于在 猿园益条件下渊员员
个冤渊表 猿尧表 源冤遥 两种情况下转换发生的概率均为颠
换的 猿 倍多遥 但在 阅援 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽 中二者发生的概率
是相近的咱员缘暂 遥
圆郾 圆摇 不同温度条件下野生株 杂韵阅 和 悦粤栽 酶的活性
分析
为了解 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽的抗氧化酶和自发突变之
间的关系袁分别测定了在 猿园益和 缘园益条件下野生株的
杂韵阅和 悦粤栽酶活性遥 在 缘园益下袁野生株 杂韵阅 和 悦粤栽
蛋白的活性分别为 员园郾 缘源 和 源郾 员愿哉 辕 皂早袁这一数据明
显高于其在 猿园益时的活性渊分别为 苑郾 猿缘 和 圆郾 员苑 哉 辕
皂早袁 责 约 园郾 园缘冤渊图 圆冤遥
圆郾 猿摇 利用 砸栽鄄孕悦砸 检测野生株在不同生长温度下
杂韵阅和 悦粤栽基因的表达
利用 砸栽鄄孕悦砸 测定 杂韵阅 和 悦粤栽 基因在 猿园益和
缘园益下的转录水平渊图 猿冤遥 结果表明袁缘园益下野生株
的 杂韵阅和 悦粤栽的 皂砸晕粤水平大约是 猿园益时的 员郾 缘 倍
多遥 表明随着细胞培养温度的降低袁抗氧化酶的表达
水平也下降遥 这可能影响了 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 细胞对氧
化损伤的抗性以及其自发突变情况遥
员园怨
核摇 农摇 学摇 报 圆缘 卷
图 员摇 则责燥月基因在 猿园益和 缘园益下不同
碱基对发生替换突变的概率比较
云蚤早援 员摇 悦燥皂责葬则蚤泽蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 责藻则糟藻灶贼葬早藻 燥枣 增葬则蚤燥怎泽
遭葬泽藻鄄责葬蚤则 泽怎遭泽贼蚤贼怎贼蚤燥灶泽 蚤灶 则责燥月 葬贼 猿园益 葬灶凿 缘园益
图 圆摇 阅援 早藻燥贼藻则皂葬造蚤泽在 猿园益和
缘园益下 杂韵阅和 悦粤栽的活性
云蚤早援 圆摇 杂韵阅 葬灶凿 悦粤栽 葬糟贼蚤增蚤贼蚤藻泽 燥枣
阅援 早藻燥贼藻则皂葬造蚤泽 糟怎造贼怎则藻凿 葬贼 猿园益 燥则 缘园益
猿摇 讨论
本文 利 用 则责燥月 突 变 分 析 系 统 测 定 了 阅援
早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽援的自发突变模式遥 结果显示袁野生株在
猿园益培养下测定的自发突变率是 缘园益时的 圆郾 远 倍渊表
圆冤袁表明培养温度影响了该菌的自发突变率遥 在 猿园益
渊该温度对嗜热菌会造成压力冤时 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽的抗
突变能力可能比 缘园益时低遥 圆 个温度条件下共测得了
圆圆 个不同的突变位点 渊表 猿尧 表 源 冤袁 说明 阅援
早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽援对环境温度可能有一个特殊的适应系统遥
相对于其最适生长温度袁阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 在低温条件
