全 文 ：核 农 学 报 2011，25(1):0037 ～ 0042
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2011)01-0037-06
收稿日期:2010-06-18 接受日期:2010-10-08
基金项目:农业部农业公益性行业科研专项经费项目(200803034)，国际原子能机构研究合同项目(R13631)
作者简介:李春楠(1986-)，女，黑龙江嫩江人，硕士研究生，研究方向为诱变遗传与植物分子改良。Tel:0571-86911405;E-mail:lcn0814@ 126. com
通讯作者:崔海瑞(1963-)，男，安徽蚌埠人，研究员，研究方向为诱变遗传与植物分子改良。Tel:0571-86971405;E-mail:hrcui@ zju. edu. cn
CEL I粗提物用于点突变检测的技术
崔海瑞 李春楠 吴殿星 舒庆尧
(浙江大学原子核农业科学研究所 /农业部核农学重点开放实验室，浙江 杭州 310029)
摘 要:本文以含有单个错配的 DNA 异质双链为底物鉴定芹菜 CEL I 粗提物的错配切割酶学活性，并对
影响其切割错配的反应条件进行优化，建立以 CEL I 粗提物为基础的点突变酶学检测技术。结果表明:
自制的 CEL I 粗提物能有效识别和切割 DNA 异质双链中碱基错配。当异质双链 DNA 量恒定时，在一
定的范围内 CEL I 粗提物用量对错配切割效果的影响不明显，由 PCR 产物形成的 12μl 异质双链 DNA
可用蛋白质总量约 900ng 的 CEL I 粗提物进行有效切割。常规 PCR 缓冲液与已报道的 CEL I 缓冲液的
效果基本相近，实际工作中可选用 PCR 缓冲液作 CEL I 酶切反应液;缓冲液 pH 值对错配切割效果具有
明显的影响，适宜 pH 约近中性(6. 5 ～ 7. 5)。Zn2 +对错配切割具有促进作用，但不是必需的，最适浓度
为 0. 25mmol /L。CEL I 粗提物切割错配的反应时间以 42℃下酶切 20min 为宜。比较试验显示，本研究
建立技术的点突变检测效果与 Transgenomic 公司试剂盒 SurveyorTM基本相同。
关键词:CEL I 粗提物;切割活性;条件优化;突变检测
A DETECTION METHOD FOR POINT MUTATIONS BASED ON CEL I CRUDE EXTRACT
CUI Hai-rui LI Chun-nan WU Dian-xing SHU Qing-yao
(Institute of Nuclear-Agricultural Sciences /Key Laboratory of Chinese Ministry of Agriculture for Nuclear-Agricultural Sciences，
Zhejiang University，Hangzhou，Zhejiang 310029)
Abstract:Enzymatic activity for mismatch cleavage of CEL I crude extract from celery was characterized using DNA
hexteroduplexes，which contained a single mismatch as subtracts. An enzymatic method based on the CEL I crude
extract for detection of point mutations was developed after optimization of reaction conditions for its mismatch cleavage.
Results showed that the mismatch in DNA hexteroduplexes could be effectively recognized and cleaved by the self-made
CEL I crude extract. Effect of amounts of CEL I crude extract within a certain range was not significant when the
quantity of DNA hexteroduplexes was definite，and usually the amount of CEL I crude extract containing total protein
about 900ng could be used for effective cleavage of the mismatch in DNA hexteroduplexes formed by 12μl PCR
products. Common PCR buffer was similar to CEL I buffer reported for the mismatch cleavage and the former would be
feasible in practice. Effect of buffer pH on the mismatch cleavage was significant and the near neutral pH (6. 5 ～ 7. 5)
was suitable for the mismatch cleavage by CEL I crude extract. Zn2 + could promote the mismatch cleavage，with a
suitable concentration about 0. 25mmol /L，but not necessary. The feasible reaction time was 20min at 42℃ for the
mismatch cleavage by CEL I crude extract. Comparison test showed that the result of detecting point mutations by our
method was almost the same as that by the kit surveyorTM from Transgenomic Company.
