全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 032447203
水稻 HTD1 基因启动子在转基因拟南芥中的表达特征
江海湃1 　张淑英2 　王　术1 　邹军煌2 　李　刚2 　谢　旗2 　王伯伦1
(11 沈阳农业大学农学院 ,辽宁 沈阳　110161 ; 21 中国科学院遗传与发育生物学研究所 ,北京　100101)
摘 　要 :通过分析β2葡萄糖醛酸苷酶 (β2glucuronidase , GUS) 基因产物 ,对水稻 HIGH2TILL ERING DWARF1
( HTD1)基因启动子在转基因拟南芥中的表达特性进行初步研究。用已构建的含 HTD1 基因启动子和
GUS 报告基因的植物表达载体 ,通过农杆菌介导转化拟南芥 ,对转基因拟南芥进行 GUS 组织化学染色 ,
观察该启动子的表达特性。结果表明 ,在 HTD1 基因启动子的驱动下 , GUS 报告基因主要在转基因拟南
芥幼苗期的叶片、叶柄、下胚轴以及主根基部的维管组织中表达。
关键词 :拟南芥 ; HTD1 基因 ;启动子 ; GUS 组织化学染色
CHARACTERIZATION OF RICE HIGH2TILL ERING AND DWARF 1 ( HTD1)
GENE PROMOTER IN TRANSGENIC Arabidopsis
J IANG Hai2pai1 　ZHANG Shu2ying2 　WANG Shu1 　ZOU Jun2huang2 　LI Gang2 　XIE Qi2 　WANG Bo2lun
(11 College of Agronomy , Shenyang Agricultural University , Shenyang , Liaoning 　110161 ;
21 Institute of Genetics and Developmental Biology , Chinese Academy of Sciences , Beijing 　100101)
Abstract :The expression pattern of the promoter of rice HIGH2TILL ERING DWARF1 ( HTD1) gene in transgenic Arabidopsis
was studied based on the analysis ofβ2glucuronidase ( GUS ) reporter gene. The HTD1∶∶GUS construct was introduced into
wild Arabidopsis by Agrobacterium2mediated transformation. The expression pattern of the promoter was analyzed by GUS
staining. GUS histochemical assay showed that GUS expression under HTD1 promoter occurred mainly in the vascular tissues
of leaves , petioles , hypocotyls and basal main roots in the seedling stages of transgenic Arabidopsis .
Key words : Arabidopsis thaliana ecotype Columbia ; HTD1 gene ; promoter ; GUS staining
收稿日期 :2009201207 　接受日期 :2009203217
基金项目 :教育部留学人员回国启动基金项目 (010144)和辽宁省百千万人才工程基金 (2008921057)
作者简介 :江海湃 (19832) ,男 ,辽宁沈阳人 ,在读硕士生 ,从事作物生理学及分子生物学研究。Tel : 024288455679 ; E2mail : haipaijiang @hotmail . com
张淑英 (19772) ,女 ,内蒙赤峰人 ,博士 ,从事作物生理学及分子生物学研究。Tel : 010264870491 ; E2mail : syzhang @genetics. ac. cn
张淑英和江海湃并列为第一作者。
通讯作者 :王　术 (19682) ,男 ,内蒙赤峰人 ,博士 ,副教授 ,从事作物生理、品种改良及分子遗传学研究。Tel : 024288487135 ; E2mail : wangshu
-
sl @
yahoo. com
　　水稻是重要的粮食作物之一 ,分蘖数是直接影响
其产量的一个十分重要的农艺性状。近年来 ,通过对
一些影响水稻分蘖基因的克隆及其功能研究 ,人们对
于水稻如何控制分蘖发生的分子生物学机制已经有了
一定的了解。MONOCULM1 ( MOC1) 是第一个被克隆
的控制水稻分蘖的基因 ,它是番茄和拟南芥中控制侧
枝发生的 Lateral suppressor 基因的同源基因 ,其编码的