图 猿摇 阅援 早藻燥贼藻则皂葬造蚤泽在 猿园益和 缘园益
培养后 杂韵阅和 悦粤栽的转录水平
云蚤早援 猿摇 栽澡藻 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 造藻增藻造泽 燥枣 杂韵阅 葬灶凿 悦粤栽
蚤灶 阅援 早藻燥贼藻则皂葬造蚤泽 糟怎造贼怎则藻凿 葬贼 猿园益 燥则 缘园益
下的抗电离辐射能力同样也降低了咱源暂 遥 该菌对环境
压力的抗性下降可能是因为参与其抗性和修复途径的
蛋白与酶的活性下降了遥 我们的结果也证实 猿园益下
杂韵阅和 悦粤栽酶的活性和表达水平比 缘园益时要低渊图
猿冤遥 因此袁阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽中的 杂韵阅 和 悦粤栽 酶可能是
耐热型的遥 在低温条件下它们的构象可能发生了改
变袁因而不利于催化反应咱圆员袁圆圆暂 遥 此外袁栽葬则葬泽泽燥增葬 等研
究发现袁在 孕泽藻怎凿燥皂燥灶葬泽 责怎贼蚤凿葬 中 悦粤栽 和 杂韵阅 酶的活
性可以有利于阻止突变发生咱员苑暂 遥 在 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽
中还存在另外一些耐热型蛋白袁例如耐热型的 阅晕粤结
合蛋白咱圆猿暂 遥 这些蛋白在保护细胞和损伤修复方面都
扮演了重要角色遥 因此袁猿园益时耐热型酶和蛋白的活
性降低可能导致了其突变率的升高遥
在不同的生物体中其突变模式也是不一样的遥 不
同生物间的突变分析和比较有助于更深入了解一些特
殊生物在自然条件下突变的发生和修复情况遥 阅援
早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 的突变模式明显不同于中温菌 阅援
则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽遥 在 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 中检测到的自发突变
类型均为 月孕杂泽渊表 猿尧表 源冤袁而在 阅援 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽 中除
了 月孕杂泽型突变外还存在删除突变咱员源暂 遥 运蚤皂 等在 阅援
则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽的 则责燥月 基因上发现了 员 段 苑遭责 重复序列
的删除突变袁但在 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 的同一位点却未发
生这样的突变遥 在 圆 种菌的 则责燥月 基因上都存在着
月孕杂突变热点袁但是二者的突变热点不同遥 另外袁在
阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽中转换发生的概率是颠换发生概率的
源 倍多袁而在 阅援 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽中这 圆 种形式的突变发生
