全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 0120065205
PVX介导拟南芥 Flowering locus T诱导烟草开花研究
刘旭新1 ,3 　Stephen Jackson2 　李春阳2
(11 西北农林科技大学园艺学院 ,陕西 杨凌　712100 ; 21 Warwick University ,HRI ,UK,CV35 9EF ;
31 新疆农业职业技术学院 ,新疆 昌吉　831100)
摘 　要 :为研究拟南芥 Flowering locus T ( FT) 基因在开花诱导过程中的重要生物功能 ,本研究用 RT2PCR
方法 ,从拟南芥野生型 (WS)中得到全长 FT 序列 ,采用 Potato Virus X( PVX ) 野生型病毒构建载体 ,将全
长 FT 基因连接到 PVX第 5 个阅读框架即 Coat Protein (CP) 编码序列之前 ,经体外转录成 PVX2FT 病毒
RNA ,人工感染短日照烟草 Maryland mommath ,成功诱导短日照烟草在长日照条件下开花。
关键词 :拟南芥 Flowering Locus T ( FT) ;马铃薯 X病毒 (PVX) ;RT2PCR ;开花
TOBACCO FLOWERING TRIGGERED BY ARABIDOPSIS Flowering locus T CONDUCTED BY PVX
LIU Xu2xin1 ,3 　Stephen Jackson2 　LI Chun2yang2
(11 College of Horticulture , Northwest A &F University , Yangling , Shaanxi 　712100 ;
21Warwick HRI , UK , CV35 9 EF ; 31 Xinjiang Vocational & Technological College of Agriculture , Changji , Xinjiang 　831100)
Abstract :A research was carried out to prove the bio2function of Arabidopsis Flowering Locus T( FT) in floral genetic network
of photoperiod pathway. The method of RT2PCR as used to isolate full length FT from wild type Arabidopsis (WS) , FT
sequence cloned into Open Read Frame 5 (ORF5) on Potato Virus X ( PVX) vector , positioned before coat protein (CP)
sequence ; PVX2 FT virus RNA was obtained by reaction of in vitro transcription , inoculated on leaves of tobacco manually.
PVX2 FT successfully trigger flowering of short2day type tobacco plant Maryland mommath in longday.
Key words : Arabidopsis Flowering locus T( FT) ;Potato Virus X(PVX) ;RT2PCR ;flowering
收稿日期 :2008205214 　接受日期 :2008207202
基金项目 :国家留学基金委中英卓越联合培养博士生计划支持项目 (2006100965)
作者简介 :刘旭新 (19712) ,男 ,广东新会人 ,讲师 ,主要研究方向为蔬菜生理与生物技术。E2mail :lxx529 @yahoo. com. cn
通讯作者 :Stephen Jackson , 男 ,博士 ,英国华威大学国际园艺研究中心高级研究员。
　　“开花素”一直是众多科学家寻找的神奇物质 ,但
“开花素”实质是什么仍然是个迷 ,最近在对拟南芥
Flowering Locus T ( FT) 基因的研究中发现 , FT 编码的
蛋白可能就是“开花素”的重要组成部分之一 , FT 蛋白
是一种类似磷酯酰乙醇胺结合蛋白 ,在动物中的 FT
同源基因编码的是 RAF 激酶抑制蛋白[1 ,2 ] 。
拟南芥 FT 基 因 是 光 周 期 途 径 ( Photoperiod
Pathway)中的重要枢纽基因[3 ] ,在拟南芥光周期途径
中 ,光敏色素 PHY 与 CHY 感受外界光照变化 ,调节
CONSTANS ( CO) 基因节律表达 , CO 的表达蛋白调节
FT 和 Suppressor of Overexpression of CO1 ( SOC1) 基因表
