全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 032429206
拟南芥 Nodulin MtN21 家族 At1 g0938
基因功能的初步研究
孙书琦　张锐　郭三堆
(中国农业科学院生物技术研究所 ,北京　100081)
摘 　要 :拟南芥 Nodulin MtN21 蛋白家族含有 1～2 个 DUF6 结构域 ,具有内在膜蛋白的特性。推测该家族
基因在小分子跨膜运输、信号转导和抗逆性等方面发挥作用。At1 g09380 是拟南芥 Nodulin MtN21 基因
家族成员。本研究通过 PCR 筛选获得 At1 g09380 对应的 T2DNA 插入纯合子 ,并经 RT2PCR 鉴定该突变
体为无效突变体。对突变体萌发和萌发后阶段进行盐胁迫和干旱胁迫分析 ,结果表明 ,At1 g09380 突变
体萌发后对 NaCl 和干旱胁迫敏感 ,证明该基因参与拟南芥的盐和干旱胁迫响应过程。同时还发现在长
日照条件下突变体植株比野生型植株早开花 7d 左右。本文研究结果为进一步分析该基因的生物学功
能打下基础。
关键词 : At1 g09380 ;Nodulin MtN21 ;NaCl 胁迫 ;干旱胁迫
PRIMARY ANALYSIS OF THE FUNCTION OF Nodulin MtN21 GENE At1 g09380 IN Arabidopsis thaliana
SUN Shu2qi 　ZHANG Rui 　GUO San2dui
( Biotechnology Research Institute , The Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 　100081)
Abstract :Nodulin MtN21 protein family contains one to two DUF6 domain signature characteristics of integral membrane
proteins. The protein family is predicted to play very important roles in transport of micromolecule transmembrane , signal
transduction and stress2resistance. At1 g09380 is a member of Nodulin MtN21 gene family. One homozygous T2DNA mutant
was identified by PCR and RT2PCR as null mutant . The phenotype of the mutants which were observed at the stages of
germination and postgermination showed that At1 g09380 mutants were sensitive to NaCl and drought suggested that the gene
might participate in salt and drought stress2resistance process in Arobidopsis . Meanwhile we found that the mutants were 7 days
earlier than wild type in flowering time. The results are the bases of the biology function of At1 g09380 for the further research.
Key words : At1 g09380 ;Nodulin MtN21 ;NaCl stress ;drought stress
收稿日期 :2009203205 　接受日期 :2009204205
基金项目 :转基因生物新品种培育科技重大专项重大项目 (2008zx080052004)
作者简介 :孙书琦 (19832) ,女 ,黑龙江哈尔滨人 ,硕士研究生 ,研究生方向为植物基因工程。TeL :010282106129 ; E2mail :sharon
-