概率是一样的咱员远暂 遥 我们还不清楚为什么这 圆 个物种
的突变模式会如此不同袁但是通过基因组比较袁阅援
则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽 中一些和辐射诱导有关的基因在 阅援
圆园怨
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
圆园员员袁圆缘渊缘冤院园愿怨愿 耀 园怨园猿
早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽中并未找到同源物咱源暂 遥 关于极端微生物
细胞抗性机制和自发突变之间的关系还有待更进一步
的研究遥
源摇 结论
本文通过对 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽突变谱的研究更深入
的了解了环境压力渊温度和辐照冤和细胞抗性之间的
关系遥 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽在其非最佳生长温度 猿园益下突
变率的升高和突变谱的变化与其体内抗氧化酶类
渊杂韵阅和 悦粤栽等冤的表达量及活性之间存在很大的关
系遥 在 猿园益培养的细菌发生了更多的碱基对替换
渊遭葬泽藻鄄责葬蚤则 泽怎遭泽贼蚤贼怎贼蚤燥灶泽袁月孕杂泽冤遥 而且袁猿园益 培养时该
菌的 杂韵阅和 悦粤栽酶的活性和基因表达水平也比 缘园益
要低遥 表明当 阅援 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 在 猿园益 培养时其突变
率升高的同时会伴随着抗氧化酶的活性的下降遥 该研
究为进一步探索细胞在环境压力下的机制提供了一定
基础遥
参考文献院
咱 员 暂 摇 云藻则则藻蚤则葬 粤 悦袁 晕燥遭则藻 酝 云袁 砸葬蚤灶藻赠 云 粤袁 杂蚤造增葬 酝 栽袁 宰葬蚤贼 砸袁
月怎则早澡葬则凿贼 允袁 悦澡怎灶早 粤 孕袁阅葬 悦燥泽贼葬 酝 杂援 阅藻蚤灶燥糟燥糟糟怎泽 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽
泽责援 灶燥增援 葬灶凿 阅藻蚤灶燥糟燥糟糟怎泽 皂怎则则葬赠蚤 泽责援 灶燥增援 栽憎燥 耘曾贼则藻皂藻造赠
砸葬凿蚤葬贼蚤燥灶鄄砸藻泽蚤泽贼葬灶贼 葬灶凿 杂造蚤早澡贼造赠 栽澡藻则皂燥责澡蚤造蚤糟 杂责藻糟蚤藻泽 枣则燥皂 匀燥贼
杂责则蚤灶早泽 咱允暂 援 陨灶贼 允 杂赠泽贼 月葬糟贼藻则蚤燥造员怨怨苑袁 源苑院 怨猿怨 原 怨源苑
咱 圆 暂 摇 粤早灶藻憎 杂 云袁 悦燥则遭蚤灶 砸 粤援 粤灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 杂载 云葬则皂 蕴藻葬噪 匀蚤泽贼燥则蚤藻泽鄄
匀蚤泽贼燥则蚤糟葬造 蕴藻葬噪 酝燥凿藻造 渊 匀蕴酝 冤 咱 允 暂 援 蕴燥泽 粤造葬皂燥泽 晕葬贼蚤燥灶葬造
蕴葬遭燥则葬贼燥则赠袁 蕴燥泽 粤造葬皂燥泽袁 晕酝袁员怨怨愿袁 匀晕云 原 猿圆猿猿
咱 猿 暂 摇 月则蚤皂 匀袁 灾藻灶噪葬贼藻泽憎葬则葬灶 粤袁 运燥泽贼葬灶凿葬则蚤贼澡藻泽 匀 酝袁 云则藻凿则蚤糟噪泽燥灶 允 运袁
