全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员源袁圆愿渊猿冤院园源缘怨 耀 园源远远允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员猿鄄园源鄄园圆摇 接受日期院圆园员猿鄄园苑鄄员园
基金项目院海洋公益性行业科研专项渊圆园员猿园缘园员猿冤袁宁波市重大农业科研攻关项目渊圆园员圆悦员园园园员冤袁宁波大学大学生科研创新计划项目渊圆园员圆冤
作者简介院茅宇虹袁女袁主要从事水产品高值化利用研究遥 耘鄄皂葬蚤造院 赠怎澡燥灶早皂葬燥员园圆缘岳 早皂葬蚤造援 糟燥皂
通讯作者院杨文鸽袁女袁教授袁主要从事水产品加工保鲜与高值化利用研究遥 耘鄄皂葬蚤造院 赠葬灶早憎藻灶早藻岳 灶遭怎援 藻凿怎援 糟灶
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员源冤园猿鄄园源缘怨鄄园愿
鱿鱼皮胶原蛋白的提取条件优化及其特性分析
茅宇虹摇 刘俊豪摇 杨文鸽摇 徐大伦摇 张进杰
渊宁波大学海洋学院袁浙江袁宁波摇 猿员缘圆员员冤
摘摇 要院本研究旨在优化秘鲁鱿鱼皮胶原蛋白的提取方法袁并表征其主要特性袁为鱿鱼皮的高值化利用尧
胶原蛋白的制备提供基础遥 采用醋酸结合胃蛋白酶法提取秘鲁鱿鱼皮中胶原蛋白袁通过单因素及响应
面分析法优化提取条件袁结果表明院胃蛋白酶添加量 圆豫 渊憎 辕 憎冤尧提取时间 缘猿 澡尧醋酸浓度 园郾 苑园 皂燥造窑蕴 原员尧
固液比 员颐 圆源园渊憎 辕 增冤袁胶原蛋白提取率可达 缘员郾 源苑豫 袁并通过盐析及超滤对胶原蛋白进行纯化遥 杂阅杂鄄
孕粤郧耘结果显示鱿鱼皮胶原蛋白主要由 琢员袁 琢圆 及 茁 链组成袁为 陨 型胶原蛋白曰氨基酸组成分析表明其
甘氨酸含量最高渊圆愿员 残基 辕 员园园园 残基冤袁亚氨酸含量为 员远苑 残基 辕 员园园园 残基遥
关键词院胶原蛋白曰秘鲁鱿鱼曰响应面曰杂阅杂鄄孕粤郧耘曰氨基酸分析
阅韵陨院员园援 员员愿远怨 辕 躁援 蚤泽泽灶援 员园园鄄愿缘缘员郾 圆园员源郾 园猿援 园源缘怨
摇 摇 秘鲁鱿鱼渊阅燥泽蚤凿蚤糟怎泽 早蚤早葬泽冤产量丰富袁体型较大袁
在加工为鱿鱼干尧鱿鱼丝及冻品等处理过程中约有
猿缘豫的鱿鱼头尧足尧内脏及表皮等下脚料产生袁其中鱿
鱼皮占 愿豫 耀员猿豫左右袁这些下脚料是获得酶制品尧胶
原及其他重要生物产品的很好来源遥
胶原渊糟燥造造葬早藻灶冤又称胶原蛋白袁是一类由 猿 条多肽
链相互缠绕形成螺旋结构袁并富含羟脯氨酸渊脯氨酸冤
的糖蛋白袁是动物体内分布最广尧含量最多的蛋白质遥
目前已确认 圆远 种不同遗传类型的胶原分子咱员暂 袁各型胶
原广泛分布于机体的所有组织中袁但各型胶原的分布
及含量比值因组织不同而有很大差异咱圆暂 遥 动物皮肤
中的胶原主要为玉型和芋型胶原袁其含量对组织的硬
度尧拉伸性尧弹性等具有重要影响遥 因此袁有目的地选
择富含所需胶原分子类型的组织袁对于获取足够量及
高纯度的胶原制品相当重要遥
传统上袁胶原蛋白主要从陆生动物如猪尧牛的皮骨
中提取袁但随着疯牛病尧口蹄疫等牲畜疾病的爆发袁使
人们对牲畜来源的胶原蛋白制品的安全性存在一定疑
虑咱猿暂 遥 鱿鱼皮为水产品加工副产物袁其蛋白质含量较
高袁其中胶原蛋白占蛋白质总量的 苑园豫左右遥 因此从
鱿鱼皮中提取胶原蛋白不仅能够充分利用资源袁提高
其加工附加值袁遂可减少环境污染遥 本研究旨在优化
鱿鱼皮胶原蛋白的提取条件袁并表征其主要特性袁为秘
鲁鱿鱼皮的高值化利用尧胶原蛋白的制备提供基础遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 材料与试剂
秘鲁鱿鱼皮来自宁波某鱿鱼加工企业遥 除垢清洗
后剪成小片状袁冷冻干燥后粉碎 渊水分含量为
愿郾 远苑豫 冤袁储存于 原猿远益冰箱渊储存期在 圆 个月内冤袁用
于胶原蛋白提取遥
胃蛋白酶渊猪源袁员 颐 员缘园园园曰阿拉丁冤袁玉型胶原蛋
白标准品尧蛋白分子量标准品尧茁 原巯基乙醇尧丙烯酰
胺尧甲叉双丙烯酰胺尧过硫酸铵尧栽耘酝耘阅 等来自美国
杂蚤早皂葬公司遥 氢氧化钠尧醋酸尧氯胺 栽尧氯化钠尧正丁醇尧
对二甲氨基苯甲醛尧栽则蚤泽等均为国产分析纯遥
员郾 圆摇 主要仪器
云阅 原愿园 真空冷冻干燥机袁北京博医康公司曰酝蕴 原
员园源 型电子天平袁瑞士梅特勒 原托利多公司曰杂韵砸晕粤蕴蕴
月蚤燥枣怎早藻 台式高速冷冻离心机袁德国 栽澡藻则皂燥 泽糟蚤藻灶贼蚤枣蚤糟 公
司曰源愿园圆 原 哉灾 辕 灾陨杂 型紫外分光光度计袁中国尤尼柯仪
器有限公司曰愿猿缘 原 缘园 氨基酸自动分析仪袁日本日立公
司曰蕴葬遭泽糟葬造藻 小型切向流超滤系统袁美国密理博公司曰
怨缘源
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
阅阅杂 原员员悦电导率仪袁上海精科仪器公司曰耘孕杂 猿园员 电
泳仪袁美国 粤皂藻则泽澡葬皂 月蚤燥泽糟蚤藻灶糟藻公司遥
员郾 猿摇 方法
员郾 猿郾 员摇 胶原蛋白提取摇 前处理院取冻干后的鱿鱼皮粉
末袁加 园郾 员皂燥造窑蕴 原员氢氧化钠溶液渊员颐 员缘园曰憎 辕 增冤浸泡处
理 远澡袁蒸馏水清洗至中性袁加 员园豫正丁醇溶液渊员颐 圆园园曰
