全 文 ：核 农 学 报 2011，25(1):0062 ～ 0066
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2011)01-0062-05
玉米叶绿体铁氧还蛋白 1 的原核表达及部分性质分析
冯爱花 陈宗梅 李 静 程备久 范 军
(安徽农业大学生命科学学院 /安徽省作物生物学重点实验室，安徽 合肥 230036)
摘 要:叶绿体铁氧还蛋白(Fd)通过活性中心的铁硫簇传递还原力，在各种氧化还原途径中起重要作
用。本研究中，氨基酸序列比对显示玉米中 5 种 Fd 的叶绿体导肽同源性很低，而去除导肽的成熟蛋白
氨基酸序列具有很高的同源性。采用 RT-PCR 技术从玉米幼叶总 RNA 中克隆了编码成熟 Fd1 的基因，
并分别插入 pQE 80 和 p28SUMO 表达载体，转化大肠杆菌 BL21(DE3)，表达的 N 端含有组氨酸标签的
Fd1(His-Fd1)，和含有组氨酸标签的小类泛素修饰蛋白(SUMO)的 Fd1(HisSUMO-Fd1)，用 Ni-NTA 层
析介质亲和纯化，SDS-PAGE 显示纯化的 His-Fd1 为一条带，亚基分子量约 12kD。纯化的 HisSUMO-Fd1
用专一性蛋白酶 Ulp 除去 HisSUMO，获得纯化的 Fd1。紫外可见光谱扫描显示纯化的 HisSUMO-Fd1 溶
液在 315nm、415nm 和 459nm 有特异吸收峰，电子顺磁共振波谱分析表明 Fd1 中存在［2Fe-2S］。SDS-
PAGE 显示多种玉米幼叶可溶性蛋白被固定化的 His-Fd1 吸附。
关键词:铁氧还蛋白(Fd);Fd1;玉米;重组表达;纯化;铁硫簇
PROKARYOTIC EXPRESSION AND PARTIAL CHARACTERIZATION OF
MAIZE CHLOROPLAST FERREDOXIN 1
FENG Ai-hua CHEN Zong-mei LI Jing CHENG Bei-jiu FAN Jun
(Provincial Key Lab of Crop Science，School of Life Science，Anhui Agricultural University，Hefei，Anhui 230036)
Abstract:The ferredoxin (Fd)proteins in plant chloroplasts play important roles in cellular metabolism by delivering
reducing equivalents through the ［2Fe-2S］cluster in the active site to various essential oxido-reductive pathways. In
this study，the chloroplast leading peptides from five Fd proteins of maize share the low homogeneity，whereas the mature
Fd proteins deleted the leading peptides are high homogeneous，as displayed by the amino acid sequence alignments.
The gene encoding mature maize ferredoxin 1 (Fd1)was cloned by RT-PCR using the total RNA from young leaves as
the template. The cloned gene was inserted into pQE80 and p28SUMO plasmid，and transformed into Escherchia coli
BL21(DE3)respectively. The expressed Fd1 fused with the histidine-tag (His-Fd1)or HisSUMO tag (HisSUMO-Fd1)
at N terminus，was purified by Ni-NTA affinity chromatography independently. The recombinant Fd1 protein was
obtained by removing the HisSUMO using the specific protease Ulp. SDS-PAGE analysis showed that purified His-Fd1
has a molecular mass of about 12kD. The purified HisSUMO-Fd1 has the absorption peaks at 315，415 and 459 nm
identified by UV-visible spectra scanning，and the ［2Fe-2S］cluster determined by electron paramagnetic resonance
(EPR)experiments. Several proteins from soluble extracts of young maize leaves were bound by the immobilized His-
Fd1，as shown by SDS-PAGE analysis.