阅葬造赠 酝 允援 耘灶早蚤灶藻藻则蚤灶早 阅藻蚤灶燥糟燥糟糟怎泽 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽 枣燥则 遭蚤燥则藻皂藻凿蚤葬贼蚤燥灶 燥枣
澡蚤早澡鄄贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 则葬凿蚤燥葬糟贼蚤增藻 憎葬泽贼藻 藻灶增蚤则燥灶皂藻灶贼泽 咱 允暂 援 粤责责造 耘灶增蚤则燥灶
酝蚤糟则燥遭蚤燥造袁 圆园园猿袁远怨院 源缘苑缘 原 源缘愿圆
咱 源 暂 摇 酝葬噪葬则燥增葬 运 杂袁 韵皂藻造糟澡藻灶噪燥 酝 灾袁 郧葬蚤凿葬皂葬噪燥增葬 耘 运援 阅藻蚤灶燥糟燥糟糟怎泽
早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽院 贼澡藻 责燥燥造 燥枣 藻曾贼则藻皂藻 则葬凿蚤葬贼蚤燥灶 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 早藻灶藻泽 泽澡则蚤灶噪泽
咱允暂 援 孕蕴燥杂 韵晕耘袁 圆园园苑袁 圆院 怨缘缘
咱 缘 暂 摇 郧葬则蚤遭赠葬灶 蕴袁 匀怎葬灶早 栽袁 运蚤皂 酝袁 宰燥造枣枣 耘袁 晕早怎赠藻灶 粤袁 晕早怎赠藻灶 栽袁
阅蚤藻责 粤袁 匀怎 运袁 陨增藻则泽燥灶 粤袁 再葬灶早 匀袁 酝蚤造造藻则 允 匀援 哉泽藻 燥枣 贼澡藻 则责燥月
早藻灶藻 贼燥 凿藻贼藻则皂蚤灶藻 贼澡藻 泽责藻糟蚤枣蚤糟蚤贼赠 燥枣 遭葬泽藻 泽怎遭泽贼蚤贼怎贼蚤燥灶 皂怎贼葬贼蚤燥灶泽 燥灶 贼澡藻
耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 糟澡则燥皂燥泽燥皂藻 咱允暂 援 阅晕粤 砸藻责葬蚤则袁圆园园猿袁 圆院 缘怨猿 原 远园愿
咱 远 暂 摇 粤灶贼澡燥灶赠 砸 酝袁 杂糟澡怎蚤贼藻皂葬 粤 砸袁 月藻则早增葬造 陨 蕴袁 月则燥憎灶 栽 允袁 韵泽噪葬皂 蕴袁
运造葬贼泽藻则 孕 砸援 粤糟择怎蚤泽蚤贼蚤燥灶 燥枣 则蚤枣葬遭怎贼蚤灶 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 遭赠 葬 则蚤枣葬皂责蚤糟蚤灶
则藻泽蚤泽贼葬灶贼 皂怎贼葬灶贼 燥枣 酝赠糟燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂 贼怎遭藻则糟怎造燥泽蚤泽 蚤灶增燥造增藻泽 葬灶 怎灶怎泽怎葬造
泽责藻糟贼则怎皂 燥枣 皂怎贼葬贼蚤燥灶泽 葬灶凿 藻造藻增葬贼藻凿 枣则藻择怎藻灶糟赠 咱 允 暂 援 粤灶灶 悦造蚤灶
酝蚤糟则燥遭蚤燥造 粤灶贼蚤皂蚤糟则燥遭袁 圆园园缘袁 源院 怨
咱 苑 暂 摇 阅葬增蚤凿泽藻灶 栽袁 月躁燥则葬泽 酝袁 杂藻藻遭藻则早 耘 悦袁 栽燥灶躁怎皂 栽援 粤灶贼蚤皂怎贼葬贼燥则 则燥造藻 燥枣
阅晕粤 早造赠糟燥泽赠造葬泽藻 酝怎贼再 蚤灶 责葬贼澡燥早藻灶蚤糟 晕藻蚤泽泽藻则蚤葬 泽责藻糟蚤藻泽 咱 允 暂 援 允
月葬糟贼藻则蚤燥造袁 圆园园缘袁 员愿苑院 圆愿园员 原 圆愿园怨
咱 愿 暂 摇 酝葬怎早澡葬 匀袁 郧葬造藻葬灶燥 月袁 晕蚤糟澡燥造泽燥灶 宰 蕴援 晕燥增藻造 则责燥月 皂怎贼葬贼蚤燥灶泽
