全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 032391204
转基因高粱 Cry1Ab 蛋白含量的比较研究
张明洲1 　陈宗伦1 　方美明1 　崔海瑞2 　夏英武2
(11 中国计量学院生命科学学院 ,浙江 杭州　310018 ; 21 浙江大学原子核农业科学研究所 ,浙江 杭州　310029)
摘　要 :通过农杆菌介导法将杀虫晶体蛋白基因 cry1Ab 导入高粱恢复系 115 中 ,共获得 13 个独立的转
基因株系 ,26 株转基因植株 ,转化率为 511 % ; GUS 活性、PCR、Southern 和 Western 杂交分析表明 ,此基因
已整合进高粱基因组并得到正确表达。利用 ELISA 试剂盒测定 Cry1Ab 蛋白含量 ,结果表明 ,不同转基
因植株的 Cry1Ab 蛋白含量有明显差异 ,最高可达 01850μgΠg ,占可溶性蛋白的 01016 % ,还有一些转基因
植株中不能表达 ;同一转基因植株的不同组织中表达量有明显差异 ,其顺序为 :叶 > 颖壳 > 籽粒 > 根 >
茎 ;不同部位的叶片也有差异 ,其顺序为 :中部叶 > 基部叶 > 新叶。
关键词 :转基因高粱 ;Cry1Ab 蛋白 ; cry1Ab 基因 ;农杆菌
COMPARISON ON Cry1Ab PROTEIN CONTENT IN TRANSGENIC SORGHUM
ZHANG Ming2zhou1 　CHEN Zong2lun1 　FANG Mei2ming1 　CUI Hai2rui2 　XIA Ying2wu2
(1. College of Life Science , China Jiliang University , Hangzhou , Zhejiang 　310018 ;
2. Institute of Nuclear Agricultural Sciences , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang 　310029)
Abstract :The insecticidal Bacillus thuringiensis (Bt) cry1Ab gene was introduced into sorghum restoring line 115 efficiently
mediated by Agrobacterium tumef aciens . A total of 13 independent transgenic plant lines and 26 transgenic plants were
regenerated with the average transformation efficiency of 511 %. The results of GUS expression , PCR analysis , Southern and
Western hybridization showed that the cry1Ab gene had been integrated and expressed exactly in sorghum. The expression
level of cry1Ab gene was detected in transgenic sorghum plants by using ELISA kits. There were obvious differences in
Cry1Ab protein content with the different transgenic plants , and the highest content was 01850μgΠg , which accounted for
01016 % of the total soluble protein , while no Cry1Ab protein was detected in some transgenic plants. There were also obvious
differences in Cry1Ab protein content in the different organs of the same transgenic plants , following the order of leaf > glumes
> seed > root > stem. The Cry1Ab protein content in middle leaf was higher than that in base and top leaf .
Key words :transgenic sorghum ; Cry1Ab protein ; cry1Ab gene ; Agrobacterium tumef aciens
收稿日期 :2008210205 　接受日期 :2009202217
基金项目 :国家自然科学基金 (30270273) ,浙江省自然科学基金 ( Y304463)
作者简介 :张明洲 (19702) ,男 ,浙江温州人 ,博士 ,副教授 ,从事植物生物技术研究。Tel : 0571286914476 ; E2mail : zmzcjlu @cjlu. edu. cn