Key words:ferredoxin protein;Fd1;maize (Zea mays);prokaryotic expression;purification; ［2Fe-2S］cluster
收稿日期:2010-06-23 接受日期:2010-10-18
基金项目:转基因生物新品种培育重大专项(No. 2009ZX0810-002B)，国家自然科学基金(No. 30840018)，安徽省攻关课题(No. 0701302137)
作者简介:冯爱花(1983-)，女，山东临沂人，硕士，研究方向为植物生物化学。Tel:0551-5786021，E-mail:007zhenpeng@ sina. com
通讯作者:范 军(1963-)，男，安徽淮北人，博士，教授，研究方向为植物生物化学。Tel:0551-5786464;E-mail:fanjun@ ahau. edu. cn
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1 期 玉米叶绿体铁氧还蛋白 1 的原核表达及部分性质分析
铁氧还蛋白(ferredoxin，Fd )是生物体内可溶性
的酸性电子传递蛋白，它分子量较小，由 4 个高度保守
的半胱氨酸残基与铁原子结合组成铁硫簇，依赖 Fe2 +
和 Fe3 +变化传递电子。植物中含有多种 Fd，因功能多
样性受到广泛关注［1］。目前，玉米叶绿体 Fd 研究较
为深入，纯化了 4 种蛋白，并分析了 N 端氨基酸序列，
第一个氨基酸残基为 Ala。二维电泳分析表明玉米叶
绿体含有 5 种 Fd，它们在维管束和叶肉叶绿体的分布
不一［2］，Fd1 在玉米幼叶发育中表达较高［3］。在大肠
杆菌中重组表达并纯化了玉米 Fd3［3］。Fd 和多种蛋
白和酶相互作用，它们涉及氧化还原信号、氮和硫的同
化和氨基酸合成等。
重组蛋白常融合表达组氨酸标签和其他分子伴
侣，它们分别用于蛋白的快速纯化或促进下游靶蛋白
的折叠和水溶性，小类泛素修饰蛋白(Small Ubiquitin-
Related Modifier，SUMO)是其中一种分子伴侣。然
而，这些标签或融合蛋白有时影响蛋白的功能和结构，
需要将其去除，切除 SUMO 的水解酶 Ulp 活性高且具
有空间专一性，去除 SUMO 后，靶蛋白的 N 端仅多出
一个 Gly 残基［5］。
目前，与 Fd 相互作用的蛋白数目和种类尚不清
楚，已报道将纯化的 Fd 共价偶联在介质上，用以分离
和 Fd 相互作用的蛋白［6］。玉米自交系 B73 的基因组
已经测序，根据公布的序列，本研究克隆了去除叶绿体
导肽的玉米成熟 Fd1 编码基因，纯化了含有组氨酸标
签的 Fd1(His-Fd1)和 SUMO 融合的 Fd1(HisSUMO-
Fd1)，发现这些标签对 Fd1 的结构没有影响，进一步
分析了 HisSUMO-Fd1 的铁硫簇，将 His-Fd1 中的组氨
酸标签固定在层析介质上，吸附与 Fd1 相互作用的蛋
白，为进一步研究 Fd1 的活性和确定作用蛋白的具体
种类奠定基础。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 材料、菌株和质粒 玉米自交系 B73 为本实
验室保存。大肠杆菌菌株 DH5α 和 BL21(DE3)感受
态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，pQE80 质
粒是德国 Qiagen 公司产品，p28SUMO 和 p28Ulp 载体
分别含有酿酒酵母 SUMO3 及其水解酶 Ulp 的编码基
因，由本实验室构建。
1. 1. 2 试剂 酵母提取物和胰蛋白胨是英国 Oxford
公司产品，pMD18-T 载体、总 RNA 提取试剂盒、RT-
PCR 试剂盒和 T4 DNA 连接酶购自美国 Promega 公司，
限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、X-Gal、IPTG 是大连
宝生物公司产品，标准分子量 DNA 和蛋白是北京全式
金生物技术有限公司产品，Ni-NTA 为美国 Sigma 公司
产品，蛋白超滤管和滤膜为美国 Millipore 公司生产，其
他试剂、引物合成和基因测序服务由上海生工生物技
术公司提供。
1. 1. 3 生物信息学数据 来源于 National Center for
Biotechnology Information(NCBI)数据库，蛋白序列包
括 Fd1(登录号 gb | ACA34367. 1)、Fd2(登录号 gb |
ACA34368. 1)、Fd3(登录号 gb | ACG28858. 1)、Fd5
(登 录 号 gb | ACA34366. 1)和 Fd6 (登 录 号 gb |
ACG32559. 1 )。 Fd1 的 基 因 序 列 (登 录 号
EU328185. 1)。
1. 1. 4 仪器设备 高速冷冻离心机、紫外可见分光光
度仪、电子顺磁共振仪和凝胶成像系统分别是日本
Hitachi 公司和 Kodark 公司产品。核酸和蛋白电泳仪
和台式高速离心机分别由美国 Bio-Rad 公司和 Sigma