Key words:CEL I crude extract;mismatch cleavage activity;condition optimization;mutation detection relative
73
核 农 学 报 25 卷
点基因突变已成为当今生命科学研究的热点之
一，检测方法也随之迅速发展［1］。在众多的点突变检
测技术中，酶学突变检测是一种相对较为简便、有效的
突变检测技术［2，3］。酶学突变检测技术的建立依赖于
特异性核酸酶的发现和利用。CEL I 酶是近年来在芹
菜中发现并提取的一种高效特异识别和切割错配碱基
的真核内切酶，也是 TILLING(Targeting Induced Local
Lesions IN Genome)技术中用到的一个关键酶［4，5］。对
于该酶的提取与纯化，国外已有文献报道［6，7］，但整个
提取纯化过程十分繁杂、耗时长。CEL I 在国外虽已
商品化，但价格很高，大规模应用的成本难以承受，研
发 CEL I 酶低成本应用技术是十分重要的。值得注意
的是即使是 CEL I 粗提物也能有效识别和切割错配碱
基［7 ～ 9］，这为利用 CEL I 粗提物进行点突变的检测奠
定了基础。尽管国内外对纯化的 CEL I 切割反应条件
已有研究［6 ～ 8，10］，但对于利用 CEL I 粗提物切割错配
的适宜条件尚无详细报道。为此，本文对芹菜 CEL I
粗提物活性进行了鉴定，通过对错配切割条件的优化，
建立了以自制的 CEL I 粗提物为基础的点突变快速检
测方法，旨在使酶学突变检测更加便宜、简便和有效。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 植物材料 本研究所用的芹菜品种为西芹文
图拉，播种于浙江大学实验农场，常规栽培管理。
1. 1. 2 质粒 在 CEL I 切割试验中，所用含有碱基错
配的 DNA 双链是以 2 种质粒的 DNA 为模板扩增得到
的，一个是 pControlG，另一个是 pControlC，它们仅在扩
增区段的 417 碱基处存在单个碱基差异，前者是 G 而
后者为 C。
1. 2 方法
1. 2. 1 CEL I 酶粗提及蛋白质浓度测定 将芹菜依
次经自来水和蒸馏水冲洗后，用无菌吸水纸擦干，去掉
根部，用榨汁机榨取并收集汁液，然后在 4℃下按文献
［11］描述的方法略作修改后进行提取，修改处为所用
的提取缓冲液中加入了 0. 1%的抗坏血酸(Vc)。将经
过透析的 CEL I 粗提物保存于-70℃ 备用。参照
Bradford(1976)的蛋白质浓度测定方法定量 CEL I 粗
提物中的蛋白含量［12］。
1. 2. 2 PCR 扩增 采用 Primer premier 5. 0 设计引物
对 1. 1. 2 所述质粒中含有点突变的区段进行扩增，正、
反 向 引 物 序 列 为 5′-ACACCTGATCAAGCCTGT-
TCATTTGATTAC-3′和 5′-CGCCAAAGAATGTACTGCG-
GAGCTT-3′，由上海生工生物技术公司合成。PCR 反
应体系为 25μl，包括 2. 5μl 10 × PCR 缓冲液 (含
25mmol /L MgCl2)、Taq Plus 聚合酶 1U、1μl dNTPs
(10mmol /L)、上下游引物各 1μl(10μmol /L)、模板 1μl
(约 15ng)，用去离子水补足 25μl。在 MG96G PCR 仪
上进行扩增，扩增程序如下:94℃预变性 3min;94℃
30s、65℃ 45s、72℃ 1min 30s，35 个循环;最后 72℃ 延
伸 5min。
1. 2. 3 杂合双链的形成 将质粒 pControlG 和
pControlC 特定区段的扩增产物等量混合，首先在 94℃
下变性 5min，然后按 2℃ / s 降温至 85℃，再以 0. 1℃ / s
降温至 25℃，以形成含有错配碱基的异质 DNA 双链。
1. 2. 4 CEL I 粗提物切割活性的初步鉴定 采用
20μl 切割反应体系，含 2μl CEL I 缓冲液［8］、0. 5 或
1. 0μl 稀释 5 倍的 CEL I 粗提物、12μl 异质双链 DNA，
用去离子水补足 20μl。将反应体系 42℃下温育，加入