ssq @1261com
通讯作者 :郭三堆 (19502) ,男 ,山西晋城人 ,研究员 ,博士生导师 ,研究方向为植物基因工程。TeL :010282106140 ; E2mail :gsdui @mail . caas. net . cn　　结瘤素 ( nodulin)基因是一类在结瘤植物根瘤形成过程中表达的基因 ,参与调控根瘤的生长、发育和形成[1 ,2 ] 。根据表达时期的不同 ,通常将结瘤素基因分为早期结瘤素基因和晚期结瘤素基因 ,早期结瘤素基因在固氮起始之前表达 ,而晚期结瘤素基因主要在成熟的固氮根瘤中表达[3 ] 。很多已被鉴定的结瘤素基因推测参与信号转导和渗透胁迫的响应过程 ,如从豌豆、野豌豆和蚕豆的皮层 细胞中鉴定出的 ENOD5 ,属于早期结瘤素基因 ,因该基因编码的蛋白具有阿拉伯半乳聚糖蛋白的特征和推测的糖基磷脂酰肌醇 ( GPI)2膜锚定位点 ,故推测其具有细胞与细胞之间信号传导、细胞分化、组织发生和信号转导途径的功能[4 ] 。很多试验证明大豆的 Nodulin26 蛋白具有水通道蛋白活性和对甲酰胺、甘油及氨水的渗透性[5～9 ] 。另外 Nodulin 26 使根瘤对渗透胁迫信号具有敏感性 , Guenther 等[10 ] 将结瘤的大豆置于
924　核 农 学 报　2009 ,23 (3) :429～434Journal of Nuclear Agricultural Sciences
013molΠL NaCl 条件下 ,Nodulin 26 的磷酸化水平在处理
4h 后增加 ,表明该蛋白另一个潜在的功能可能是对外
界盐分和干旱胁迫的响应。
结瘤素基因最初因在豆科植物根瘤中的特异性表
达而得名 ,后来人们从非结瘤植物如水稻和拟南芥中
也分离鉴定出了许多与结瘤素基因同源的基因[11 ] 。
拟南芥 Nodulin MtN21 基因家族就是从非结瘤植物中
鉴定出的结瘤素基因 ,该基因家族与蒺藜苜蓿 MtN21
基因同源 ,故命名为 Nodulin MtN21 家族基因。MtN21
是 Gamas 等[3 ]通过差减杂交的方法在蒺藜苜蓿根瘤发
育过程中鉴定出的新基因 ,在整个根瘤发育过程中均
能被检出 , 但在成熟根瘤中其表达量最高且与
Mtenod2 在表达动力学上相似 ,推测其参与根瘤的生
长发育。拟南芥 Nodulin MtN21 基因家族在拟南芥基
因组中发现了 38 个成员 ,各成员基因功能的分离或特
异性表达可能与该基因家族的生理学意义相关联 ,但
该基因家族准确的生物学功能仍然未知[12 ] 。
拟南芥 Nodulin MtN21 基因家族蛋白推测具有一
个 N2末端信号序列并且包含 1～2 个 DUF6 结构域 ,该
结构域最初在菊欧文菌的 PecM 蛋白中被发现 , PecM
蛋白参与果胶酶 ,纤维素酶和蓝色素的调控。除此之
外 ,该结构域也在其他蛋白中存在 ,如羧化物Π氨基酸Π
胺转运体和磷酸盐Π磷酸烯醇丙酮酸转位子[11 ] 。含有
该结构域的很多蛋白的功能仍然未知 ,但推测具有内
在膜蛋白的特性。
拟南芥 At1 g09380 基因是 Nodulin MtN21 家族基
因之一 ,编码一个由 385 个氨基酸组成的蛋白。通过
分析其蛋白结构可知 ( http :ΠΠsmart . embl2heidelberg. deΠ
smartΠjob
-
status) (图 1) ,该蛋白 1～20 氨基酸为信号
肽 ,81～103 ,108～130 ,147～169 氨基酸为跨膜区 ,206
～335 氨基酸为 DUF6 结构域 ,该结构域是拟南芥
Nodulin MtN21 家族蛋白所共有的结构域。本文拟在
DNA 水平和转录水平筛选、鉴定出 At1 g09380 基因的
T2DNA 插入失活的纯合子 ,并对纯合子材料的耐盐性
和耐旱性进行观察 ,为进一步分析该基因的生物学功
能打下基础。
图 1 　At1 g09380 基因蛋白的 SMART蛋白结构分析
Fig. 1 　SMART protein structure analysis of At1 g09380
1 　材料与方法
111 　材料
11111 　植物材料 　拟南芥野生型为哥伦比亚生态型
由本 实 验 室 保 藏 ; 拟 南 芥 Nodulin MtN21 家 族
At1 g09380 基因对应的 T2DNA 插入失活的突变体种子
salk
-