达 ,将开花信号传导到顶端分生组织 , FT 在顶端分生
组织与 bZIP 转录因子 Flowering Locus D ( FD)共同作用
与下游成花基因 L EA FY ( L FY) 和 A PETALA1 ( A P1) 引
起开花[4 ] 。FT 基因不仅在高等植物光周期途径中起
主要开花信号传导作用 ,还参与调节其他开花途径的
开花信号传导到顶端诱导花芽分化[5 ] ,说明 FT 在开
花诱导综合途径中起重要的枢纽整合作用。
FT 主要在叶片维管束中表达[6 ] , 在开花诱导过
程中 FT蛋白或 FT mRNA 都有可能是开花传递信号 ,
FT蛋白是分子量为 23KD ,正好小于胞间连丝允许通
过的蛋白分子量限止[7 ] ,意味着 FT蛋白可以在韧皮部
自由通行。最近研究表明 ,FT蛋白是引起开花的非细
胞自主信号[8 ] ,在水稻 FT 同源物 Hd3 a 的研究中也得
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到同样的结论[9 ] 。
基于 FT 在开花诱导信号途径中的重要性 ,我们
采用 PVX 病毒载体 ,将拟南芥 FT 基因功能序列连接
到 PVX序列的第 5 个开放阅读框 (Open Read Frame 5 ,
ORF5)之前 ,也就是位于外壳蛋白编码框架 CP 之前 ,
人工侵染短日照烟草品种 Meryland mommath ,成功诱
导了短日照烟草在长日照条件下开花。
1 　材料与方法
111 　材料
烟草品种为 Maryland mommath ,拟南芥为野生型
品种 WS ,感受态细胞 E. coli GM242 ,PVX 病毒质粒载
体 ,含有马铃薯 X病毒 PVX的全长 cDNA 克隆 ,均为英
国华威大学国际园艺研究中心 Stephen Jackson 博士和
Hong 博士实验室提供 ;限制性内切酶来自 Biolabs 公
司 ; PCR 产物及质粒提纯试剂盒来自 Qiagen 公司 ;
Superscript Ⅱ逆转录酶 (鼠白血病病毒 ,活性最适温度
42 ℃)来自 Invitrogen 公司 ; pf u 酶和体外转录体系材料
购自 Promega 公司 ; TRIZOL 试剂购自 Invitrogen 公司 ;
电转仪采用 BIO2RAD 公司 GENE PULSER。
112 　FT 全长序列提取
拟南芥野生型品种 WS 播种于长日照条件下
(12h) ,于开花前长日照结束时采集叶片 ,用 Trizol 试剂
提取总 RNA ,采取两步法 RT2PCR ,合成全 cDNA ,用
pf u2PCR 法 , 用 引 物 FT21、 FT22 ( FT21 : 5′
TCAAGATCCGGAATGTCTATAAATATAAGAGACCC3′;FT2
2 : 5′ AGGAAGAAGTCGACTAAAGTCTTCTTCCTC
CGCAG3′) , 扩增出全长 FT 基因序列 , 经测序与
GenBank 比对完全符合 ( GeneID :842859) 。
113 　PVX2 FT 构建与转化
将由 pf u 酶扩增出的 FT 序列 ,用 Bspe Ⅰ、Sal Ⅰ双
酶切 ,连接到经过同样双酶切及小牛肠碱性磷酸酶
30min 处理的 PVX 质粒载体上 ,反应体系中分别加入
超纯水 8μl、10 ×T4连接反应缓冲液 3μl、20ngΠμl PVX载
体 3μl、FT DNA 15μl、T4 ligase 1μl ,总体积 30μl。连接反
应在室温下过夜。次日反应产物经酚Π氯法提纯后溶
于 20μl 的超纯水中。PVX2 FT 构建如图 1 :
图 1 　PVX2 FT 构建图
Fig. 1 　The construction map of PVX2 FT
114 　电转化及克隆菌株筛选
采用电击转化法 ,设定电压 115kV ,电阻 200Ω ,电
容 20μf ,把感受态细胞从270 ℃低温冰箱取出后 ,放到
冰上稍升温 ,与 PVX2 FT 混合后 0 ℃冰上放置 1min ,后
移入电转杯小室 ,电击 < 5ms ,然后用 500μl 恢复培养
基 SOB 洗出 ,置于 37 ℃摇床 260rΠmin 条件下培养 1h
后涂于 LB 平板 ,LB 平板加入 50mgΠml 的 Carbencilin
(体积比 1000∶1) 作抗性筛选。后置于 37 ℃温箱里培
养过夜 ,第 2 天用 PCR 法选择重组克隆菌株 ,所用引
物为 FT21、FT22。选择阳性菌株后 ,于 LB + 50mgΠml Carbencilin (体积比 1000∶1) 培养 16 - 18h ,采用 MINIPREP 质粒 DNA 提取试剂盒提取 PVX2 FT 质粒 DNA ,并测序。结果确认后保存质粒。115 　质粒线性化与体外转录确认正确克隆菌株 ,用 Spe Ⅰ进行酶切 ,使质粒线性化 ,经酚Π氯法提纯后 ,测定浓度 ,进行体外转录 ,体外转录体系试剂来自 Promega 公司 ,体外转录体系包括 20μl 的超纯水、5μl 的 10 ×缓冲液 (Biolabs) 、1μl 的40μΠμl 的 RNasin ( Promega) 、5μl 的 10 ×NPT4 (20mmolΠL的 ATP、CTP、UTP ,2mmolΠL 的 GTP) 、5μl 的 5mmolΠL Cap