糟燥灶枣藻则则蚤灶早 则蚤枣葬皂责蚤灶 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 燥灶 月葬糟蚤造造怎泽 泽怎遭贼蚤造蚤泽院 早造燥遭葬造 藻枣枣藻糟贼泽 燥灶
早则燥憎贼澡袁 糟燥皂责藻贼藻灶糟藻袁 泽责燥则怎造葬贼蚤燥灶袁 葬灶凿 早藻则皂蚤灶葬贼蚤燥灶 咱允暂 援 允 月葬糟贼藻则蚤燥造袁
圆园园源袁 员愿远院 圆源愿员 原 圆源愿远
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阅晕粤 葬糟择怎蚤泽蚤贼蚤燥灶 遭赠 灶葬贼怎则葬造 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 蚤灶 孕泽藻怎凿燥皂燥灶葬泽 泽贼怎贼扎藻则蚤
咱允暂 援 允 月葬糟贼藻则蚤燥造袁 圆园园缘袁 员愿苑院 员源猿 原 员缘源
咱员园暂摇 酝蚤造造藻则 允 匀袁 云怎灶糟澡葬蚤灶 孕袁 悦造藻灶凿藻灶蚤灶 宰袁 匀怎葬灶早 栽袁 晕早怎赠藻灶 粤袁 宰燥造枣枣
耘袁 再藻怎灶早 粤袁 悦澡蚤葬灶早 允 匀袁 郧葬则蚤遭赠葬灶 蕴袁 杂造怎责泽噪葬 酝 酝袁再葬灶早 匀援
耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 泽贼则葬蚤灶泽 渊灶凿噪冤 造葬糟噪蚤灶早 灶怎糟造藻燥泽蚤凿藻 凿蚤责澡燥泽责澡葬贼藻 噪蚤灶葬泽藻
葬则藻 责燥憎藻则枣怎造 皂怎贼葬贼燥则泽 枣燥则 遭葬泽藻 泽怎遭泽贼蚤贼怎贼蚤燥灶泽 葬灶凿 枣则葬皂藻泽澡蚤枣贼泽 蚤灶
皂蚤泽皂葬贼糟澡鄄则藻责葬蚤则鄄凿藻枣蚤糟蚤藻灶贼 泽贼则葬蚤灶泽 咱允暂 援 郧藻灶藻贼蚤糟泽袁 圆园园圆袁 员远圆院 缘 原 员猿
咱员员暂 摇 酝燥则造燥糟噪 郧 孕袁 孕造蚤噪葬赠贼蚤泽 月 月袁 悦则葬憎枣燥则凿 允 栽援 悦澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣
泽责燥灶贼葬灶藻燥怎泽袁 陨灶 增蚤贼则燥鄄泽藻造藻糟贼藻凿袁 则蚤枣葬皂责蚤灶鄄则藻泽蚤泽贼葬灶贼 皂怎贼葬灶贼泽 燥枣
酝赠糟燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂 贼怎遭藻则糟怎造燥泽蚤泽 泽贼则葬蚤灶 匀猿苑砸增 咱 允暂 援 粤灶贼蚤皂蚤糟则燥遭 粤早藻灶贼泽
悦澡藻皂燥贼澡藻则袁 圆园园园袁 源源院 猿圆怨愿 原 猿猿园员
咱员圆暂摇 宰葬灶早 郧袁 宰蚤造泽燥灶 栽 允 酝袁 允蚤葬灶早 匝袁 栽葬赠造燥则 阅 耘援 杂责燥灶贼葬灶藻燥怎泽
皂怎贼葬贼蚤燥灶泽 贼澡葬贼 糟燥灶枣藻则 葬灶贼蚤遭蚤燥贼蚤糟 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 蚤灶 匀藻造蚤糟燥遭葬糟贼藻则 责赠造燥则蚤援
咱允暂 援 粤灶贼蚤皂蚤糟则燥遭 粤早藻灶贼泽 悦澡藻皂燥贼澡藻则袁 圆园园员袁 源缘院 苑圆苑 原 苑猿猿
咱员猿暂摇 晕蚤糟澡燥造泽燥灶 宰 蕴袁 酝葬怎早澡葬灶 匀援 栽澡藻 杂责藻糟贼则怎皂 燥枣 杂责燥灶贼葬灶藻燥怎泽 砸蚤枣葬皂责蚤灶