憎 辕 增冤浸泡处理 圆源澡遥 以上操作均于 源益下完成遥
单因素试验院选取提取时间尧固液比尧醋酸浓度尧胃
蛋白酶添加量四个因素袁分析各因素对鱿鱼皮胶原蛋
白提取率影响遥 提取液离心渊员园园园园 则窑皂蚤灶 原员袁源益袁圆园
皂蚤灶冤袁取上清液袁测定胶原蛋白含量 渊按照 郧月 辕 栽
怨远怨缘郾 圆猿 原 圆园园愿 测定羟脯氨酸含量后袁乘以系数
员源郾 员咱源暂换算为胶原蛋白含量冤遥 提取率 越 皂 辕 酝 ×员园园豫
渊皂为提取液中胶原蛋白的质量 辕 皂早曰酝 为冻干后的鱿
鱼皮质量 辕 皂早冤遥
响应面优化提取条件院根据单因素试验结果袁以
月燥曾鄄月藻灶澡灶噪藻灶中心组合试验设计原理袁优化鱿鱼皮胶
原蛋白提取条件遥
员郾 猿郾 圆摇 胶原蛋白的初步纯化摇 盐析法院粗提胶原蛋白
溶液中添加氯化钠固体至最终浓度为 圆郾 远 皂燥造窑蕴 原员袁搅
拌使胶原蛋白以白色絮状沉淀析出袁源益下 员园园园园 则窑
皂蚤灶 原员离心 猿园 皂蚤灶袁弃上清液取沉淀复溶于 园郾 缘
皂燥造窑蕴 原员的醋酸溶液中袁低温搅拌直至完全溶解遥 反复
盐析 猿 次遥
超滤透析法院采用小型切向流超滤系统的透析功
能袁对胶原蛋白进行透析脱盐以及除去小分子杂质遥
选择截留分子量为 员园 运阅 的膜袁透析分两次操作袁分
别采用 猿 倍于胶原蛋白溶液体积的 园郾 员 皂燥造窑蕴 原员的醋
酸溶液与蒸馏水为透析液袁脱盐效果通过电导率衡量遥
回收胶原蛋白液袁冷冻干燥后用于 哉灾尧杂阅杂鄄孕粤郧耘尧氨
基酸组成分析袁并计算得率与纯度遥 得率 越 皂 辕 酝 ×
员园园豫 渊皂为冷冻干燥所得胶原蛋白的质量 辕 皂早曰酝 为
冻干后的鱿鱼皮质量 辕 皂早冤袁纯度通过测定冷冻干燥所
得胶原蛋白中羟脯氨酸含量计算遥
员郾 猿郾 猿摇 胶原蛋白的紫外光谱分析摇 将胶原蛋白溶解
于 园郾 缘 皂燥造窑蕴 原员的醋酸溶液袁配成 圆 皂早窑皂蕴 原员的胶原溶
液袁于 员怨园 耀 源园园 灶皂近紫外光区处进行扫描遥
员郾 猿郾 源摇 胶原蛋白的 杂阅杂鄄孕粤郧耘 分析摇 采用聚丙烯酰
胺垂直版型电泳装置遥 样品处理参考 酝葬贼皂葬则燥澡 等咱缘暂
方法袁采用 员园豫 分离胶袁源豫 浓缩胶袁电泳缓冲液为
杂阅杂鄄栽则蚤泽 原甘氨酸电泳缓冲液遥 电泳电压采用 怨园 灾袁
电流 圆园 皂粤左右袁直至染料前沿距硅橡胶框底边 员 糟皂
左右处时袁停止电泳遥 园郾 圆园豫考马斯亮蓝 砸 原 圆缘园 溶
液染色 员 澡袁脱色液渊圆缘园 皂蕴 甲醇尧苑园 皂蕴 冰醋酸定容
至 员 蕴冤脱色过夜遥 宽谱预染蛋白质标准用于评估样
品蛋白质分子量遥
员郾 猿郾 缘摇 胶原蛋白的氨基酸组成分析摇 胶原蛋白溶于
远 皂燥造窑蕴 原员盐酸袁员猿园益下微波消解 远园 皂蚤灶袁氨基酸自动
分析仪分析氨基酸组成咱远暂 遥
员郾 猿郾 远摇 数据统计分析摇 每次试验设 猿 个平行袁数据采
用 杂粤杂怨郾 员郾 猿 和 韵则蚤早蚤灶苑郾 缘 分析软件进行统计分析以及
绘图遥 采用 阅怎灶糟葬灶法进行多重比较袁孕 约 园郾 园缘 为具有
显著性差异袁以不同的小写字母表示遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 不同因素对胶原蛋白提取率的影响
胶原蛋白具有独特的三螺旋结构袁在较高温度下
易收缩袁各肽链间的链接易断裂袁为充分保证胶原蛋白
结构的完整性袁本实验所有操作均在 源益环境下进行遥
圆郾 员郾 员摇 提取时间对胶原蛋白提取率的影响摇 取一定
质量鱿鱼皮袁加入 园郾 缘 皂燥造窑蕴 原员醋酸溶液及 圆豫胃蛋白
酶渊憎 辕 憎冤袁固液比为 员颐 员缘园渊憎 辕 增冤袁充分匀浆处理后袁分
别浸提不同时间袁结果如图 员 原 粤遥 在 源愿 澡 时袁提取率
达最大值 猿怨郾 苑猿豫 遥 源愿 澡内袁随浸提时间延长袁胶原蛋
白提取率显著增加袁但超过 源愿澡后袁提取率并无显著变
化遥 因此袁选择提取时间为 源愿 澡遥
圆郾 员郾 圆摇 醋酸浓度对胶原蛋白提取率的影响摇 改变醋
酸浓度袁提取时间为 源愿澡袁保持其他条件不变袁提取结
果如图 员 原 月遥 醋酸浓度为 园郾 缘园 皂燥造窑蕴 原员时袁胶原蛋白
提取率达最大值 源园郾 圆猿豫 袁醋酸浓度为 园郾 缘 耀 员郾 圆缘
皂燥造窑蕴 原员时袁提取率无显著变化遥 此结果与 宰葬灶早 等咱苑暂
从草鱼皮中提取胶原蛋白的研究结果存在差异袁其研
究表明当醋酸浓度超过 园郾 缘皂燥造窑蕴 原员后袁胶原蛋白提取
率显著下降遥
圆郾 员郾 猿摇 胃蛋白酶添加量对胶原蛋白提取率的影响摇
在 园郾 缘 皂燥造窑蕴 原员的醋酸中分别添加 园尧员尧圆尧猿尧源尧缘豫的
胃蛋白酶渊憎 辕 憎冤袁固液比为 员颐 员缘园渊憎 辕 增冤袁充分匀浆处
理袁源益下浸提 源愿 澡袁结果如图 员 原 悦遥 胃蛋白酶添加量
为 圆豫时袁胶原蛋白提取率达最大值 源园郾 愿愿豫 袁经比较
发现袁胃蛋白酶添加量在 圆豫 耀 缘豫之间袁提取率并无
显著性差异袁但较未添加胃蛋白酶组袁均有显著性提
高遥
圆郾 员郾 源摇 固液比对胶原蛋白提取率的影响摇 如图 员 原 阅
所示袁固液比为 员 颐 圆园园 时袁胶原蛋白提取率达最大值