0. 5μl 0. 5mol /L EDTA 终止反应。
1. 2. 5 CEL I 粗提物切割杂合双链 DNA 的条件优化
针对切割缓冲液及其 pH 值、CEL I 粗提物用量、反
应时间和 Zn2 + 浓度等因素设置不同的水平进行切割
条件的优化。缓冲液采用 CEL I 缓冲液［8］和常规 PCR
缓冲液 2 种;以常规 PCR 缓冲液为基础，设置了
pH6. 5、7. 5 和 8. 5 三个梯度;从体积及其所含蛋白总
量两方面测试 CEL I 粗提物用量，体积设置分别为
0. 5、0. 75、1. 0、1. 5、2. 0、3. 0、4. 0 和 5. 0μl 的 5 倍稀释
粗提物，按含蛋白总量设置的剃度分别为 300、600、
900、1200 和 1500ng;Zn2 + 浓度的设置分别为 0. 25、
0. 50、1. 0 和 2. 0mmol /L;反应时间设置为 42℃下分别
切割 20 和 40min。
1. 2. 6 自建方法与试剂盒 SurveyorTM检测点突变效果
的比较 在优化条件下用自制的 CEL I 粗提物进行错
配切割，采用 20μl 的切割反应体系，含 12μl 异质双链
DNA、2. 0μl PCR 缓冲液 (pH6. 5)、蛋白总量约为
900ng 的 CEL I 粗提物、0. 25mmol /L ZnSO4，42℃下温
育 20min;试剂盒 SurveyorTM的 CEL I 用量为 1. 0μl，切
割 反 应 按 Transgenomic 公 司 突 变 检 测 试 剂 盒
SurveyorTM随附的操作说明进行。
1. 2. 7 电泳检测 经 CEL I 处理后的产物全部点样，
用含溴化乙锭的 1. 8% 琼脂糖凝胶电泳分离和检测。
电极缓冲液采用 0. 5 × TBE，100V 稳压电泳 40 ～
60min，用 BioRad 成 像 系 统 观 察、拍 照。以 DNA
Marker(100bp DNA Ladder，上海生工)为参照确定切
割片段的大小。
83
1 期 CEL I 粗提物用于点突变检测的技术
2 结果与分析
2. 1 CEL I 粗提物的酶活性鉴定
由图 1 可见，在未经 CEL I 粗提液处理的泳道中，
只有 634bp 的条带。而经 CEL I 粗提物处理后，除原
扩增产物的条带外，另新出现 2 条带，大小分别为
217bp 和 417bp，与已知发生 G(C 点突变的位置完全
一致，说明异质双链体中的错配碱基可被 CEL I 粗提
物有效识别和切割。
图 1 CEL I 粗提物对异质双链
DNA 的切割结果
Fig. 1 Mismatch cleavage by CEL I
crude extract
1 ～ 3:异质双链 DNA 经 0. 5、1. 0 和 0. 0μl(对照)粗提物 5 倍
稀释液处理;M:100bp DNA 标记
1 ～ 3:DNA hexteroduplexes treated by 0. 5，1. 0 and 0. 0μl(CK)
of CEL I crude extracts diluted 5 times;M:100bp DNA marker
2. 2 CEL I 粗提物用量对切割效果的影响
不同 CEL I 粗提物用量的切割效果不同(图 2)。
在用量较低时(0. 5 和 0. 75μl)就可看到切割条带;随
着用量增加到 1. 5μl，底物条带(含异质双链的条带)
信号进一步减弱，而切割产生的新条带信号则增强;用
量在 1. 0(4. 0μl 时，尽管底物信号有减弱的趋势，但切
割所产生的条带信号基本不变;当用量达到 5μl 时，底
物条带信号最弱，但切割产生条带的信号也随之减弱。
这表明在异质双链底物量一定的情况下，随着 CEL I
粗提物用量的增加，对错配的切割能力增强，当异质双
链中的错配已被完全切割后，产生的条带信号不再随
酶用量的增加而增强，而且过高的用量还会造成非特
异性剪切。
在制备 CEL I 粗提物时，每次所用芹菜生物量和
透析后的体积都很难保持完全一致，因此以粗提液体
积用量为指标难以用来比较不同批次 CEL I 提取物的
活性和确定适宜的用量。为此，本研究进一步比较了
不同蛋白含量的 CEL I 提取物的切割效果，结果见图