140423 ,从 SALK公司购买。
11112 　工具酶和化学试剂 　EASY spin 植物 RNA 快
速提取试剂盒为盖宁生物技术 (北京) 有限公司产品 ;
ReverTra Ace2α2反转录酶试剂盒为东洋纺 (上海) 生物
科技有限公司产品 ;PCR 相关试剂均为 TIANGEN 公司
产品 ;DNA 提取缓冲液所用化学药品为国产分析纯 ,
配方为 200mmolΠL Tris2Cl (pH 715) , 250mmolΠL NaCl ,
25mmolΠL EDTA(pH 810) ,015 %SDS。
112 　方法
11211 　植物材料的生长条件　温室栽培 :拟南芥种子 播种在营养土∶蛭石 = 3∶1 的土壤中 ,在温度 22 ℃,相对湿度 30 %～60 % ,光周期 16hΠ8h ,光强 4000lx 的温室中培养。培养基上培养 :拟南芥种子播种在含 1 %琼脂和 l %蔗糖的 1Π2MS 培养基中 ,在温度 22 ℃,光周期16hΠ8h ,光强 4000lx ,相对湿度 60 %的光照培养箱中培养。11212 　突变体 DNA 的提取　提取人工土壤 (营养土∶蛭石 = 3 :1) 中培养 28d 左右的 salk - 140423 拟南芥叶片 DNA。提取方法[13 ] :取 1～2 片小叶放入 EP 管中 ,加入 400μl 提取缓冲液研磨 ; 4 ℃, 12000rpm 离心10min ;将上清液转移至新的 EP 管中加入等体积的异丙醇 , - 20 ℃放置 30min ;4 ℃,12000rpm 离心 10min ;倒掉上清 ,沉淀用 70 %乙醇洗涤 2 次 ;将 DNA 吹干 ,加入40μl 无菌水 ,37 ℃溶解 DNA。11213 　DNA 的 PCR 鉴定 　采用“双引物法”( http :ΠΠsignal. salk. eduΠtdnaprimers. html) 进行 T2DNA 插入突变体 的 鉴 定。基 因 5 ’端 特 异 引 物 LP : 5 ’2
034 核　农　学　报 23 卷
ATACACGGTTTCTTGTGCAGG23’,基因 3’端特异引物
RP :5’2AACATACGTGCCGGTGTAGAG23’,在 T2DNA 片
段左边界设计的引物 LBα1 :5’2TGGTTCACGTAGTGGG2
CCATCG23’。反应在 Eppendorf PCR 扩增仪上进行。
20μl 反应体系含 110μl LP 引物 (10μmolΠL)或LBα1 引物
(10μmolΠL) ,110μl RP 引物 (10μmolΠL) ,210μl 10 ×Buffer ,
116μl dNTP (215mmolΠL) ,015μl Taq 酶 (215UΠμl ) ,310μl
植物基因组 DNA(15ngΠμl) ,其余用 ddH2O 补足。反应条
件为 94 ℃预变性 5min ;94 ℃变性 30 S ,58 ℃退火 30S ,
72 ℃延伸 1min ,35 个循环 ,72 ℃延伸 5min ,两组反应体系
在相同的条件下扩增 ,琼脂糖凝胶电泳检测。
11214 　RNA 的提取 　按照盖宁 EASY spin 植物 RNA
快速提取试剂盒说明书进行操作 ,提取同批生长 28d
左右已经鉴定的 T2DNA 插入纯合子与野生型植株的
RNA。
11215 　反转录　按照东洋纺 ReverTra Ace2α2反转录酶
试剂盒操作 ,反转录 RNA 2μg。
11216 　PCR 检测　At1 g09380 基因正向引物 FW1 :5’2
AGAGAACCATGGCTCCGATCAC23’,反向引物 RV1 : 5’2
CTCCTCGCCGCAATATTCAGAC23’;看家基因 Actin2 正
向引物 FW2 : 5’2TGTTTGAGACCTTTAACTCTCCCG23’,
反向引物 RV2 :5’2ACCAGAATCCAGCACAA TACCG23’。
20μl 反应体系含 FW1 引物 (10μmolΠL) 和 RV1 引物
(10μmolΠL)各 110μl 或 FW2 引物 (10μmolΠL) 和 RV2 引
物 (10μmolΠL) 各 110μl , 210μl 10 ×Buffer , 116μl dNTP
(215mmolΠL ) , 015μl Taq 酶 ( 215UΠμl ) , 1μl 反转录的