源员郾 远愿豫 遥 固液比较小时袁提取率随着固液比增加显著
提高袁但当固液比超过 员 颐 圆园园 后袁提取率变化并不显
著袁超过 员颐 圆缘园 后甚至有较明显的降低袁这可能由于过
园远源
摇 猿 期 鱿鱼皮胶原蛋白的提取条件优化及其特性分析
高的固液比使胃蛋白酶在溶液中过于分散袁从而降低
了其与底物接触的机会袁影响提取率遥
图 员摇 不同因素对秘鲁鱿鱼皮胶原
蛋白提取率的影响
云蚤早援 员摇 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 枣葬糟贼燥则泽 燥灶 贼澡藻 赠蚤藻造凿 燥枣
糟燥造造葬早藻灶 枣则燥皂 阅燥泽蚤凿蚤糟怎泽 早蚤早葬泽 泽噪蚤灶
圆郾 圆摇 响应面法优化胶原蛋白提取工艺
圆郾 圆郾 员摇 分析因素的选取摇 在胶原蛋白的提取中袁胃蛋
白酶主要起到促溶作用袁根据单因素试验结果袁圆豫 耀
缘豫的胃蛋白酶添加量对胶原提取率并无显著影响遥
因此选择胃蛋白酶添加量为 圆豫 袁选取提取时间渊粤冤尧
醋酸浓度渊月冤尧固液比渊悦冤进行响应面试验设计袁以鱿
鱼皮胶原蛋白提取率为响应值渊再冤袁猿 因素 猿 水平响
应面试验设计袁因素及水平设计见表 员袁试验设计及结
果见表 圆遥
表 员摇 响应面法分析因素及水平
栽葬遭造藻 员摇 云葬糟贼燥则泽 葬灶凿 造藻增藻造泽 燥枣 则藻泽责燥灶泽藻 泽怎则枣葬糟藻 皂藻贼澡燥凿
因素 云葬糟贼燥则 水平 蕴藻增藻造原 员 园 员
提取时间 耘曾贼则葬糟贼蚤燥灶 贼蚤皂藻 辕 澡 粤 圆源 源圆 远园
醋酸浓度
粤糟藻贼蚤糟 葬糟蚤凿 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 辕 渊皂燥造窑蕴 原员冤 月 园郾 圆缘 园郾 缘园 园郾 苑缘
固液比 杂燥造蚤凿鄄造蚤择怎蚤凿 则葬贼蚤燥 渊憎 辕 增冤 悦 员颐 员园园 员颐 员苑缘 员颐 圆缘园
圆郾 圆郾 圆摇 响应面试验结果分析 摇 耘曾责藻则贼鄄阅藻泽蚤早灶 愿郾 园郾 远
统计分析软件进行多元回归分析袁建立了提取条件
渊提取时间 粤尧醋酸浓度 月尧固液比 悦冤与胶原蛋白提取
率 再的数学模型院
再 越 源猿郾 远源 垣 员郾 源员粤 垣 圆郾 猿月 垣 猿郾 怨苑悦 原 园郾 缘远粤月 垣
园郾 远苑粤悦 垣 员郾 圆怨月悦 原员郾 圆圆粤圆 原 圆郾 园员月圆 原 猿郾 员缘悦圆
表 圆摇 响应面分析结果
栽葬遭造藻 圆摇 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 燥枣 则藻泽责燥灶泽藻 泽怎则枣葬糟藻 葬灶葬造赠泽蚤泽
试验号
栽藻曾贼 灶怎皂遭藻则
因素 粤
云葬糟贼燥则 粤
因素 月
云葬糟贼燥则 月
因素 悦
云葬糟贼燥则 悦
胶原蛋白提取率
再藻蚤造凿 燥枣 糟燥造造葬早藻灶 辕 豫
圆 园 园 园 源猿郾 苑源
猿 员 园 员 源缘郾 猿怨
源 员 原 员 园 源园郾 苑愿
缘 园 原 员 员 猿愿郾 园怨
远 原 员 园 员 源员郾 愿远
苑 原 员 园 原 员 猿源郾 源怨
愿 园 员 员 源远郾 园缘
怨 园 员 原 员 猿远郾 猿园
员园 原 员 员 园 源员郾 员缘
员员 员 园 原 员 猿缘郾 猿源
员圆 原 员 原 员 园 猿远郾 圆员
员猿 园 原 员 原 员 猿猿郾 源愿
员源 员 员 园 源猿郾 源愿
员缘 园 园 园 源猿郾 圆缘
摇 摇 采用统计学的 云 值尧孕 值与方差分析检验模型方
程多项式各系数的拟合和回归袁结果见表 猿遥
摇 摇 由表猿可知袁整体模型的 孕 约园郾 园员袁表明该方程模型
极显著袁并且失拟项不显著渊孕 跃 园郾 园缘冤袁说明该模型拟
合度好遥 利用 耘曾责藻则贼鄄阅藻泽蚤早灶 愿郾 园郾 远 统计分析软件袁得到
两两自变量为坐标的 猿阅图和等高线图渊如图 圆冤遥 等高
员远源
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
摇 摇 摇 摇 表 猿摇 方差分析表
栽葬遭造藻 猿摇 粤灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 增葬则蚤葬灶糟藻
变异来源
杂燥怎则糟藻
平方和
杂杂
自由度
凿枣
均方
酝藻葬灶 杂择怎葬则藻
云值
云 增葬造怎藻
孕值
孕 增葬造怎藻
显著性
杂早灶蚤枣蚤糟葬灶糟藻
模型 酝燥凿藻造 圆源源郾 怨远 圆苑郾 圆圆 猿怨郾 缘 园郾 园园园源 鄢鄢
粤 原提取时间 辕 澡 员缘郾 怨员 员 员缘郾 怨员 圆猿郾 园怨 园郾 园园源怨 鄢鄢
月 原醋酸浓度 辕 渊皂燥造窑蕴 原员 冤 源圆郾 猿 员 源圆郾 猿 远员郾 猿怨 园郾 园园园缘 鄢鄢
悦 原固液比渊憎 辕 增冤 员圆远郾 圆猿 员 员圆远郾 圆猿 员愿猿郾 圆 约 园郾 园园园员 鄢鄢
粤月 员郾 圆缘 员 员郾 圆缘 员郾 愿圆 园郾 圆猿缘源
粤悦 员郾 苑愿 员 员郾 苑愿 圆郾 缘怨 园郾 员远愿愿
月悦 远郾 远圆 员 远郾 远圆 怨郾 远 园郾 园圆远怨 鄢
粤圆 缘郾 源怨 员 缘郾 源怨 苑郾 怨远 园郾 园猿苑 鄢
月圆 员源郾 怨猿 员 员源郾 怨猿 圆员郾 远远 园郾 园园缘远 鄢鄢