MOC1 蛋白属于 GRAS( GAI , RGA , SCR)家族的转录因
子 ,在分蘖芽形成和伸长两个阶段都起重要作用[1～4 ] 。
最近 ,Zou 等[5 ,6 ]通过对水稻 high2tillering dwarf 1 ( htd1)
突变体的研究 ,用图位克隆的方法克隆了影响水稻分
蘖的基因 HTD1 ,经过序列比对发现 HTD1 是拟南芥中
参与控制分枝的 more axillary growth (MAX) 系列中
MAX3[7 ,8 ]的同源基因。HTD1 能够互补拟南芥 max3
突变体的多分枝表型 ,证明 HTD1 与 MAX3 具有相同
的生物学功能。通过 Ishikawa 等[9 ] 和 Arite 等[10 ] 对水
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稻 dwarf3 和 dwarf10 突变体的研究 ,证明影响水稻分
蘖的基因 D3 和 D10 分别是拟南芥中参与控制分枝的
MAX2 和 MAX4 的同源基因。由此可以说明在双子叶
植物中 ,控制茎分枝的茎增加信号 ( shoot2multiplication
signal , SMS) 途径在单子叶植物水稻中也是存在的。
HTD1 基因在此途径中负责合成一个由胡萝卜素衍生
出新的抑制侧芽生长的激素类物质 ,从而调控水稻分
蘖数的合理发生。
Zou 等[6 ]通过 Northern 杂交和 GUS 组织化学染色
的方法发现 , HTD1 基因主要在茎节、叶鞘节以及叶片
的维管组织中表达 ,在根尖也有少量表达。因为在
35S 启动子驱动下的 HTD1 基因产物能够恢复 max3
突变体的多分枝表型为野生型状态 ,所以推测水稻中
的 HTD1 基因的启动子在拟南芥中可能也是有功能
的 ,并且其表达模式有可能与水稻中的类似。本研究
将 HTD1∶∶GUS 载体在农杆菌介导下转化双子叶模式
植物拟南芥 ,通过对转基因拟南芥幼苗期植株的 GUS
染色 ,观察水稻 HTD1 基因启动子在转基因拟南芥中
的表达特性。
1 　材料和方法
111 　材料
11111 　植物材料 　拟南芥 ( Arabidopsis thaliana ecotype
Columbia)由中国科学院遗传与发育生物学研究所谢旗
研究员实验室提供。
11112 　菌 种 和 载 体 　农 杆 菌 菌 株 LBA4404 ,
pCAMBIA1301 质粒以及在 pCAMBIA1301 上构建的
HTD1 启动子后接 GUS 报告基因 ( HTD1∶∶GUS ) 的植
物表达载体均由中国科学院遗传与发育生物学研究所
朱立煌研究员实验室提供。
11113 　试剂 　X2gluc 购自 Ameresco 公司 ;其他化学药
品均为国产分析纯试剂 ;引物合成由北京奥科生物技
术有限公司完成。
112 　方法
11211 　拟南芥总 DNA 的提取 　采用 SDS 法 ,提取在
20mgΠL 潮霉素 (Hyg) + 1Π2 MS 培养基上培养 12d ,即将
移栽于营养土的转基因拟南芥幼苗的基因组 DNA。
取大约 100mg 材料 ,经液氮冷冻 ,在直径 5cm 的小研钵
中磨成粉状 ,转移到 115ml 离心管中提取 DNA ,获得
DNA 的沉淀溶解于 200μl ddH2O 中。
11212 　拟南芥的转化 　将含有 HTD1∶∶GUS 融合基因
的 pCAMBIA1301 质粒电击转化转入农杆菌菌株
LBA4404 中 ,挑取含有该质粒的 LBA4404 单菌落 ,接种
于 5ml YEP 液体培养基中 ,28 ℃,180rΠmin 振荡培养约
1d (活化) 。向 300ml YEP 液体中接 2ml 活化的菌液 ,
28 ℃,180rΠmin 振荡培养 1d。4000rΠmin 离心 6min ,收
集菌体 ,用 300ml 侵染培养基 [侵染培养基 1L ,MS 盐
212g ,蔗糖 50g ,22(N2吗琳代) 乙磺酸 (MES) 015g ,62BA
0101g ,100 ×D2泛酸钙 (B5 Vitamin) 10ml ,ddH2O 至 1L ,
pH调至 518 ]重悬菌体。把重悬好的菌体倒入 250ml
烧杯中 ,将待转化的拟南芥已长出的角果剪去 ,然后倒
置在烧杯中让花充分浸入菌液中 ,浸泡 5min。把浸好
的拟南芥平放 ,用黑布盖好 ,22 ℃培养 1d ,然后正常培
养回收种子。
11213 　抗性植株的 PCR 检测 　将 T1 代转基因拟南芥
种子播种在含有潮霉素 (20mgΠL) 的 1Π2 MS 培养基中
进行抗性筛选 ,共计得到 16 个抗性株系。提取拟南芥
抗性植株的基因组 DNA , 以其为模版进行 PCR 检测 ,
每个 PCR 反应用 2μl 样品。用重组后的 pCAMBIA1301
植物表达载体上所携带的潮霉素基因的一段作为抗性
植物转基因阳性的鉴定标准。引物序列为 : FW : 52
TAGGAGGGCGTGGATATGTC23 ; RV : 52