通讯作者 :崔海瑞 (19632) ,男 ,安徽蚌埠人 ,博士 ,研究员 ,从事诱变育种与遗传改良研究。Tel : 0571286971405 ; E2mail : hrcui @zju. edu. cn　　自 Schnepf 等首次成功克隆 Bt 基因以来 ,其潜在的应用价值已引起世界各国极大关注 ,农作物 Bt 转基因技术研究已取得巨大进展[1～3 ] 。高粱是全球仅次于小麦、水稻、玉米、大豆和马铃薯等的重要作物之一 ,虫害尤其是螟虫一直是制约其高产、稳产的重要因素之一 ,但目前高粱中抗螟虫资源贫乏 ,难以通过常规育种培育出抗螟虫的品种[3 ,4 ] 。Bt 基因与转基因技术的 发展为改良高粱品种提供了一条新途径。Bt 基因能否正确表达及表达水平高低决定着转基因植物对靶标害虫的抗性程度 ,这直接关系到受体植物遗传转化成功与否及其应用价值。本研究通过农杆菌介导法 ,将密码子优化的杀虫晶体蛋白基因 cry1Ab 导入高粱恢复系 115 中 ,获得了一批转基因植株 ;通过 Cry1Ab 蛋白含量的 ELISA 检测 ,比较了 cry1Ab 基因在不同转基
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因高粱植株、同一转基因植株的不同组织和不同部位
的叶片等中的表达特性 ,以期为进一步合理有效应用
这一资源奠定基础。
1 　材料与方法
111 　材料
试材为恢复系 115 ,由辽宁省农业科学院提供 ,取
其幼穗诱导并筛选其胚性愈伤组织作为转化受体。所
用农杆菌菌株为 EHA105 ,内含 p KUB 质粒 ,其 T2DNA
区携带 CaMV35S 引导的 npt Ⅱ、hph、gus 基因及
Ubquitin 引导的 cry1Ab 基因[5 ] 。
112 　方法
11211 　遗传转化 　预培养生长良好的胚性愈伤组织
于 OD600 = 017 的农杆菌悬浮液中侵染 ,用无菌滤纸吸
干后 ,于共培养基 SA2C上 25 ℃避光培养 3d ;后转入选
择培养基 SA2S 上筛选。筛选获得的抗性愈伤组织于
选择培养基 SA2S 上 25 ℃、16h 光照Π8h 黑暗条件下培
养 1 周 ,转入分化培养基 SA2R 上 25 ℃、16h 光照Π8h 黑
暗再生、生根、壮苗后 ,转移到蛭石炼苗 1～2 周 ,移栽
大田生长至结实。使用的培养基见文献[6 ] 。
11212 　GUS 组织化学染色法 　按照 Rueb 等所述方法
进行[7 ] 。
113 　分析
11311 　PCR 检测与 Southern 杂交分析　取未转化的对
照植株与抗性植株叶片 , CTAB 法微量提取高粱总
DNA。用 cry1Ab 基 因 特 异 引 物 Fcry1Ab : 5′2
GCAACCATCAATAGCC GTTACA 23′, Rcry1Ab : 5′2
GTCAATGGGATTTGGGTGATTT 23′扩增 ,目标片段大小
为 872bp ;扩增程序为 94 ℃4min ,94 ℃30s ,62 ℃ 60s ,
72 ℃80s ,30 个循环 ,72 ℃7min。高粱总基因组 DNA ,
用 Hind Ⅲ限制性内切酶酶切完全后 ,以 32 P标记的
cry1Ab 基因为探针进行 Southern 杂交分析。
11312 　Western 杂交分析 　蛋白质提取与 Western 杂
交分析按吴刚等所述方法进行[8 ] 。
11313 　Cry1Ab 蛋白含量的测定　取对照与转化再生植
株不同部位的叶片、叶鞘、颖壳、籽粒、根和茎髓 ,按
Cry1AbΠCry1Ac ELISA 试剂盒 (美国 ENVIROLOGIX 公司
生产)提供的方法 ,提取和测定 Cry1Ab 蛋白含量。总可
溶性蛋白测定参照Bradford 的考马斯亮蓝 G2250 法[9 ] 。
Cry1Ab 含量 = Cry1Ab 蛋白测定值Π叶片组织鲜
重 ;总可溶性蛋白含量 = 总可溶性蛋白测定值Π叶片组
织鲜重 ; Cry1Ab 相对含量 = [ Cry1Ab 含量Π(1000 ×总
可溶性蛋白含量) ] ×100 %。
2 　结果与分析
211 　转基因植株的获得及 GUS 活性与 PCR 分析
部分农杆菌共培养后的愈伤组织 GUS 组织化学
分析 , gus 基因瞬时表达率可达 6419 %。筛选后共获
得 97 块抗性愈伤组织 ,经再生、生根、壮苗 ,转移到蛭
石过渡培养后移栽大田 ,最终获得 13 个独立的转基因
细胞系 ,38 株抗性植株。抗性植株叶片 GUS 活性的组
织化学染色分析表明 ,有 32 株再生植株存在 gus 基因
的表达 ,而另外 6 株未发现有蓝色反应。PCR 检测结
果显示 ,有 26 株抗性植株能扩增出 872bp 的特异片
段 ,其中 20 株为 GUS 阳性植株 ,6 株为 GUS 阴性植株 ,
推测处于同一 T2DNA 上的外源基因 gus 和 cry1Ab 基
因在某些转基因植株中可能发生不完全整合、重排或
gus 基因沉默等现象 (图 1) 。
图 1 　转基因植株 cry1Ab 的 PCR 分析
Fig. 1 　PCR analysis of cry1Ab gene