砸藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 酝怎贼葬贼蚤燥灶泽 蚤灶 贼澡藻 则责燥月 郧藻灶藻 燥枣 月葬糟蚤造造怎泽 泽怎遭贼蚤造蚤泽 员远愿 杂责燥则藻泽
阅蚤枣枣藻则泽 枣则燥皂 栽澡葬贼 燥枣 灾藻早藻贼葬贼蚤增藻 悦藻造造泽 葬灶凿 砸藻泽藻皂遭造藻泽 栽澡葬贼 燥枣
酝赠糟燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂 贼怎遭藻则糟怎造燥泽蚤泽 咱 允暂 援 允 月葬糟贼藻则蚤燥造袁 圆园园圆袁 员愿源院 源怨猿远 原
源怨源园
咱员源暂摇 运蚤皂 酝袁 宰燥造枣枣 耘袁 匀怎葬灶早 栽袁 郧葬则蚤遭赠葬灶 蕴袁 耘葬则造 粤 酝袁 月葬贼贼蚤泽贼葬 允 砸袁
酝蚤造造藻则 允 匀援 阅藻增藻造燥责蚤灶早 葬 早藻灶藻贼蚤糟 泽赠泽贼藻皂 蚤灶 阅藻蚤灶燥糟燥糟糟怎泽 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽
枣燥则 葬灶葬造赠扎蚤灶早 皂怎贼葬贼蚤燥灶泽 咱允暂 援 郧藻灶藻贼蚤糟泽袁 圆园园源袁 员远远院 远远员 原 远远愿
咱员缘暂 摇 匀怎葬 载袁 匀怎葬灶早 蕴袁 栽蚤葬灶 月袁 匀怎葬 再援 陨灶增燥造增藻皂藻灶贼 燥枣 则藻糟匝 蚤灶 贼澡藻
怎造贼则葬增蚤燥造藻贼 凿葬皂葬早藻 则藻责葬蚤则 责葬贼澡憎葬赠 蚤灶 阅藻蚤灶燥糟燥糟糟怎泽 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽 咱 允暂 援
酝怎贼葬贼 砸藻泽袁圆园园愿袁 远源员院 源愿 原 缘猿
咱员远暂摇 载蚤葬燥贼蚤灶早 匀怎葬袁 悦澡葬燥 宰葬灶早袁 蕴蚤枣藻灶 匀怎葬灶早袁 酝蚤灶早枣藻灶早 蕴蚤袁 再怎葬灶
宰葬灶早袁 杂澡蚤造蚤 宰藻灶早袁 再怎 悦澡藻灶袁 再葬灶扎澡藻灶早 栽燥灶早袁 月蚤灶早 栽蚤葬灶袁 葬灶凿
再怎藻躁蚤灶 匀怎葬 栽澡藻 皂怎贼葬贼蚤燥灶 则葬贼藻 葬灶凿 泽责藻糟贼则怎皂 燥枣 泽责燥灶贼葬灶藻燥怎泽 皂怎贼葬贼蚤燥灶泽
蚤灶 阅藻蚤灶燥糟燥糟糟怎泽 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽 怎灶凿藻则 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 则蚤枣葬皂责蚤灶 泽贼则藻泽泽 允燥怎则灶葬造 燥枣
晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽 咱允暂 援 圆园员园袁 葬糟糟藻责贼藻凿
咱员苑暂摇 栽葬则葬泽泽燥增葬 运袁 栽藻早燥增葬 砸袁 栽燥增藻则 粤袁 栽藻则葬泽 砸袁 栽葬则噪 酝袁 杂葬怎皂葬葬 杂袁
运蚤增蚤泽葬葬则 酝援 耘造藻增葬贼藻凿 酝怎贼葬贼蚤燥灶 云则藻择怎藻灶糟赠 蚤灶 杂怎则增蚤增蚤灶早 孕燥责怎造葬贼蚤燥灶泽 燥枣
悦葬则遭燥灶鄄杂贼葬则增藻凿 则责燥杂鄄阅藻枣蚤糟蚤藻灶贼 孕泽藻怎凿燥皂燥灶葬泽 责怎贼蚤凿葬 陨泽 悦葬怎泽藻凿 遭赠
砸藻凿怎糟藻凿 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 杂怎责藻则燥曾蚤凿藻 阅蚤泽皂怎贼葬泽藻 葬灶凿 悦葬贼葬造葬泽藻 咱 允暂 援 允