悦圆 猿远郾 缘源 员 猿远郾 缘源 缘猿郾 园猿 园郾 园园园愿 鄢鄢
残差 砸藻泽蚤凿怎葬造 猿郾 源缘 缘 园郾 远怨
失拟项 蕴葬糟噪 燥枣 云蚤贼 猿郾 圆 猿 员郾 园苑 愿郾 苑缘 园郾 员园源猿
误差 耘则则燥则 园郾 圆源 圆 园郾 员圆
总和 栽燥贼葬造 圆源愿郾 源 员源
摇 摇 注院鄢为显著渊孕 约 园郾 园缘冤袁鄢鄢为极显著渊孕 约 园郾 园员冤遥
摇 摇 晕燥贼藻院 鄢 葬灶凿 鄢鄢蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶糟藻 葬贼 园郾 园缘 葬灶凿 园郾 园员 造藻增藻造泽袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援
图 圆摇 提取时间与醋酸浓度对胶原蛋白提取率的影响
云蚤早援 圆摇 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶 贼蚤皂藻 葬灶凿 葬糟藻贼蚤糟 葬糟蚤凿 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥灶 贼澡藻 赠蚤藻造凿 燥枣 糟燥造造葬早藻灶
线图可以直观反映出两变量交互作用的显著性程度袁椭
圆形反映了两因素交互作用较强袁而圆形则相反咱愿暂 遥 从
图 圆尧图 猿尧图 源可见袁提取时间渊粤冤尧醋酸浓度渊月冤尧固液
比渊悦冤猿因素均对胶原蛋白提取率有显著性影响袁其中
因素 月尧悦的交互作用影响显著袁而因素 粤尧月及因素 粤尧
悦之间的交互作用影响相对较弱袁另外响应面优化的最
高点均在 猿个因素的 园 耀员水平之间遥
圆郾 圆郾 猿摇 响应面优化提取工艺的确定摇 结合回归模型
的数学分析袁提取鱿鱼皮胶原蛋白的最佳工艺为院提取
时间 缘猿郾 源愿 澡尧醋酸浓度 园郾 远怨 皂燥造窑蕴 原员尧固液比 员 颐
圆猿怨郾 园员渊憎 辕 增冤袁在此条件下袁鱿鱼皮胶原蛋白的预测提
取率为 源远郾 远缘豫 遥 考虑实际可操作性袁将最优提取条
圆远源
摇 猿 期 鱿鱼皮胶原蛋白的提取条件优化及其特性分析
图 猿摇 提取时间与固液比对胶原蛋白提取率的影响
云蚤早援 猿摇 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶 贼蚤皂藻 葬灶凿院 泽燥造蚤凿 原 造蚤择怎蚤凿 则葬贼蚤燥 燥灶 贼澡藻 赠蚤藻造凿 燥枣 糟燥造造葬早藻灶
图 源摇 醋酸浓度与固液比对胶原蛋白提取率的影响
云蚤早援 源摇 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 葬糟藻贼蚤糟 葬糟蚤凿 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 葬灶凿 泽燥造蚤凿 原 造蚤择怎蚤凿 则葬贼蚤燥 燥灶 贼澡藻 赠蚤藻造凿 燥枣 糟燥造造葬早藻灶
件修正为提取时间 缘猿 澡尧醋酸浓度 园郾 苑 皂燥造窑蕴 原员尧固液
比 员颐 圆源园渊憎 辕 增冤袁测得胶原蛋白提取率为 源苑郾 园怨豫 渊相
对于冻干后的鱿鱼皮冤袁若相对于干物质袁则达到
缘员郾 源苑豫 袁与理论预测值的误差为 园郾 怨源豫 袁说明采用响
应面法优化确定的胶原蛋白提取条件可靠遥
圆郾 猿摇 胶原蛋白的纯化及其组分鉴定
圆郾 猿郾 员摇 胶原蛋白的透析除盐摇 以氯化钠作为胶原蛋
白溶液导电物质代表遥 配置不同浓度氯化钠标准溶
液袁圆缘益恒温条件下袁测定其电导率袁电导率 再 与氯化
钠浓度 载间的线性关系为院
再 越 怨愿郾 苑园源载 垣 源远郾 园圆 渊砸圆 越 园郾 怨怨怨远袁载院滋皂燥造窑蕴 原员袁再院
怎泽 辕 糟皂冤遥
分别测定透析前后胶原蛋白液的电导率袁根据标
准曲线得其对应氯化钠浓度遥 经计算袁透析除盐率高
达 怨怨郾 怨缘豫 遥 将在上述优化工艺条件下所得胶原提取
液经盐析尧复溶尧超滤透析后冷冻干燥袁得率为
源源郾 圆员豫 袁纯度达 怨愿郾 员源豫 袁损失率为 苑郾 愿远豫 遥
圆郾 猿郾 圆摇 胶原蛋白的紫外光谱分析摇 如图 缘 所示袁经纯
化尧干燥后的胶原蛋白其紫外光谱的吸收峰主要集中
在 圆员园 耀 圆猿缘 灶皂之间袁其中峰值最高点出现在 圆圆苑 灶皂
猿远源
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
摇 摇 摇 摇 表 源摇 秘鲁鱿鱼皮胶原蛋白的氨基酸组成分析
栽葬遭造藻 源摇 粤皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 糟燥皂责燥泽蚤贼蚤燥灶 燥枣 糟燥造造葬早藻灶 枣则燥皂 阅燥泽蚤凿蚤糟怎泽 早蚤早葬泽 泽噪蚤灶 渊则藻泽蚤凿怎藻泽 辕 员园园园则藻泽蚤凿怎藻泽冤
氨基酸
粤皂蚤灶燥 葬糟蚤凿
秘鲁鱿鱼皮胶原蛋白
悦燥造造葬早藻灶 枣则燥皂 阅燥泽蚤凿蚤糟怎泽 早蚤早葬泽 泽噪蚤灶
氨基酸
粤皂蚤灶燥 葬糟蚤凿
秘鲁鱿鱼皮胶原蛋白
悦燥造造葬早藻灶 枣则燥皂 阅燥泽蚤凿蚤糟怎泽 早蚤早葬泽 泽噪蚤灶
粤泽责 缘员 栽赠则 愿
栽澡则 猿远 孕澡藻 员怨
杂藻则 源愿 匀蚤泽 员圆
郧造怎 怨员 蕴赠泽 圆园