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(m7Gppp G,Biolabs) 、10μl 的 0125ugΠμl 的线性化质粒
DNA ,总体积 46μl。将上述试剂充分混合后放置于
37 ℃5min ,加入 4μl 的 50UΠμl T7 RNA 聚合酶 (Promega) ,
后放置于 37 ℃25min ,加入 5μl 的 20 mmolΠL 的 GTP ,放
置于 37 ℃35min ,加入 45μl 的 EB 溶液 (10mmolΠL Tris ,
pH815) ,合计体积为 100μl ,然后用酚Π氯法提纯 ,加入
1Π10 体积的 NaAC(pH5. 4)和 2 倍体积的无水乙醇沉淀
RNA ,离心 20min ,清洗干燥后溶于 20μl 的超纯水中获
得 PVX2FT病毒 RNA ,整个过程采用 011 % DEPC 水处
理过的一次性用具。
116 　接种烟草
烟草 Maryland mammoth 是一个短日照品种 ,在日
照长于 12h 时不开花 ,只进行营养生长 ,当日照小于
12h 时转向生殖生长而形成花芽开花结籽。接种的烟
草叶片不能选择生长定形的叶片 ,要选择正在扩大生
长的叶片 ,一般选择新生叶片 ,这时叶片细胞代谢旺
盛 ,人工接种容易成功。本试验选择 3 - 4d 叶龄的烟
草叶片 ,在烟草的 4～5 叶期进行接种。接种采用 600
目的高温灭菌后的石英沙 ,喷在叶片上 ,然后吸取转录
的 PVX2 FT 病毒 RNA 10μl 滴到叶片上 ,用戴橡胶手套
的双手食指 ,一个托着叶片 ,一个在叶面沾着 PVX2 FT
RNA 轻轻磨擦 ,在叶片的两边各轻抚 10 下 ,完成后 ,在
整个植株上喷水雾保湿。每 7d 观测记录 1 次病毒侵
染症状 ,观察新生叶片病毒症状、植株生长状况、节间
长度等情况。
117 　对照与重复设置
试验设置对照 PVX2mFT ,其中突变 FT 的起始密
码子为终止密码子及去除在第起始密码子后第 8 个碱
基 A ,同上步骤克隆得到 PVX2m FT ,与 PVX2 FT 同步体
外转录和体外接种。克隆突变 mFT 序列所用引物为
mFT21、 mFT22 ( mFT21 : 5′ TCAAGATCCGGA
TAGTCTATAAATATAAGAGACCC 3′; mFT22 : 5′AGGAA
GAAGTCGACTAAAGTCTTCTTCCTCCGCAG 3′) 。
118 　样品采集与分析
开花烟草选取接种叶片、中部叶片、顶部叶片、花
为样品 ,样品严格分开采收后液氮保藏 ,用异硫氰酸胍
法 (Trizol 试剂) 提取 015g 烟草叶片总 RNA[10 ] ,进行两
步法 RT2PCR ,分析叶片中 FT 序列。
2 　结果与分析
211 　FT 序列测定结果
根据对测序结果的分析 ,得出 FT 功能序列 ,共
528bp ,全长序列如下 :
212 　重组菌株 PCR 检测结果
重组 PVX2 FT 质粒电转化进入感受态细胞后 ,用
引物 FT21、FT22 进行 PCR 初筛 ,在 115 %琼酯糖电泳
5VΠcm 电压下跑 25min 后检测片断大小 ,选出的重组
克隆菌株 PCR 检测电泳和经 PCR 测序结果如图 2。
213 　接种后烟草生长
接种后 7d 观察发现 ,由于金刚砂的机械损伤接种
后可以看到有枯斑 ,在叶片上也看到明显 PVX 侵染症
状 (图 32A) ,新生叶片上则没有明显侵染症状 ,这可能
是由于 PVX 携带外源片段后其侵染能力有所下降。
从接种后第 3 周 ,可以看到接种 PVX2 FT 的烟草植株
节间伸长 ,在接种 PVX2 FT4 周后的烟草开始开花 ,接 种 45d 后 (图 32B) ,可以看到接种 PVX2 FT 的烟草开花 ,接种 PVX2mFT 和空白对照烟草没有开花 ,在试验期间 ,烟草都生长在长日照条件下 (实测日照长度 >14hΠd) ,在整个烟草生长过程中 ,病毒侵染的症状越来越轻微 ,到开花时 ,原来侵染的症状基本消失 ,新生叶片上看不到侵染的症状。试验重复 3 次 ,所有接种PVX2 FT 的烟草都开花 ,而对照与接种 PVX2mFT 的烟草无一开花。开花后的烟草分别采集 PVX2 FT 与PVX2mFT 叶片样本 ,提取总 RNA ,进行 RT2PCR 产物测序 ,得到的结果如图 32C 所示 ,可以看到在接种 PVX2FT 与 PVX2mFT 的叶片样品上都得到了与设计相同的序列。