月葬糟贼藻则蚤燥造袁 圆园园怨袁 员怨员院 猿远园源 原 猿远员源
咱员愿暂摇 酝葬则噪蚤造造蚤藻 蕴 酝袁 灾葬则灶怎皂 杂 酝袁 匀则葬凿藻糟噪赠 孕袁 宰燥灶早 运 运援 栽葬则早藻贼藻凿
皂怎贼葬早藻灶藻泽蚤泽 遭赠 凿怎责造蚤糟葬贼蚤燥灶 蚤灶泽藻则贼蚤燥灶 蚤灶 贼澡藻 则葬凿蚤燥则藻泽蚤泽贼葬灶贼 遭葬糟贼藻则蚤怎皂
阅藻蚤灶燥糟燥糟糟怎泽 则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽院 则葬凿蚤葬贼蚤燥灶 泽藻灶泽蚤贼蚤增蚤贼蚤藻泽 燥枣 糟葬贼葬造葬泽藻 渊 噪葬贼粤冤
葬灶凿 泽怎责藻则燥曾蚤凿藻 凿蚤泽皂怎贼葬泽藻 渊泽燥凿粤冤 皂怎贼葬灶贼泽 咱允暂 援 允 月葬糟贼藻则蚤燥造袁 员怨怨怨袁
员愿员院 远远远 原 远远怨
咱员怨暂摇 阅则葬噪藻 允 宰援 粤 糟燥灶泽贼葬灶贼 则葬贼藻 燥枣 泽责燥灶贼葬灶藻燥怎泽 皂怎贼葬贼蚤燥灶 蚤灶 阅晕粤鄄遭葬泽藻凿
皂蚤糟则燥遭藻泽 咱允暂 援 孕则燥糟 晕葬贼造 粤糟葬凿 杂糟蚤 哉杂粤袁 员怨怨员袁 愿愿院 苑员远园 原 苑员远源
咱圆园暂 摇 悦澡藻灶 匀袁 载怎 郧袁 在澡葬燥 再袁 栽蚤葬灶 月袁 蕴怎 匀袁 再怎 载袁 载怎 在袁 再蚤灶早 晕袁 匀怎
杂袁 匀怎葬 再援 粤 晕燥增藻造 韵曾赠砸 杂藻灶泽燥则 葬灶凿 砸藻早怎造葬贼燥则 燥枣 匀赠凿则燥早藻灶
孕藻则燥曾蚤凿藻 杂贼则藻泽泽 憎蚤贼澡 韵灶藻 悦赠泽贼藻蚤灶藻 砸藻泽蚤凿怎藻 蚤灶 阅藻蚤灶燥糟燥糟糟怎泽
则葬凿蚤燥凿怎则葬灶泽 咱允暂 援 孕蕴燥杂 韵晕耘袁圆园园愿袁 猿院 员远园圆
咱圆员暂 摇 云蚤藻造凿泽 孕 粤援 砸藻增蚤藻憎院 孕则燥贼藻蚤灶 枣怎灶糟贼蚤燥灶 葬贼 贼澡藻则皂葬造 藻曾贼则藻皂藻泽院 遭葬造葬灶糟蚤灶早
泽贼葬遭蚤造蚤贼赠 葬灶凿 枣造藻曾蚤遭蚤造蚤贼赠 咱 允 暂 援 悦燥皂责葬则葬贼蚤增藻 月蚤燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠 葬灶凿
孕澡赠泽蚤燥造燥早赠鄄孕葬则贼 粤院 酝燥造藻糟怎造葬则 驭 陨灶贼藻早则葬贼蚤增藻 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁圆园园员袁 员圆怨袁
源员苑 原 源猿员
咱圆圆暂摇 灾蚤藻蚤造造藻 悦袁 在藻蚤噪怎泽 郧允援 匀赠责藻则贼澡藻则皂燥责澡蚤造蚤糟 耘灶扎赠皂藻泽院 杂燥怎则糟藻泽袁 哉泽藻泽袁
葬灶凿 酝燥造藻糟怎造葬则 酝藻糟澡葬灶蚤泽皂泽 枣燥则 栽澡藻则皂燥泽贼葬遭蚤造蚤贼赠 咱允暂 援 酝蚤糟则燥遭蚤燥造援 酝燥造援
月蚤燥造援 砸藻增援 圆园园员袁远缘院 员 原 源猿
咱圆猿暂 摇 云蚤造蚤责噪燥憎泽噪蚤 孕袁 阅怎则葬躁鄄栽澡葬贼贼藻 粤袁 运怎则 允援 晕燥增藻造 贼澡藻则皂燥泽贼葬遭造藻 泽蚤灶早造藻鄄
泽贼则葬灶凿藻凿 阅晕粤鄄遭蚤灶凿蚤灶早 责则燥贼藻蚤灶 渊杂杂月冤 枣则燥皂 阅藻蚤灶燥糟燥糟糟怎泽 早藻燥贼澡藻则皂葬造蚤泽
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猿园怨