郧造葬 圆愿员 粤则早 远员
粤造葬 怨缘 孕则燥 怨愿
灾葬造 圆怨 匀赠责 远怨
酝藻贼 员怨 贼燥贼葬造 员园园园
陨造藻 圆员 陨皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 员远苑
蕴藻怎 源园
图 缘摇 秘鲁鱿鱼皮胶原蛋白的紫外吸收光谱
云蚤早援 缘摇 哉造贼则葬增蚤燥造藻贼 葬遭泽燥则责贼蚤燥灶 泽责藻糟贼则葬 燥枣
糟燥造造葬早藻灶 枣则燥皂 阅燥泽蚤凿蚤糟怎泽 早蚤早葬泽 泽噪蚤灶
处袁符合相关资料报道渊胶原蛋白的吸收峰在 圆圆园 耀
圆猿园 灶皂之间冤 咱怨 原 员园暂 遥 胶原蛋白的特征吸收峰主要包
括电子的 晕寅仔鄢和 晕寅啄鄢跃迁产生的强吸收咱圆袁 员员暂 遥
可见本实验所得的胶原蛋白纯度较高遥
圆郾 猿郾 猿摇 胶原蛋白的电泳分析如图 远 所示渊酝 为蛋白
分子量标准品尧葬为玉型胶原蛋白标准品袁遭 为所提胶
原蛋白冤袁鱿鱼皮胶原蛋白主要由 茁 链尧琢员 链与 琢圆 链
组成袁为玉型胶原蛋白遥
圆郾 猿郾 源摇 胶原蛋白的氨基酸组成分析摇 秘鲁鱿鱼皮胶
原蛋白中含量最多的氨基酸为甘氨酸袁几乎占氨基酸
总量的 员 辕 猿渊表 源冤遥 与其他来源的胶原蛋白类似袁蛋
氨酸尧酪氨酸尧苯丙氨酸尧赖氨酸及组氨酸的含量较低遥
经比较发现袁秘鲁鱿鱼皮胶原蛋白中亚氨基酸渊脯氨
图 远摇 秘鲁鱿鱼皮胶原蛋白的 杂阅杂鄄孕粤郧耘图谱
云蚤早援 远摇 杂阅杂鄄责燥造赠葬糟则赠造葬皂蚤凿藻鄄早藻造 藻造藻糟贼则燥责澡燥则藻泽蚤泽
燥枣 糟燥造造葬早藻灶 枣则燥皂 阅燥泽蚤凿蚤糟怎泽 早蚤早葬泽 泽噪蚤灶
酸 辕羟脯氨酸冤含量为 员远苑 残基 辕 员园园园 残基袁较猪皮来
源渊圆圆园 残基 辕 员园园园 残基冤尧牛皮来源渊圆员缘 残基 辕 员园园园
残基冤等陆生动物来源低袁甚至低于一些水产动物来
源的胶原蛋白袁例如草鱼皮来源的亚氨基酸含量为
员愿远 残基袁大眼鲷鱼皮来源的为 员怨猿 残基咱员圆暂 遥
猿摇 讨论
胶原蛋白的提取方法主要有热水法尧碱法尧酸法尧
酶法袁其中低温下的酸法提取最为温和遥 悦澡藻灶早 等咱员猿暂
比较了醋酸尧柠檬酸尧乳酸及盐酸提取乌骨鸡脚胶原蛋
源远源
摇 猿 期 鱿鱼皮胶原蛋白的提取条件优化及其特性分析
白的效果袁发现无论是得率还是提取率袁醋酸均较优遥
阅怎葬灶等咱员源暂采用 园郾 缘 皂燥造窑蕴 原员醋酸浸提鲤鱼皮 猿 凿
渊源益冤袁得到结构较完整的胶原蛋白袁提取率达 源员郾 猿豫
渊相对于干物质冤遥 不同的原材料袁其胶原蛋白提取的
难易程度有所差异袁主要与原料中胶原蛋白之间的交
联程度有关遥 郧佼皂藻扎鄄郧怎蚤造造佴灶 等咱员缘暂分别从鳎鱼尧鲽鱼尧
鳕鱼以及鱿鱼鱼皮中提取明胶渊变性的胶原蛋白冤袁前
三者在 源缘益下提取过夜袁提取率可达 远豫 耀 愿豫 渊相对
于湿重冤袁而鱿鱼皮在 愿园益条件下袁提取率只有 圆郾 远豫 袁
可能是因为鱿鱼皮中胶原蛋白之间交联程度较大袁较
难溶出遥 研究指出胶原分子间的交联主要为共价键架
桥袁而这些架桥大多位于胶原分子的 晕以及 悦 端的非
胶原性肽渊尾肽冤部分袁易被蛋白酶切断袁而胶原分子
本身对胶原酶以外的蛋白酶具有抵抗性咱员远暂 遥 郭恒斌
等咱员苑暂分别用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶在 缘缘 和 缘园益条件
下水解鱿鱼皮制备胶原蛋白袁提取率分别为 怨缘郾 员远豫
和 怨苑郾 缘远豫 袁但在此条件下袁提取的胶原蛋白大多已水
解成胶原蛋白肽遥 胶原蛋白的热变性温度较低袁而且
鱼皮等水产来源的热变性温度较陆生动物来源的更低
些袁曾名勇等咱员愿暂研究了来自鲈鱼尧鲫鱼和鳙鱼鱼皮的
胶原蛋白热变性温度分别为 圆缘尧圆苑 和 猿园益遥 胶原蛋
白因其独特的三螺旋结构不易被蛋白酶水解袁但当其
发生热变性后袁其二级结构遭到破坏袁易被蛋白酶水解
成肽咱员怨暂 遥 因此在低温下袁通过酶促溶的方法可提高提
取效率遥 酝葬贼皂葬则燥澡 等咱缘暂及 杂蚤灶早澡 等咱圆园暂分别比较酸法
和酶促溶酸法从鱼皮中提取的胶原蛋白性质袁发现无
论是二级结构尧分子量袁还是热变性温度尧溶解性等理
化性质袁两种方法得到的胶原蛋白差异不大袁但酶促溶
酸法的提取率明显高于酸法遥
本研究在较低温度下袁采用醋酸结合胃蛋白酶法
提取鱿鱼皮中胶原蛋白袁提取率高达 缘员郾 源苑豫 曰大多数
蛋白质在 圆愿园 灶皂 处均具有很强的紫外吸收咱圆员暂 袁但胶
原蛋白由于几乎不含色氨酸袁在 圆愿园 灶皂处无明显吸收
峰袁可作为鉴定胶原蛋白纯度的方法袁本实验获得的胶
原蛋白紫外吸收峰集中在 圆员园 耀 圆猿缘 灶皂 之间袁显示其
纯化效果较好曰杂阅杂鄄孕粤郧耘 分析说明本试验所采用的
提取方法并未造成 琢尧茁 链降解遥 但与其他通过酸法
提取的鱼皮胶原蛋白比较袁有些所获得的胶原蛋
白咱员源袁 圆圆 原 圆猿暂的电泳条带中还存在分子量更大的 酌 链袁
而在本研究中并未观察到袁这可能是胃蛋白酶对胶原
蛋白尾肽的切除作用所致遥
源摇 结论
源益条件下袁通过胃蛋白酶促溶作用袁采用酸法浸
提鱿鱼皮袁胶原蛋白提取率可达 缘员郾 源苑豫 渊相对于鱿鱼
皮干物质冤遥 通过盐析尧超滤对胶原蛋白进行纯化袁得