cNDA ,其余用 ddH2O 补足。反应条件为 94 ℃预变性
5min ;94 ℃变性 30s ,58 ℃退火 30s ,72 延伸 30s ,30 个循
环 ,72 ℃延伸 5min ,琼脂糖凝胶电泳检测。
11216 　盐平板突变体萌发观察 　已鉴定的突变体及
同批野生型种子 ,表面消毒后 ,分别种于含有 0、50、100
和 200mmolΠL NaCl 的 1Π2MS 培养基中 ,每处理各 60
粒。4 ℃春化 2～3d 后移至 22 ℃光照培养箱中 ,次日开
始统计不同平板中种子的萌发率。
11217 　盐平板突变体萌发后长势观察　已鉴定的突
变体及同批野生型种子 ,表面消毒后 ,种于 1Π2MS 平
板 ,4 ℃春化 2～3d 后移至 22 ℃光照培养箱中 ,待萌发
后将植株转移到含有 200mmolΠL NaCl 的 1Π2MS 中 ,置
于 22 ℃光照培养箱中继续培养 ,每天观察幼苗生长情
况 ,统计存活率。
11218 　突变体抗旱性观察 　已鉴定的突变体及同批
野生型种子 ,表面消毒后 ,种于 1Π2MS 平板中 ,4 ℃春化
2～3d 后移至 22 ℃光照培养箱中 ,7d 左右移至人工土
壤 (营养土∶蛭石 = 3∶1) ,每隔 3～5d 浇水 ,让土壤保
持湿润 ,21d 左右浇水至饱和后停止 ,进行干旱处理 ,
21d 后复水 ,统计存活率。
2 　结果与分析
211 　DNA水平筛选鉴定突变体
At1 g09380 基因全长 3415bp ,含有 7 个外显子和 6 个
内含子 ,图 2 为 salk
-
140423 T2DNA 插入位置的示意图。
图 2 　At1 g09380 基因图解及 T2DNA 插入位置
Fig. 2 　structure of At1 g09380 and insert position of T2DNA
T2DNA 表示突变体 salk
-
140423 T2DNA 插入位置 ;条形图表示 At1 g09380 基因全长 ;方块表示外显子
T2DNA represents position of salk
-
140423 inserted T2DNA ;line represents full length of At1 g09380 ;boxes represent exon
　　野生型植株 (WT) 目的基因的两条染色体上均未
发生 T2DNA 插入 ,所以其 PCR 产物只有 1 种 ,如图 32B
中第 1 和第 2 泳道所示 ,分子量约 112kb , (即从 LP 到
RP 为 1133bp ,如图 32A) ; T2DNA 插入纯合子目的基因
的两条染色体上均发生 T2DNA 插入 ,而 T2DNA 本身的 长度约为 17 kb ,过长的模板会阻抑目的基因特异扩增产物的形成 ,所以也只能得到 1 种以 LBα1 与 RP (或LP)为引物进行扩增的产物 ,如图 32B 中第 5 和第 6 泳道所示 ,分子量约 1kb (即从LP 或 RP 到 T2DNA 插入位点的片段 ,长度为 713bp ,再加上从 LB 到 T2DNA 载体
134　3 期 拟南芥 Nodulin MtN21 家族 At1 g0938 基因功能的初步研究
左边界的片段 ,长度为 110 - 410bp) ; T2DNA 插入杂合
子只在目的基因的一条染色体上发生了 T2DNA 插入 , 所以 PCR 扩增后可同时得到 112kb 和 1kb 两种产物 ,如图 3 - B 中第 3 和第 4 泳道所示。
图 3 　突变体 DNA 水平检测
Fig. 3 　PCR identification of mutants DNA level
A :突变体引物设计示意图 ,RP ,LP , LBα1 分别表示 RP ,LP , LBα1 引物 ;数字代表引物在基因上的位点。
B :电泳检测 ,M:DNA Lader ;1 ,3 ,5 :LP 和 RP 引物扩增产物 ;2 ,4 ,6 :RP 和LBα1 引物扩增产物
A :Diagram of primers designed of mutant ,RP ,LP , LBα1 represents RP ,LP , LBα1 primer ,respectively ;numbers represtnt the position of primers on gene.