3。由图可见，当粗提物中蛋白总量为 300ng 和 600ng
图 2 不同体积 5 倍稀释 CEL I
提取物的错配切割效果
Fig. 2 Effect on mismatch cleavage of different
volumes of CEL I crude extract diluted 5 times
1 ～ 9:用量分别为 0. 5、0. 75、1. 0、1. 5、
2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 和 0. 0μl(对照)
1 ～ 9:0. 5，0. 75，1. 0，1. 5，2. 0，3. 0，
4. 0，5. 0 and 0. 0μl(CK)，respectively
时，异质双链的切割不完全，900 ～ 1500ng 时切割产生
条带信号的强度基本一致，因此可采用蛋白总量约为
900ng 的粗提物。
图 3 不同蛋白含量 CEL I 粗提物的
错配切割效果
Fig. 3 Effect on mismatch cleavage of CEL I
crude extract with different protein contents
1 ～ 6:蛋白含量分别为 300、600、
900、1200、1500 和 0. 0 ng(对照)
1 ～ 6:protein content was 300，600，900，1200，
1500 and 0. 0 ng (ck)，respectively
2. 3 缓冲液及其 pH 值对 CEL I 粗提物切割效果的
影响
本研究比较了 2 种缓冲液中 CEL I 粗提物切割错
配的效果(图 4)，从条带信号强度看，CEL I 缓冲液对
CEL I 粗提物切割错配略有促进作用，但与常规 PCR
缓冲液无显著差异。
在同一种缓冲液的不同 pH 下，CEL I 粗提物对错
配的切割效果有所不同(图 5)。较高的酸度(pH8. 5)
环境不利于错配切割，尽管在 pH6. 5 时错配切割比较
充分，但切割产生的新条带信号强度与 pH7. 5 无显著
差别。这一结果说明 pH 近中性最有利于 CEL I 粗提
物对错配的切割。
2. 4 Zn2 +浓度的影响
由图 6 可以看出，在 Zn2 +浓度为 0. 25mmol /L 时，
93
核 农 学 报 25 卷
图 4 缓冲液对 CEL I 粗提物切割错配的影响
Fig. 4 Effect of buffer on mismatch cleavage
by CEL I crude extract
1:未处理的异质双链;2、3:在常规 PCR
缓冲液和 CEL I 缓冲液中的切割
1:undigested heteroduplexes;2，3:digested
by CEL I crude extract in PCR buffer and CEL I buffer
图 5 缓冲液 pH 值对 CEL I 粗提物切割错配的影响
Fig. 5 Effect of buffer pH on mismatch
cleavage by CEL I crude extract
1 ～ 3:缓冲液 pH 值分别为 6. 5，7. 5 和 8. 5
1 ～ 3:buffer pH 6. 5，pH 7. 5 and pH 8. 5，respectively
底物条带信号比对照减弱，而切割产生新条带的信号
基本相近，但随着 Zn2 + 浓度的增加，错配切割逐步加
强，但切割产生新条带的信号并未增强，反而有降低的
趋势。这一结果说明，尽管 Zn2 +对 CEL I 粗提物切割
错配有促进作用，但并非 CEL I 所必需，并且随着
Zn2 +浓度的增高非特异性切割作用增强。因此，Zn2 +
浓度 0. 25mmol /L 对 CEL I 粗提物切割错配是比较适
宜的。
2. 5 反应时间的影响
对于酶切反应时间，本试验在 42℃下分别进行了
40 和 20min 的酶切(图 7)。由图可见，尽管处理
40min 比 20min 的底物条带信号明显减弱，但切割产
生的新条带信号也略有减弱。这一结果说明延长反应
时间可使错配切割更充分，但可能带来非特异性切割
和降解，导致检测信号的减弱。因此，利用 CEL I 粗提