76　1 期 PVX介导拟南芥 Flowering locus T诱导烟草开花研究
图 2 　PVX2 FT 和 PVX2m FT 克隆筛选结果
Fig. 2 　Electrophoresis imagine result of PVX2 FT and PVX2mFT screening
A :PCR 检测选择克隆菌株结果 ;B :克隆菌株质粒提取测序结果
A : Electrophoresis imagine of PCR screening for colonies ; B :Sequence analysis result for PVX2 FT and PVX2m FT
图 3 　接种烟草开花及相关序列检测
Fig. 3 　The growing condition of inoculated tobacco and analysis results
A :接种 7d 后烟草生长与侵染症状 ;B :接种 45d 开花烟草与对照 ;C :烟草叶片样品 RT2PCR 产物测序结果
A :The inoculated tobacco growing condition after 7d ;B :Flowering tobacco with mock and control ;
C :Leaves samples from tobacco analyzed by RT2PCR and sequence test
3 　讨论
植物在长期进化过程中一些重要的生物功能如开
花有很强的保守性 ,拟南芥基因组中 FT 基因有 6 个
同缘成员。FT 基因有以下一些特征 :它广泛存在并在
叶片中表达 ,在开花诱导开始后达到表达顶点 ,由长日
照条件诱导及正调控 ,在长日照条件下须由 CO 基因
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参与响应 , CO 基因直接与 FT 基因作用[4 ] ,在水稻等
植物中都找到了 FT 的同源基因[11 ] ,Bohlenius 等[12 ] 发
现拟南芥中 COΠFT 基因组合可调控毛果杨 ( Populus
trichocarpa)秋天停止生长 ,转入基因 FT 的毛果杨在培
养皿中培养 4 周后就可以长出柔荑花絮 ,而野生毛果
杨要开花起码要经过 8 - 20 年 ,表明 CO/ FT 基因组合
在数百万年的单独进化中其生物功能非常保守。
PVX2FT 诱导烟草开花试验也证实了拟南芥 FT 基因
诱导开花生物功能的保守 ,也是首次采用病毒载体携
带 FT 基因诱导烟草开花的成功试验。完全有理由推
测 FT 基因也可以诱导其他植物开花。
试验表明 PVX2 FT 可以诱导烟草开花 ,而 PVX2
mFT 却没有同样的效果 ,也说明在诱导开花过程中 FT
蛋白起到非常重要的作用 ,表明 FT蛋白是诱导开花的
主要物质 ,可能就是我们找寻的“开花素”之一。2005
年 Huang 等[13 ] 的研究结果表明 , FT 的 mRNA 有可能
是诱导开花的主要物质 ,这一结论激起了人们对 FT
基因的研究热情 ,最近发表的研究结果给予 FT蛋白诱
导开花更多的支持 ,其一是关于 FT蛋白能够充当非细
胞自主信号来诱导拟南芥开花[8 ] ,另一是在水稻中 FT
的同源基因 Hd3 a 也有同样的功能[9 ] ; PVX2mFT 侵染
烟草后 ,也可以在烟草细胞内复制出 mFT 的 RNA ,但
仅此 RNA 不能诱导烟草的开花 ,只有完全功能的 FT
mRNA 由 PVX2 FT 侵染复制出来后 ,能翻译成 FT 蛋
白 ,才能诱导烟草的开花 ,所以本研究也认为 FT 蛋白
就是诱导开花的主要物质。但是对 FT mRNA 功能还
要进一步的研究才能了解开花诱导复杂网络中的具体
作用机理。
当植物受到病原物侵染后 ,可以表现出抗性 ,试验
中我们也发现 PVX2 FT 侵染烟草后在开始 1 - 2 周时
间内可以看到烟草叶片有明显的侵染症状 ,但是在随
后的生长中这种侵染症状慢慢消失 ,最后变的很不明
显 ,肉眼在新生叶片上看不到侵染的症状。一方面可
能是由于携带外源基因的 PVX侵染致病力有所下降 ,
另一方面也是烟草对 PVX 产生抗性的表现。病毒侵
染症状的消失也对 PVX 携带外源基因在烟草中的表
达产生影响 ,对 PVX2 FT 而言就有可能降低了 FT 转录
本的量 ,但是这一点并没有影响烟草的开花 ,植物在花
芽发育启动后就很难发生逆转 ,所以在 PVX2 FT 侵染
烟草后开始形成的 FT蛋白量就足以使烟草启动花芽
分化开花 ,这也是 PVX 做 FT 载体诱导烟草开花的一
个很好的试验 ,它能很好地保持在致病力与研究外源
基因生物功能之间 ,这对研究其他功能基因提供了经
验。
致谢 :本研究得到了英国华威大学国际园艺研究中心
Yiguo Hong 博士的大力支持 ,在此表示感谢。
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