B : Identification of electrophoresis , M:DNA Lader ;1 ,3 ,5 :products of LP and RP primer ;2 ,4 ,6 :products of RP and LBα1 primer
212 　RNA水平鉴定突变体
提取突变体植株 RNA 作为模板 ,以 Atlg09380 基
因特异引物进行 RT2PCR ,电泳结果未检测到扩增产物
(图 4) ,说明 T2DNA 插入导致该基因不能转录 ,因此判
断该突变类型为无效突变。
图 4 　已筛选的纯合体 F1 代 RNA 水平检测
Fig. 4 　Identification of homozygous
mutants on RNA level
WT:野生型 ;S1～S6 :已鉴定纯合体 F1 代的 6 个植株 ;n. t :阴性对照
WT:wild type ;S1～S6 :6 homozygous mutant lines ;n. t :no template
213 　耐盐性分析
21311 　盐平板突变体萌发观察 　种子春化后移至
22 ℃光照培养箱中 ,以种皮破裂视为萌发。经χ2 检
验 ,不同盐浓度 1Π2MS 平板上突变体和野生型植株的
萌发率无显著差异 ( P > 0105) 。但与未加 NaCl 的处理
相比 ,盐胁迫使野生型和突变体的启动萌发时间均延
迟 ,且随着盐浓度的增加 ,延迟时间增加 ,当 NaCl 的浓
度达到 200mmolΠL 时 ,光照 3d 才开始萌发 ,而未加
NaCl 的处理 ,光照 1d 就开始萌发 (表 1) 。
21312 　盐平板突变体萌发后长势观察　将同批突变
体和野生型种子播种于 1Π2MS 培养基中 ,春化后移至
22 ℃光照培养箱 ,4d 后转移到含有不同浓度 NaCl 的
1Π2MS平板上发现 ,转移到含 200mmolΠL NaCl 的 1Π2MS
培养基上培养 6d ,野生型植株长势明显优于突变体 ,
随后野生型和突变体植株均开始变黄死亡 ,至第 11 天
野生型的存活率为 66167 % ,而突变体的存活率仅为
27145 %(图 5 ,表 2) ,可见突变体在萌发后对NaCl 敏感
性强于野生型。
215 　突变体开花时间的观察
突变体和野生型在温室培养过程中发现在长日照
条件下突变体植株抽薹和开花时间均比野生型早 7d
左右 ,如图 6 所示。结瘤素基因在花发育通路中起作
用的功能尚未见报道 , 通过观察推测拟南芥的
At1 g09380 基因可能在花发育的信号转导中起
作用。　　
214 　耐旱性分析
据观察统计 ,干旱处理 21d ,复水 7d 后 ,突变体植
株有 62179 %莲座叶萎蔫严重不能正常生长 ,而野生
型植株有 9130 %莲座叶萎蔫严重 ,干旱胁迫下突变体
234 核　农　学　报 23 卷
　　　　 表 1 　不同 NaCl 浓度下突变体及野生型的萌发情况
Table 1 　Germination of mutants and wild type in different concentration of NaCl ( %)
时间
time (d)
1Π2MS + 0mmolΠL NaCl 1Π2MS + 50mmolΠL NaCl 1Π2MS + 100mmolΠL NaCl 1Π2MS + 200mmolΠL NaCl
WT salk WT salk WT salk WT salk
1 14129 27127 0100 7140 0100 0100 0100 0100
2 92145 100100 92159 96129 87123 96130 0100 0100
3 96123 100100 100100 100100 100100 100100 43113 41151
4 100100 100100 100100 100100 100100 100100 78143 86127