率为 源源郾 圆员豫 袁纯度可达 怨愿郾 员源豫 袁损失率仅为为
苑郾 愿远豫 遥 杂阅杂鄄孕粤郧耘显示鱿鱼皮中的胶原蛋白主要由
琢员尧琢圆 以及 茁 链组成袁为玉型胶原蛋白袁氨基酸组成
分析表明其甘氨酸含量最高渊圆愿员 残基 辕 员园园园 残基冤袁
亚氨基酸含量为 员远苑 残基 辕 员园园园 残基遥
参考文献院
咱 员 暂摇 陈胜军袁 曾名勇袁 董士远援 水产胶原蛋白及其活性肽的研究进
展咱允暂 援 水产科学袁 圆园园源袁 圆猿渊远冤院 源源 原 源远
咱 圆 暂摇 永井裕援藤本大三郎援 胶原蛋白实验方法咱酝暂援 上海院上海中医
学院出版社袁 员怨怨圆
咱 猿 暂摇 粤澡皂葬凿 酝袁 月藻灶躁葬噪怎造 杂援 耘曾贼则葬糟贼蚤燥灶 葬灶凿 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤泽葬贼蚤燥灶 燥枣 责藻责泽蚤灶鄄
泽燥造怎遭蚤造蚤泽藻凿 糟燥造造葬早藻灶 枣则燥皂 贼澡藻 泽噪蚤灶 燥枣 怎灶蚤糟燥则灶 造藻葬贼澡藻则躁葬糟噪藻贼 渊 葬造怎贼藻则怎泽
皂燥灶燥糟藻则燥怎泽冤咱允暂 援 云燥燥凿 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆园员园袁 员圆园渊猿冤院 愿员苑 原 愿圆源
咱 源 暂摇 再葬灶 酝袁 蕴蚤 月袁 在澡葬燥 载援 陨泽燥造葬贼蚤燥灶 葬灶凿 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 糟燥造造葬早藻灶
枣则燥皂 泽择怎蚤凿 渊韵皂皂葬泽贼则藻责澡藻泽 遭葬则贼则葬皂蚤冤 泽噪蚤灶 咱 允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 韵糟藻葬灶
哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠 燥枣 悦澡蚤灶葬袁 圆园园怨袁 愿渊圆冤院 员怨员 原 员怨远援
咱 缘 暂 摇 酝葬贼皂葬则燥澡 运袁 月藻灶躁葬噪怎造 杂袁 孕则燥凿责则葬灶 栽袁 耘灶糟葬则灶葬糟蚤燥灶 粤 月袁
运蚤泽澡蚤皂怎则葬袁 匀援 悦澡葬则葬糟贼藻则蚤泽贼蚤糟泽 燥枣 葬糟蚤凿 泽燥造怎遭造藻 糟燥造造葬早藻灶 葬灶凿 责藻责泽蚤灶
泽燥造怎遭造藻 糟燥造造葬早藻灶 枣则燥皂 泽糟葬造藻 燥枣 泽责燥贼贼藻凿 早燥造凿藻灶 早燥葬贼枣蚤泽澡 渊 责葬则怎责藻灶藻怎泽
澡藻责贼葬糟葬灶贼澡怎泽冤咱允暂 援 云燥燥凿 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆园员员袁 员圆怨渊猿冤院 员员苑怨 原 员员愿缘
咱 远 暂摇 李超袁 杨文鸽袁 徐大伦袁 欧昌荣袁 施惠栋援 电子束辐照对泥蚶肉
营养成分的影响咱允暂 援 核农学报袁 圆园员员袁 圆缘渊缘冤院 怨缘怨 原 怨远源
咱 苑 暂摇 宰葬灶早 蕴袁 再葬灶早 月 粤 韵袁 阅怎 载援 耘曾贼则葬糟贼蚤燥灶 燥枣 葬糟蚤凿鄄泽燥造怎遭造藻 糟燥造造葬早藻灶
枣则燥皂 早则葬泽泽 糟葬则责 渊 糟贼藻灶燥责澡葬则赠灶早燥凿燥灶 蚤凿藻造造葬冤 泽噪蚤灶咱允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 云燥燥凿
孕则燥糟藻泽泽 耘灶早蚤灶藻藻则蚤灶早袁 圆园园怨袁 猿圆渊缘冤院 苑源猿 原 苑缘员
咱 愿 暂摇 在澡葬灶早 月袁 悦澡藻灶 再袁 宰藻蚤 载袁 蕴蚤 酝袁 宰葬灶早 酝援 韵责贼蚤皂蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣
糟燥灶凿蚤贼蚤燥灶泽 枣燥则 糟燥造造葬早藻灶 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶 枣则燥皂 贼澡藻 泽憎蚤皂 遭造葬凿凿藻则泽 燥枣 早则葬泽泽 糟葬则责
渊糟贼藻灶燥责澡葬则赠灶早燥凿燥灶 蚤凿藻造造葬冤 遭赠 则藻泽责燥灶泽藻 泽怎则枣葬糟藻 皂藻贼澡燥凿燥造燥早赠 咱 允暂 援
陨灶贼藻则灶葬贼蚤燥灶葬造 允燥怎则灶葬造 燥枣 云燥燥凿 耘灶早蚤灶藻藻则蚤灶早袁 圆园员园袁 远 渊猿冤院 员苑苑圆 原
员苑怨圆
咱 怨 暂摇 张建忠袁安辛欣袁王林袁胡秋辉援 草鱼皮酸溶性和酶溶性胶原蛋
白的提取及性质咱允暂 援 食品科学袁 圆园园远袁 圆苑渊员圆冤院 缘缘远 原 缘缘怨
咱员园暂摇 余海袁 廖小宜援 鼠尾肌腱胶原蛋白的提取及凝胶的制备咱允暂 援 海
南医学袁 圆园园园袁 员员渊猿冤院 远源 原 远缘
咱员员暂摇 赵苍碧袁 黄玉东袁 李艳辉援 从牛腱中提取胶原蛋白的研究咱 允暂 援
哈尔滨工业大学学报袁 圆园园源袁 猿远渊源冤院 缘员缘 原 缘员怨
咱员圆暂摇 在澡葬灶早 再袁 蕴蚤怎 宰袁 蕴蚤 郧袁 杂澡蚤 月袁 酝蚤葬燥 再袁 宰怎 载援 陨泽燥造葬贼蚤燥灶 葬灶凿
责葬则贼蚤葬造 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 责藻责泽蚤灶鄄泽燥造怎遭造藻 糟燥造造葬早藻灶 枣则燥皂 贼澡藻 泽噪蚤灶 燥枣