in different transgenic plants
M:分子量标准 ;P :阳性对照2质粒 p KUB ;
N :阴性对照 ;1～5 :转基因植株
M:Marker ;P :positive control2 p KUB plasmid DNA ;
N :negative control (non2transgenic plant) ;1～5 :transgenic plants
212 　转基因植株的 Southern blot 分析
PCR 阳性植株基因组 DNA 经 Hind Ⅲ酶切后 ,由
于 Unbiqutin 启动子、cry1Ab 基因与 Tnos 终止子的
411kb 左右片段插入在载体 p KUB 的 Hind Ⅲ酶切位点
上[5 ] ,用含 cry1Ab 基因的探针杂交后可显示特异的
411kb 阳性条带 ,而未转化的对照植株无杂交信号 ,表
明 cry1Ab 基因已整合到高粱基因组 DNA 中 (图 2) 。
图 2 　转基因高粱植株的 Southern 杂交分析
Fig. 2 　Southern blot of cry1Ab gene
in transgenic sorghum plants
M:分子量标准 ; N :阴性对照—未转化的高粱 115 ;
P :阳性对照—质粒 p KUB ;1～7 :转基因植株
M:Marker ;N :non2transgenic control plant 115 ;P :positive
control2 p KUB plasmid DNA ; 1～7 :transgenic plants
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213 　Western 杂交分析
提取的蛋白质经 10 % SDS2PAGE 电泳分离 ,
Western 杂交后 ,结果显示 ,转基因植株 ( SR18、19、20、
22、25、26)叶片蛋白提取物在 68kDa 处产生与预期的
标准 Cry1Ab 蛋白大小一致的杂交条带 ,而未转化的高
粱恢复系 115 叶片蛋白提取物未出现特异杂交条带 ,
表明 cry1Ab 基因已在转基因高粱植株叶片中正确表
达 (图 3) 。
图 3 　转基因高粱植株 Cry1Ab 蛋白的 Western 杂交分析
Fig. 3 　Western analysis of Cry1Ab protein
in transgenic sorghum plants
M:蛋白分子量标准 ; 1～6 :转基因植株 ;N :阴性
对照—未转化的高粱 115 ;Cry1Ab :Cry1Ab 标准蛋白
M:Protein Marker ;126 :transgenic plants ;N :non2transgenic
control plant 115 ;Cry1Ab :Cry1Ab standard protein
214 　不同转基因植株叶片中的 Cry1Ab 蛋白含量
ELISA 方法检测生长良好的 PCR 阳性转基因植株
倒 2 叶中 Cry1Ab 蛋白含量 ,结果显示 ,26 株转基因植
株中 ,有 10 株可检测到 Cry1Ab 蛋白 ,但含量差异很
大 , 最高的为 SR25 , 可达 01850μgΠg , 最低的仅为
01015μgΠg ;而其余均未检测到 Cry1Ab 蛋白 ;同时比较
分析了不同转基因植株 Cry1Ab 蛋白占总可溶性蛋白
的相对含量 ,基本与绝对含量一致 ,最高的为 SR25 ,达
01016 %(表 1) 。Bt 基因表达水平高低决定着转基因
植物对靶标害虫的抗性程度 ,Brietler 等报道 Cry1Ab 蛋
白占总可溶性蛋白 012 %以上的转基因水稻植株可使
二化螟致死率达到 100 %[10 ] 。本研究获得的转基因高
粱植株 Cry1Ab 蛋白含量与上述报道比较较低 ,在离体
抗虫性生物测定中只有部分转基因植株表现出一定的
抗性 (数据未列出) ,这与 Girijashankar 等观察到的现象
类似 ,其机理有待进一步深入研究[4 ] 。
215 　不同组织中的 Cry1Ab 蛋白含量
转基因植株的根、茎、叶、颖壳和子粒等不同组织
中均能检测到 Cry1Ab 蛋白 ,但含量差异较大 ,最高的
是叶 ,所测定的 2 株转基因植株平均为 01135μgΠg ,最
表 1 　不同转基因植株叶片中的 Cry1Ab 蛋白含量
Table 1 　The content of Cry1Ab protein in leaves of transgenic plants
植株号
code of
plants
Cry1Ab 含量
Cry1Ab content
(μgΠg) 总可溶性蛋白含量total solubleprotein content b(mgΠg) Cry1Ab 相对含量Cry1Ab relativecontent ( %) 植株号code ofplants Cry1Ab 含量Cry1Ab content(μgΠg) 总可溶性蛋白含量total solubleprotein content(mgΠg) Cry1Ab 相对含量Cry1Ab relativecontent ( %)
CK 0 61961 ±01247 0