5 100100 100100 100100 100100 100100 100100 90120 88124
6 100100 100100 100100 100100 100100 100100 100100 100100
图 5 　突变体种子萌发后 200mmolΠL NaCl 处理的存活率
Fig. 5 　Survival of postgermination seeds of
mutants in 200mmolΠL NaCl
表 2 　200mmolΠL NaCl 处理突变体萌发后植株的存活率
Table 2 　Survival of postgermination mutants
in NaCl of 200mmolΠL ( %)
时间
time (d)
存活率 survival
WT salk
6 100100 100100
7 100100 84131
8 96108 68163
9 86127 58182
10 78143 33133
11 66167 27145
和野生型植株的死亡率及标准差结果通过三个独立的
试验计算 ( n = 43) ,结果如图 7 和图 8 所示 ,由此可见
突变体植株对干旱比野生型植株更敏感。
3 　讨论
植物体的生长和产量受其所在的环境压力的影
图 6 　突变体的早花表型
Fig. 6 　Early flowering phenotype of mutants
图 7 　干旱胁迫下突变体及野生型植株的死亡率
Fig. 7 　Death rate of mutants and wild type
in drought stress
响 ,因此植物细胞具有一套精细且敏感的防御系统 ,能
够迅速响应并传递合适的信号以适应包括干旱和高盐
胁迫在内的不同环境胁迫[14 ] 。磷酸化是原核和真核
细胞中细胞内信号转导的主要机制。啤酒酵母暴露在
高渗透环境下导致迅速的磷酸化和 MAPK激酶 Hog1
的激活[15 ] 。有研究表明将结瘤的大豆置于013molΠL
NaCl 条件下 ,Nodulin 26 的磷酸化水平在处理 4h 后增
加 ,据推测可能是该结瘤素磷酸化的生理作用增加了
334　3 期 拟南芥 Nodulin MtN21 家族 At1 g0938 基因功能的初步研究
图 8 　突变体植株干旱敏感表型
Fig. 8 　Drought sensitive phenotype of mutant
细胞膜的水渗透性 ,以稀释胞液或使溶质流出以响应
渗透条件的改变[10 ] 。盐胁迫和干旱胁迫都属于渗透
胁迫 ,渗透胁迫导致形态学和生物化学的改变 ,这些改
变诱导包括胁迫适应基因在内的基因表达[16 ] 。本文
的研究结果显示 At1 g09380 基因突变体在萌发后对
NaCl 的耐受能力明显低于野生型 ,表明该基因的无效
突变体对盐更敏感 ,并且从干旱处理的结果也可以看
出 ,突变体与野生型相比对干旱更敏感 ,因此推测该基
因可能参与植物体的盐胁迫和干旱胁迫过程。
通过观察 At1 g09380 基因突变体的生长发育过
程 ,发现在长日照条件下突变体开花时间比野生型早。
由 At4 g31840 , At5 g25090 , At2 g23990 和 At4 g30590
基因编码的 ENOD2like 蛋白的启动子的 GUS 定位表明
这些基因在雌配子或雌配子中表达[17 ] ,推测拟南芥
ENOD 基因具有配子体发生的功能。但结瘤素基因参
与植物开花时间的调控尚未见报道。近年来生物学家
利用模式植物拟南芥做了大量的遗传研究 ,发现许多
基因参与调控植物的开花时间 ,并且确定至少存在 4
条调控植物开花时间的信号途径 :即光周期途径、春化
途径、自主途径和赤霉素途径。At1 g09380 基因是否
参与到上述途径有待进一步研究。
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