公司制造，PCR 仪是德国 Biometra 公司产品，细胞破
碎仪由中国浙江宁波新芝公司提供。
1. 2 方法
1. 2. 1 编码成熟 Fd1 基因的扩增 根据 GenBank 登
陆的 Fd1 编码基因，设计上游引物:5′-GGA TCC TAC
AAC GTG AAG CTG ATC ACG CCA GAG-3′;下游引
物:5′-AAG CTT ATG CGC CGG TGA GCT CCT CCT
CCT TGT-3′(下划线分别为 BamHⅠ和 Hind Ⅲ酶切序
列)。采用 Trizol 法提取玉米幼叶的总 RNA，反转录获
得 cDNA，以 cDNA 为模板根据 RT-PCR 方法扩增 Fd1
基因。PCR 反应条件:94℃ 预变性 10min;94℃ 变性
30s，58℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 个循环。电泳检
测扩增片段，产物插入 T 载体，测序。
1. 2. 2 His-Fd1 和 HisSUMO-Fd1 的纯化 选取测序
正确的克隆提取质粒，BamHⅠ和 Hind Ⅲ酶切，回收基
因片段，分别插入同样酶切的 pQE80 和 p28SUMO 质
粒，分别转化大肠杆菌菌株 DH5α，挑取菌斑，提取质
粒经酶切验证已插入片段是否正确。将重组质粒转化
大肠杆菌表达菌株 BL21(DE3)。挑取重组菌落，在
10ml 的 LB 培养基中，按照不同质粒的抗性，加入一定
浓度的抗生素，在 37℃，220 r /min 培养 12h，按照体积
比 1∶ 200 转入 1L 的 LB 培养基扩大培养，当 OD600约为
0. 4 时，加入终浓度为 0. 4mmol /L 的 IPTG，28℃诱导
表达 10h 后，4℃下 6000g 离心 10min，收集菌体，加入
约 30ml 的缓冲液 A (100mmol /L 的磷酸盐，内含
300mmol /L NaCl 和 10mmol /L 咪唑，pH8. 0)，超声破
碎(300W，每次 3s，间隔 9s，共 99 次)，4℃下 15000 g
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核 农 学 报 25 卷
离心 30min，弃沉淀，上清液过 Ni-NTA(5ml)胶，用 50
ml 的缓冲液 A 过柱，再用 50ml 的缓冲液 B(缓冲液 A
的咪唑浓度调至 20mmol /L)除去杂蛋白，最后用 40ml
的缓冲液 C(缓冲液 A 的咪唑浓度调至 250mmol /L)洗
脱。超滤，蛋白在缓冲液 D(20mmol /L 的 Tris-HCl，
100mmol /L 的 NaCl，pH8. 0)中保存。
HisSUMO-Fd1 在缓冲液 D 中超滤后，按照体积比
1∶ 200 加入纯化的 SUMO 专一性水解酶 Ulp，4℃反应
16h 后，过 Ni-NTA 柱，纯化的 Fd1 超滤后溶于缓冲液
D，－ 70℃保存。
1. 2. 3 HisSUMO-Fd1 中的铁硫簇分析 纯化的
HisSUMO-Fd1 溶液 100μl，用双蒸水稀释至 1ml，蛋白
浓度 2mg /ml，紫外光扫描，扫描波段为 300 ～ 700nm。
HisSUMO-Fd1 溶液电子顺磁共振分析［7］，参数为:扫
描速率平均为 25mT /min，调试幅度 0. 35mT，频率
9050. 480MHz，波强 5mW，扫描时间 2min。
1. 2. 4 Fd1 结合玉米幼叶可溶性靶蛋白的分析 首
先，制备固定的 Fd1 亲和层析介质:1ml 的 Ni-NTA 层
析介质加入 30mg 纯化的 His-Fd1，将为结合的 Fd1 用
缓冲液 D 洗脱;其次，制备玉米幼叶可溶性蛋白:萌发
至 3 叶的玉米幼苗，按 1:5(W /V)加入缓冲液 E
(50mmol /L 的 Tris-HCl，pH8. 0，内含 1mmol /L 的苯甲
基磺酰氟，2mmol /L 的苯甲脒)，匀浆，15000g 冷冻离
心 30min，弃沉淀。第三:可溶性蛋白结合 Fd1:提取的
幼叶可溶性蛋白，和固定 His-Fd1 的介质 4℃孵育过
夜，用缓冲液 F(50mmol /L 的 NaH2PO4，10mmol /L 的
咪唑，pH8. 0)洗脱未结合蛋白，用缓冲液 G(缓冲液 F
含有 100mmol /L 的 NaCl)清洗 20 个柱体积，用缓冲液
H(缓冲液 F 含有 500mmol /L 的 NaCl)洗脱，洗脱液用
终浓度 5%的三氯乙酸沉淀蛋白，SDS-PAGE 分析。
1. 2. 5 蛋白质分析 蛋白质浓度分析采用考马斯亮
G-250 染色法，以牛血清白蛋白作对照。SDS-PAGE 采
用不连续胶，即 15%分离胶和 5%浓缩胶，电泳后用考
马斯亮蓝 R-250 染色，电泳结果用凝胶成像系统相应
软件计算相对比率。
1. 2. 6 玉米叶绿体 Fd 的生物信息学分析 利用
ClustalW(http:/ / align. genome. jp /)分析蛋白氨基酸序
列的同源性。利用 NEBcutter V2. 0(http:/ / tools. neb.