SR16 01044 ±01006 31477 ±01244 < 01001 SR21 01051 ±01004 51644 ±01953 01001
SR17 01015 ±01001 31665 ±01595 < 01001 SR22 01170 ±01008 51567 ±01953 01003
SR18 01082 ±01005 41042 ±01128 01002 SR24 01017 ±01001 41499 ±01709 < 01001
SR19 01106 ±01007 31717 ±01290 01003 SR25 01850 ±01021 51421 ±01970 01016
SR20 01181 ±01011 41089 ±01236 01005 SR26 01738 ±01022 61559 ±01352 01011
低为茎 ,平均为 01015μgΠg ,Cry1Ab 蛋白含量在不同组
织中表现出一致规律 ,均为 :叶 > 颖壳 > 籽粒 > 根 > 茎
(图 4) 。不同部位叶片的 Cry1Ab 蛋白含量也有差异 ,
中部叶的倒 6 叶最高 ,平均含量为 01161μgΠg ;上部叶
(新叶)的倒 2 叶最低 ,平均为 01116μgΠg ;基部叶介于
两者之间 ;所测定的 2 株转基因植株不同部位叶片中
Cry1Ab 蛋白含量规律基本一致 ,均为 :中部叶 > 基部
叶 > 新叶 (图 5) 。
3 　讨论
高粱害虫种类众多 ,尤其高粱条螟等螟虫严重影
响其产量和品质 ,培育抗虫品种是防治这类害虫最为
有效的方法 ,但目前高粱中抗螟虫资源贫乏 ,难以通过
图 4 　转基因植株不同组织中的 Cry1Ab 蛋白含量
Fig. 4 　Cry1Ab protein content of the different organs
in transgenic plants
常规育种培育出抗螟虫的品种[3 ,4 ,11 ] 。Bt 抗虫基因及
393　3 期 转基因高粱 Cry1Ab 蛋白含量的比较研究
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图 5 　转基因植株不同部位叶片中的 Cry1Ab 蛋白含量
Fig. 5 　Cry1Ab protein content in the different site
of leave of transgenic plants
高粱转基因技术的发展为解决这一问题提供了一条新
途径。本研究通过农杆菌介导法获得的转 cry1Ab 基
因高粱 ,对于丰富高粱的抗虫资源 ,解决高粱生产中的
螟虫危害 ,将具有重大的意义。
转化的外源基因在受体植物中能否正确表达及表
达水平高低一直是人们十分关注的问题 ,这直接关系
到遗传转化成功与否及其应用价值。本研究中 , GUS
活性、PCR、Southern 和 Western 杂交分析表明 , cry1Ab
基因已整合入高粱基因组中并得到正确表达。但有部
分 cry1Ab 基因 PCR 阳性植株中检测不到 GUS 活性 ,
或 GUS 阳性抗性植株检测不到 cry1Ab 基因的整合 ,这
说明处于同一 T2DNA 上的 gus 基因、cry1Ab 基因在某
些转基因株系中并非同时整合 ,可能发生了 T2DNA 的
不完全整合、重排等 ;另外 ,Cry1Ab 蛋白含量的测定结
果 (表 1)表明 ,转基因高粱植株中 cry1Ab 基因表达水
平上存在很大差异 ,只有部分转基因植株可检测到
Cry1Ab 蛋白的表达 ,与转基因植株离体抗虫性生物测
定结果 (数据未列出) 是一致的 ,推测部分转基因植株
可能发生了基因沉默 , 这与 Zhao 等、Nguyen 等和
Girijashankar 等观察到的现象类似[2～4 ] ,其机理有待进
一步深入研究。
Bt 基因在转基因植物不同组织或器官中的表达
量存在差异是一种普遍现象。吴刚等报道 ,在克螟稻
各组织器官中 cry1Ab 基因的表达水平表现为 :茎 > 叶
鞘、叶 > 谷壳 > 根 > 籽粒[8 ] 。卢美贞等报道除花药外 ,
转基因高粱各组织器官中 Cry1Ab 蛋白含量测定结果
为 :叶鞘 > 叶 > 颖壳 > 籽粒 > 根 > 茎髓 ,不同部位叶片
中 ,中部叶含量最高 ,基部叶与上部叶接近[11 ] 。Koziel
等发现基因 cry1Ab 在玉米叶片、茎和根中表达量较
高 ,子粒也有一定量的表达 ,花药中则检测不到 Cry1Ab
蛋白[12] 。本研究中 ,Cry1Ab 蛋白含量不仅在不同转基
因植株中差异很大 ,在同一转基因植株的不同组织中差
异也很明显 ,表现为 :叶 > 颖壳 > 籽粒 > 根 > 茎 ;同一转
基因植株的不同部位的同一组织也存在差异 ,中部叶含
量最高 ,基部叶与上部叶接近 ,这与上述水稻等其他作
物中Bt 基因表达水平差异性的报道类似。但不同作物
中又有各自组织特异性 ,且 Cry1Ab 蛋白表达也因不同
作物的遗传、生长发育特点及环境影响而表现出一定的
时空特性[13] 。因此 ,转基因高粱中 cry1Ab 基因的遗传
稳定性及表达的时空特性还有待进一步研究。
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