物消化异质双链 20min 即可。
2. 6 自建方法与试剂盒检测点突变效果的比较
根据上述优化后的条件，利用自制 CEL I 粗提物
建立了点突变的检测方法。由 12μl PCR 产物形成的
图 6 Zn2 +浓度对 CEL I 粗提物
切割错配的影响
Fig. 6 Effect of Zn2 + concentration on
mismatch cleavage by CEL I crude extract
1 ～ 5:Zn2 + 浓度分别为 0、0. 25、0. 50、
1. 00、2. 00mmol / L;6:未处理的异质双链
1 ～ 5:Zn2 + concentration was 0，0. 25，0. 50，1. 00
and 2. 00mmol / L，respectively;6:undigested heteroduplexes
图 7 反应时间对 CEL I 粗提物切割错配的影响
Fig. 7 Effects of cleavage time on
mismatch cleavage by CEL I crude extract
1:40min;2:20min
含有错配碱基的异质双链 DNA 可采用蛋白总量约为
900ng 的 CEL I 粗提物切割，切割缓冲液为 pH6. 5 的
常规 PCR 缓冲液，附加 0. 25 mmol /L ZnSO4，42℃下温
育 20min。经电泳检测，自建方法的检测效果与
Ttransgenomic 试剂盒基本相同(图 8)。
图 8 试剂盒与自建方法检测点
突变的效果比较
Fig. 8 Comparison of detecting
point mutation between the Kit and the
self-established method
1:试剂盒;2:自建方法
1:by Kit;2:by the self-established method
04
1 期 CEL I 粗提物用于点突变检测的技术
3 讨论
随着后基因组时代的到来，基因组学已从结构基
因组学向功能基因组学领域拓展。功能基因组学研究
内容包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测。
基因突变及突变的筛选技术是遗传学研究中最重要的
手段之一，亦是研究基因功能的方法之一。因此，开展
点突变研究对功能基因组学具有重要意义。目前已经
建立了多种点突变的技术，其中的酶学突变检测是一
种较为简便、有效的突变检测技术［2，3］。
在进行突变的酶学检测时，首先面临的一个问题
是酶用量的多少。本研究结果显示，当含有错配的异
质双链数恒定时，CEL I 粗提物用量太小则异质双链
中的错配切割不完全，切割产生的条带信号较弱;随着
用量的增加，切割产生的条带信号将增强;当用量达到
一定程度后，异质双链中的错配可被完全切割，但切割
产生的条带信号不再随酶用量的增加而增强;当 CEL
I 粗提物使用过量后，尽管错配可被完全切割，但却伴
随了非特异性切割，导致切割产生的条带信号减弱。
因此，在进行点突变的酶学检测时，尤其是使用的酶制
剂为粗提物时，确定适宜的用量是非常重要的。从目
前已有报道看，有关 CEL I 粗提物的用量都是用体积
作指标的。然而，不同的研究者在制备 CEL I 粗提物
时，每次所用芹菜生物量和最终获得的可用于检测的
CEL I 粗提物体积是不同的，即使是同一研究者在制
备不同批次的 CEL I 粗提物时，经透析后所获得的体
积也很难保持完全一致。由此可见，以粗提液体积作
为用量指标，难以用来比较不同研究者、不同批次 CEL
I 提取物的活性和确定适宜的用量。本研究在建立以
CEL I 粗提物为基础的点突变检测方法时，采用CEL I
粗提物中蛋白总量为指标，这一指标只受不同芹菜品
种中 CEL I 占总蛋白比例的影响，而与制备 CEL I 粗
提物时所用芹菜生物量和操作无关，相对于体积指标
而言，使用这一指标更合理、更有普遍意义。
酶学错配切割实质上是一种酶促反应过程，需要
适宜的环境。在进行 CEL I 错配切割试验中，已报道
所用缓冲液主要有 CEL I 缓冲液［8，9］、D 缓冲液［7］、
Nicking 缓冲液［10］，其中，以 CEL I 缓冲液需要的试剂