com /NEBcutter2 /)预测基因的限制性内切酶位点，利
用 Translate tool (http:/ /www. expasy. ch / tools / dna.
html)分析基因编码的氨基酸序列。
2 结果
2. 1 玉米叶绿体 Fd 的氨基酸序列比对
从 GenBank 搜索到 5 种玉米叶绿体 Fd 蛋白(根据
发现人定名)，经氨基酸序列比对显示 N 端约 50 个氨基
酸残基保守性较差(图 1)。已报道成熟 Fd 的第一个氨
基酸残基为 Ala，表明不同 Fd 同工蛋白的叶绿体导肽组
成差异明显，而成熟 Fd 之间具有很高的同源性。
图 1 5 种玉米叶绿体 Fd 的氨基酸序列比对
Fig. 1 Amino acid sequence alignments of five chloroplast Fd proteins from maize
去除叶绿体导肽的成熟 Fd1 第一个氨基酸残基用倒三角表示
The first amino acid residues of the mature Fd proteins deleted the chloroplast leading peptides were illustrated by an inverted triangle
2. 2 扩增编码成熟 Fd1 的基因
PCR 的扩增产物电泳检测到约 300bp 的特异条带
(图 2)，和目的片段的大小相符，测序结果与编码成熟
Fd1 的核苷酸序列(登录号 EU328185. 1)仅有 1 个碱
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1 期 玉米叶绿体铁氧还蛋白 1 的原核表达及部分性质分析
基产生突变，且编码的氨基酸残基不变，属于同义突
变。其中编码 Fd1 前两个氨基酸残基为 GlySer，由引
物设计的 BamHI 酶切序列 GGATCC 编码，代替 Fd1 成
熟蛋白的前两个残基 AlaThr，属于相似氨基酸残基突
变。
图 2 编码玉米成熟 Fd1 基因的 PCR 扩增结果
Fig. 2 PCR results of gene encoding
maize mature Fd1
2. 3 Fd1 的表达和纯化
His-Fd1 经 SDS-PAGE 分析表明它占重组大肠杆
菌可溶性蛋白的 7%，纯化的蛋白呈现 1 条主带，亚基
分子量约 12 kD(图 3)，和计算的分子量一致，从 1L 培
养基中获得约 20mg 纯化的 His-Fd1。
图 3 纯化的 His-Fd1 的 SDS-PAGE
Fig. 3 SDS-PAGE of the purified His-Fd1
M:蛋白标准分子量;1:未诱导细胞可溶性蛋白;
2:诱导细胞可溶性蛋白;3:纯化的 His-Fd1
M:Protein molecular mass marker;1:soluble protein samples
from cells without induction;2:soluble protein samples from
cells induced by IPTG;3:purified His-Fd1
SUMO 蛋白专一性水解酶 Ulp，能有效切开纯化的
HisSUMO-Fd1，除去 SUMO 标签，纯化的 Fd1 显示一条
主带(图 4)，但纯度不高，1L 培养的重组大肠杆菌可
获得约 12mg 纯化的 Fd1。
图 4 纯化的 Fd1 的 SDS-PAGE
Fig. 4 SDS-PAGE of the purified Fd1
M:蛋白标准分子量;1:纯化的 HisSUMO-Fd1;
2:Ulp 酶切 HisSUMO-Fd1;3:纯化的 Fd1
M:Protein molecular mass marker;1:The purified HisSUMO-
Fd1;2:The purified HisSUMO-Fd1 cleaved by Ulp protease;
3:the purified Fd1
2. 4 Fd1 铁硫簇的鉴定