早则葬泽泽 糟葬则责 渊 糟贼藻灶燥责澡葬则赠灶早燥凿燥灶 蚤凿藻造造葬冤 咱 允暂 援 云燥燥凿 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆园园苑袁
员园猿渊猿冤院 怨园远 原 怨员圆
咱员猿暂摇 悦澡藻灶早 云 再袁 匀泽怎 云 宰袁 悦澡葬灶早 匀 杂袁 蕴蚤灶 蕴 悦袁 杂葬噪葬贼葬 砸援 耘枣枣藻糟贼 燥枣
凿蚤枣枣藻则藻灶贼 葬糟蚤凿泽 燥灶 贼澡藻 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶 燥枣 责藻责泽蚤灶鄄泽燥造怎遭蚤造蚤泽藻凿 糟燥造造葬早藻灶
糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早 皂藻造葬灶蚤灶 枣则燥皂 泽蚤造噪赠 枣燥憎造 枣藻藻贼咱允暂 援 云燥燥凿 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆园园怨袁
员员猿渊圆冤院 缘远猿 原 缘远苑
咱员源暂摇 阅怎葬灶 砸袁 在澡葬灶早 允袁 阅怎 载袁 再葬燥 载袁 运燥灶灶燥 运援 孕则燥责藻则贼蚤藻泽 燥枣 糟燥造造葬早藻灶
枣则燥皂 泽噪蚤灶袁 泽糟葬造藻 葬灶凿 遭燥灶藻 燥枣 糟葬则责 渊 糟赠责则蚤灶怎泽 糟葬则责蚤燥冤 咱 允暂 援 云燥燥凿
悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆园园怨袁 员员圆渊猿冤院 苑园圆 原 苑园远
缘远源
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
圆园员源袁圆愿渊猿冤院园源缘怨 耀 园源远远
咱员缘暂摇 郧佼皂藻扎鄄郧怎蚤造造佴灶 酝袁 栽怎则灶葬赠 允袁 云藻则灶佗灶凿藻扎鄄阅覦葬扎 酝袁 哉造皂燥 晕袁 蕴蚤扎葬则遭藻
酝袁 酝燥灶贼藻则燥 孕援 杂贼则怎糟贼怎则葬造 葬灶凿 责澡赠泽蚤糟葬造 责则燥责藻则贼蚤藻泽 燥枣 早藻造葬贼蚤灶 藻曾贼则葬糟贼藻凿
枣则燥皂 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 皂葬则蚤灶藻 泽责藻糟蚤藻泽院 粤 糟燥皂责葬则葬贼蚤增藻 泽贼怎凿赠 咱 允 暂 援 云燥燥凿
匀赠凿则燥糟燥造造燥蚤凿泽袁 圆园园圆袁 员远渊员冤院 圆缘 原 猿源
咱员远暂摇 郭恒斌袁 曾庆祝援 酶法提取鱿鱼皮胶原蛋白工艺条件的研究
咱允暂 援 南方水产科学袁 圆园园愿袁 员渊源冤院 缘愿 原 远猿援
咱员苑暂摇 宰葬造贼燥灶 砸 杂袁 月则葬灶凿 阅 阅袁 悦扎藻则灶怎泽扎噪葬 允 栽援 陨灶枣造怎藻灶糟藻 燥枣 贼藻造燥责藻责贼蚤凿藻泽袁
枣蚤遭则蚤造泽 葬灶凿 糟则燥泽泽造蚤灶噪蚤灶早 燥灶 责澡赠泽蚤糟燥糟澡藻皂蚤糟葬造 责则燥责藻则贼蚤藻泽 燥枣 贼赠责藻 陨
糟燥造造葬早藻灶 枣蚤造皂泽 咱 允 暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 酝葬贼藻则蚤葬造泽 杂糟蚤藻灶糟藻院 酝葬贼藻则蚤葬造泽 蚤灶
酝藻凿蚤糟蚤灶藻袁 圆园员园袁 圆员渊圆冤院 源缘员 原 源远员
咱员愿暂摇 曾名勇袁 张联英袁 刘尊英袁 董士远袁 李八方援 几种鱼皮胶原蛋白
的理化特性及其影响因素咱 允暂 援 中国海洋大学学报院 自然科学
版袁 圆园园缘袁 猿缘渊源冤院 远园愿 原 远员圆
咱员怨暂摇 晕葬造蚤灶葬灶燥灶 杂袁 月藻灶躁葬噪怎造 杂袁 运蚤泽澡蚤皂怎则葬 匀袁 韵泽葬噪燥 运援 栽赠责藻 陨 糟燥造造葬早藻灶
枣则燥皂 贼澡藻 泽噪蚤灶 燥枣 燥则灶葬贼藻 贼澡则藻葬凿枣蚤灶 遭则藻葬皂 渊 灶藻皂蚤责贼藻则怎泽 澡藻曾燥凿燥灶 冤院
悦澡葬则葬糟贼藻则蚤泽贼蚤糟泽 葬灶凿 藻枣枣藻糟贼 燥枣 责藻责泽蚤灶 澡赠凿则燥造赠泽蚤泽咱 允暂 援 云燥燥凿 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁
圆园员员袁 员圆缘渊圆冤院 缘园园 原 缘园苑
咱圆园暂摇 杂蚤灶早澡 孕袁 月藻灶躁葬噪怎造 杂袁 酝葬择泽燥燥凿 杂袁 运蚤泽澡蚤皂怎则葬 匀援 陨泽燥造葬贼蚤燥灶 葬灶凿
糟澡葬则葬糟贼藻则蚤泽葬贼蚤燥灶 燥枣 糟燥造造葬早藻灶 藻曾贼则葬糟贼藻凿 枣则燥皂 贼澡藻 泽噪蚤灶 燥枣 泽贼则蚤责藻凿 糟葬贼枣蚤泽澡
渊责葬灶早葬泽蚤葬灶燥凿燥灶 澡赠责燥责澡贼澡葬造皂怎泽冤 咱 允暂 援 云燥燥凿 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆园员员袁 员圆源
渊员冤院 怨苑 原 员园缘
咱圆员暂摇 林琳援 鱼皮胶原蛋白的制备及胶原蛋白多肽活性的研究咱阅暂援
青岛院博士学位论文袁 中国海洋大学袁 圆园园远
咱圆圆暂摇 韵早葬憎葬 酝袁 孕燥则贼蚤藻则 砸 允袁 酝燥燥凿赠 酝 宰袁 月藻造造 允袁 杂糟澡藻曾灶葬赠凿藻则 酝 粤袁
蕴燥泽泽燥 允 晕援 月蚤燥糟澡藻皂蚤糟葬造 责则燥责藻则贼蚤藻泽 燥枣 遭燥灶藻 葬灶凿 泽糟葬造藻 糟燥造造葬早藻灶泽