TACACAGCCATCGGTCCAGA23。PCR 条件 :94 ℃预变性
4 min ; 94 ℃变性 30s , 58 ℃退火 30s , 72 ℃延伸 60s , 30
个循环 ; 72 ℃延伸 10min ; 1 %琼脂糖凝胶电泳检测。
11214 　PCR 阳性植株的 GUS 染色[11 ] 　将 22 ℃、16hΠ8h
光照Π黑暗条件下培养的转基因拟南芥植株的整株幼
苗及叶片等器官放入 GUS 染液中 ,抽真空至材料表面
产生少许气泡并被染液完全淹没为止 ,37 ℃过夜 ,用脱
色液脱色后在体视镜下观察染色结果。GUS 染液配
方 :50mmolΠL 磷酸钠缓冲液 pH710 ,5mmolΠL 铁氰化钾 ,
5mmolΠL 亚铁氰化钾 , 011 % Triton X2100 和 1mmolΠL
X2Gluc。脱色液配方∶乙醇∶乙酸 = 3∶1。
2 　结果与分析
211 　拟南芥的转化及抗性植株的 PCR 检测
通过 PCR 检测 ,用潮霉素基因对 16 个抗性株系
进行转基因阳性验证 ,结果表明 16 个转基因株系均是
潮霉素阳性 ,而作为对照的野生型则没有检测到潮霉
素基因的存在 (图 1) 。
212 　GUS 组织化学染色
为了观察 HTD1 启动子在拟南芥中的表达特征 ,
对 16 个转基因拟南芥株系幼苗期的整株植株、真叶及
子叶进行 GUS 组织化学染色 (图 2) 。结果表明 , GUS
基因在不同拟南芥转基因株系中的表达模式基本相
同 ,但不同组织中 GUS 的表达量存在微弱的差异。在
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转基因拟南芥真叶与子叶的叶片以及叶柄的维管组织
中 , GUS 基因有较强的表达 ,在下胚轴和主根基部也
有稍弱的表达 ,而在主根根尖以及侧根中均未观察到
GUS 的表达。
图 1 　抗性转基因植株的 PCR 检测
Fig. 1 　PCR analysis of resistant and transgenic plants
WT:野生型 (阴性对照) ; 1～16 :转基因植株 ; CK:pCAMBIA1301 质粒 (阳性对照)
WT: wild type (negative control) ; 1～16 : resistant and transgenic plants ; CK: pCAMBIA1301 plasmid(positive control)
图 2 　HTD1 基因启动子驱动的 GUS 基因在
转基因拟南芥中的表达
Fig. 2 　Expression of HTD1∶∶GUS chimeric gene
in transgenic Arabidopsis
a :整株幼苗 b :真叶 ;c :子叶
a : the whole seedling ; b :true leaf ;c :cotyledo
3 　讨论
本研究采用农杆菌介导法将 HTD1∶∶GUS 植物表
达载体引入拟南芥中 ,对转基因拟南芥进行 GUS 组织
化学染色 ,结果表明 ,在 HTD1 基因启动子的驱动下 ,
报告基因 GUS 主要在转基因拟南芥幼苗期的叶片、叶
柄、下胚轴以及主根基部的维管组织中表达。这与该
启动子在水稻中的表达情况既有相似又略有不同。相
似的是 HTD1 启动子在两种植物中的表达都主要集中
在维管组织中 ,稍有不同的是 HTD1 基因启动子在水
稻植株的根尖表达 ,但在根的上部没有观察到表达 ,而
在拟南芥的主根基部可以观察到表达 ,根尖部位却未
观察到表达。因为水稻的 htd1 突变体主要表现为地
上部分的多分蘖表型 ,并且 35S 驱动的 HTD1 基因也
是互补的拟南芥 max3 突变体地上部分的多分枝表
型 ,所以可能 HTD1 启动子在水稻和拟南芥中地上部
分维管束中表达的相似性更为重要。HTD1 启动子在
拟南芥和水稻中表达模式的异同以及这种异同点对于
同源基因的功能是否有影响还需要进一步通过对两种
植物中不同时期的不同组织进行 GUS 染色来说明。
另一点值得注意的是 , HTD1 基因在水稻植株中
的表达部位与其同源基因 MAX3 在拟南芥中的表达部
位也有明显不同。MAX3 只在拟南芥根中高表达 ,在
茎、叶片和上下胚轴中的表达相对较弱。这些结果可
能暗示单双子叶植物不但存在茎分枝控制的保守性 ,
而且也体现了它们在进化上的分歧 ,其中的具体原因
有待进一步研究。
致谢 :本研究得到中国科学院遗传与发育生物学研究
所 ,植物基因组学国家重点实验室朱立煌研究员的大
力支持 ,在此表示衷心的感谢。
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电子束辐照杀虫技术以其杀虫彻底、能耗少、无残
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在许多情况下是化学药剂的有效替代技术 ,具有进一
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