纯化的 HisSUMO-Fd1 溶液显棕红色，这种颜色也
存在纯化的 Fd1 溶液。为此，本研究用紫外光谱扫描
HisSUMO-Fd1 溶液，结果显示在 315、415 和 459 nm 有
3 个吸收峰(图 5)，这是蛋白铁硫簇的特异吸收峰。
电子顺磁共振分析计算出的 g 值为 2. 00050，图形呈
现典型的 S = 1 /2EPR 信号(图 6)，表明 Fd1 中存在
［2Fe-2S］。
图 5 HisSUMO-Fd1 溶液的紫外可见光谱扫描
Fig. 5 UV-visible spectra of the purified
HisSUMO-Fd1
2. 5 固定化 Fd1 吸附玉米幼叶蛋白
固定在 Ni-NTA 的 His-Fd1 能吸附结合玉米幼叶
中的蛋白电泳图谱显示，结合 Fd1 的玉米幼叶的蛋白
具有多态性(图 7)，表明多种蛋白结合 Fd1，其分子量
大小有较大变化。另外，洗脱的靶蛋白中未观察到和
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图 6 HisSUMO-Fd1 溶液的电子
顺磁共振波谱
Fig. 6 EPR spectra of the purified HisSUMO-Fd1
Fd1 分子量相符的条带(图 7)，表明 Fd1 结合 Ni-NTA
能力较强。
图 7 固定化 His-Fd1 吸附的玉米幼叶蛋白
Fig. 7 Proteins of maize young seedling
absorbed by immobilized His-Fd1
M:蛋白标准分子量;1:纯化的 His-Fd1;2:缓冲液 G 洗脱掉未
结合杂蛋白后的样品;3:缓冲液 H 洗脱的蛋白样品;4:提取的
玉米幼叶可溶性总蛋白
M:protein molecular mass marker. 1:Purified His-Fd1;
2:Samples after removal of unbounded proteins eluted with
the buffer G;3:Samples eluted with buffer H;4:Soluble
protein samples extracted from maize young seedling.
3 讨论
本研究克隆了 Fd1，它和其他 4 种玉米叶绿体 Fd
同源性很高，推测不同 Fd 由一个共同祖先进化而来。
而叶绿体导肽组成保守性低，这可能与不同 Fd 在玉米
幼叶的表达水平存在差异，蛋白前体运输到叶绿体的
效率有关。
早期大肠杆菌重组表达玉米 Fd，纯化步骤包括离
子交换介质吸附、硫酸铵分级沉淀、分子筛层析、离子
交换层析和疏水交换层析，费时费力，而且得率低［3］，
本研究所用的大肠杆菌表达载体是 T7 启动子，它是强
启动子，在大肠杆菌重组表达其他植物蛋白时效果很
好［8，9］，借助组氨酸标签，一步纯化获得 His-Fd1 和
HisSUMO-Fd1，同时除去 HisSUMO 标签，获得了 Fd1。
纯化的蛋白用于不同的研究，如 His-Fd1 用于固定化
捕获与其相互作用的蛋白，Fd1 用于研究体外与固定
的含有组氨酸标签的 Fd 还原酶结合作用;HisSUMO-
Fd1 用于铁硫簇分析，因为重组蛋白产量高，折叠好，
且 SUMO 不影响 Fd1 的铁硫簇。
纯化的 His-Fd1 中组氨酸标签，不仅用于固定
Fd1，而且提供介质和 Fd1 之间产生连接臂，防止空间
位阻影响 Fd1 与其他蛋白的结合。本研究用固定化的
Fd1 捕获玉米幼叶与其结合的蛋白，取得较好的效果，
这种技术的应用已有成功的例子［10］，它比共价偶联技
术要好，后者偶联量低，偶联部位不均一，容易产生空
间位阻。本研究结果为进一步分析 Fd1 结合蛋白的种
类奠定了基础。
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(责任编辑 王媛媛)
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