蚤泽燥造葬贼藻凿 枣则燥皂 贼澡藻 泽怎遭贼则燥责蚤糟葬造 枣蚤泽澡 遭造葬糟噪 凿则怎皂 渊 责燥早燥灶蚤葬 糟则燥皂蚤泽冤 葬灶凿
泽澡藻藻责泽澡藻葬凿 泽藻葬遭则藻葬皂 渊 葬则糟澡燥泽葬则早怎泽 责则燥遭葬贼燥糟藻责澡葬造怎泽 冤 咱 允 暂 援 云燥燥凿
悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆园园源袁 愿愿渊源冤院 源怨缘 原 缘园员
咱圆猿暂摇 再葬灶 酝袁 蕴蚤 月袁 在澡葬燥 载袁 砸藻灶 郧援 袁 在澡怎葬灶早 再袁 匀燥怎 匀袁 在澡葬灶早 载袁
悦澡藻灶 蕴袁 云葬灶 再援 悦澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 葬糟蚤凿鄄泽燥造怎遭造藻 糟燥造造葬早藻灶 枣则燥皂 贼澡藻
泽噪蚤灶 燥枣 憎葬造造藻赠藻 责燥造造燥糟噪 渊 贼澡藻则葬早则葬 糟澡葬造糟燥早则葬皂皂葬 冤 咱 允 暂 援 云燥燥凿
悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆园园愿袁 员园苑渊源冤院 员缘愿员 原 员缘愿远
韵责贼蚤皂蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 耘曾贼则葬糟贼蚤燥灶 悦燥灶凿蚤贼蚤燥灶泽 燥枣 悦燥造造葬早藻灶 葬灶凿 陨贼泽 悦澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶
枣则燥皂 杂噪蚤灶 燥枣 允怎皂遭燥 枣造赠蚤灶早 泽择怎蚤凿 渊阅燥泽蚤凿蚤糟怎泽 早蚤早葬泽冤
酝粤韵 再怎鄄澡燥灶早摇 蕴陨哉 允怎灶鄄澡葬燥摇 再粤晕郧 宰藻灶鄄早藻摇 载哉 阅葬鄄造怎灶摇 在匀粤晕郧 允蚤灶鄄躁蚤藻
渊杂糟澡燥燥造 燥枣 酝葬则蚤灶藻 杂糟蚤藻灶糟藻袁 晕蚤灶早遭燥 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 晕蚤灶早遭燥袁在澡藻躁蚤葬灶早摇 猿员缘圆员员冤
粤遭泽贼则葬糟贼院耘曾贼则葬糟贼蚤燥灶 糟燥灶凿蚤贼蚤燥灶泽 燥枣 糟燥造造葬早藻灶 枣则燥皂 贼澡藻 泽噪蚤灶 燥枣 允怎皂遭燥 枣造赠蚤灶早 泽择怎蚤凿 渊阅燥泽蚤凿蚤糟怎泽 早蚤早葬泽冤 憎藻则藻 燥责贼蚤皂蚤扎藻凿 葬灶凿 贼澡藻
皂葬蚤灶 枣藻葬贼怎则藻泽 燥枣 贼澡藻 糟燥造造葬早藻灶 憎藻则藻 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎藻凿援 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 藻曾贼则葬贼蚤燥灶 枣葬糟贼燥则泽 燥灶 糟燥造造葬早藻灶 憎藻则藻 泽贼怎凿蚤藻凿 怎泽蚤灶早
泽蚤灶早造藻鄄枣葬糟贼燥则 藻曾责藻则蚤皂藻灶贼泽 葬灶凿 则藻泽责燥灶泽藻 泽怎则枣葬糟藻 皂藻贼澡燥凿燥造燥早赠援 栽澡藻 燥责贼蚤皂葬造 糟燥灶凿蚤贼蚤燥灶泽 憎藻则藻 葬泽 枣燥造造燥憎泽院 责藻责泽蚤灶
糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥枣 圆豫 渊憎 辕 憎冤袁 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶 贼蚤皂藻 燥枣 缘猿 澡袁 葬糟藻贼蚤糟 葬糟蚤凿 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥枣 园郾 苑园 皂燥造窑蕴 原员袁 葬灶凿 泽燥造蚤凿鄄造蚤择怎蚤凿 则葬贼蚤燥
燥枣 员院圆源园 渊憎 辕 增冤援 哉灶凿藻则 贼澡藻泽藻 糟燥灶凿蚤贼蚤燥灶泽袁 贼澡藻 赠蚤藻造凿 燥枣 糟则怎凿藻 糟燥造造葬早藻灶 憎葬泽 怎责 贼燥 缘员郾 源苑豫 援 栽澡藻 糟则怎凿藻 糟燥造造葬早藻灶 憎葬泽 贼澡藻灶
责怎则蚤枣蚤藻凿 遭赠 泽葬造贼蚤灶早 责则藻糟蚤责蚤贼葬贼蚤燥灶 葬灶凿 怎造贼则葬枣蚤造贼则葬贼蚤燥灶援 栽澡藻 燥遭贼葬蚤灶藻凿 糟燥造造葬早藻灶 枣则燥皂 阅援 早蚤早葬泽 葬责责藻葬则藻凿 贼燥 糟燥灶贼葬蚤灶 皂葬蚤灶造赠 贼赠责藻
陨 糟燥造造葬早藻灶袁 糟燥皂责燥泽藻凿 燥枣 琢员袁 琢圆 葬灶凿 茁 糟澡葬蚤灶泽援 粤皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 葬灶葬造赠泽蚤泽 则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 早造赠糟蚤灶藻 憎葬泽 贼澡藻 皂葬躁燥则 燥灶藻
憎蚤贼澡 圆愿员 则藻泽蚤凿怎藻泽 辕 员园园园 则藻泽蚤凿怎藻泽 葬灶凿 贼澡藻 蚤皂蚤灶燥 葬糟蚤凿泽 燥枣 员远苑 则藻泽蚤凿怎藻泽 辕 员园园园 则藻泽蚤凿怎藻泽援
运藻赠 憎燥则凿泽院悦燥造造葬早藻灶曰 阅燥泽蚤凿蚤糟怎泽 早蚤早葬泽曰 砸藻泽责燥灶泽藻 泽怎则枣葬糟藻 皂藻贼澡燥凿燥造燥早赠曰 杂阅杂鄄孕粤郧耘曰 粤皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 葬灶葬造赠泽蚤泽
远远源