种类最多，Nicking 缓冲液与 D 缓冲液次之(二者成分
相近，但前者需 HEPES)。本研究结果显示，CEL I 粗
提物在 PCR 缓冲液中对错配切割的效果与 CEL I 缓
冲液无显著差异。由于销售商供应 PCR 所需的 Taq
DNA 聚合酶时，一般都提供过量的 PCR 缓冲液，这样
利用它作为 CEL I 粗提物的切割缓冲液就无需专门配
制，既方便快捷，又可节约成本。因此，在实际工作中
可选用一般 PCR 缓冲液。不同的酶需要适宜的 pH 不
同，因此缓冲液 pH 值是影响突变酶学检测效果的一
个重要因素。Oleykowski 等报道尽管纯化后的 CEL I
酶在 pH 5 ～ 9 都具有切割活性，但最适 pH 近中性［7］。
本研究结果表明 CEL I 粗提物的适宜 pH 也是近中
性，与纯化物相同。Yang 等报道纯化的 CEL I 酶大小
为 43kDa，Zn2 +与其保守的催化域结合，Mg2 +是切割所
必需的，主要在识别错配中起作用［6］。对绿豆核酸酶
来说，2. 0mmol /L 的 Zn2 +可显著促进错配切割［8］。但
目前为止，对 CEL I 粗提物切割错配所需要的 Zn2 +适
宜浓度尚无报道。本研究的结果表明，Zn2 + 对 CEL I
粗提物切割错配具有促进作用，适宜的浓度为
0. 25mmol /L，但不是必需的，这可能是由于粗提物中
CEL I 催化域已结合的 Zn2 + 量足以保持其活性所需
要。
与 Oleykowski 等［7］、Till 等［8］、韩锁义等［9］、廖凤
贤等［13］报道的结果相似，本研究结果进一步证实了
CEL I 粗提物可有效识别和切割异质双链体中的错配
碱基。尽管粗提物含有其他蛋白和杂质，但稀释 5 倍
后，在很低的用量下仍显示出较高的切割活性。通过
对反应条件的优化，利用 CEL I 粗提物建立了点突变
快速检测技术，切割之后的片段经琼脂糖凝胶电泳所
显示的条带相比其他文献报道［10，13 ～ 15］的更清晰，效果
与试剂盒基本相同，但成本远远低于 SurveyorTM试剂
盒。例如，若用 SurveyorTM试剂盒，每检测一个样品
(一次切割反应)的 CEL I 费用约 2 ～ 3 美元(25 次反
应试剂盒价格为 75 美元，100 次的为 250 美元);若自
制 CEL I 粗提物，用 0. 5kg 芹菜茎杆做起始提取材料，
最终可获得粗提物体积约 25ml，用时稀释 5 倍，每个
反应约 2μl，相当于试剂盒的 62500 次反应，总提取成
本不到 300 元(芹菜、试剂、消耗品等)，即使加上人工
成本(可在 10h 内完成)，每次切割反应所需 CEL I 粗
提物的成本仍不足 0. 01 元。另外，我们用此技术在水
稻和拟南芥、茶树中已成功地检测点突变(结果未在
本文列出)，相信这种廉价的检测技术在点突变检测
中将具有良好的应用前景。
4 结论
通过对错配切割条件的优化，本研究建立了以自
制 CEL I 粗提物为基础的点突变快速检测方法，使点
突变的酶学检测更加简便、有效和价格低廉，检测效果
14
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2010，25(1):0037 ～ 0042
与 Transgenomic 公司试剂盒 SurveyorTM基本相同，具有
良好的应用前景。
参考文献:
［1 ］ Kwork P Y. Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms
［J］. Annual Review of Genomics and Human Genetics，2001，2:
235 － 258
［2 ］ 刘继业，崔海瑞，吴殿星，舒庆尧 . 点突变的酶学检测技术［J］.
核农学报，2009，24(2):307 － 333
［3 ］ Yeung A T，Hattangadi D，Blakesley L，Nicolas E. Enzymatic
mutation detection technologies［J］. BioTechniques，2005，38(5):
749 － 758
［4 ］ 孙 洁，崔海瑞 . TILLING 技术及其应用［J］. 细胞生物学杂志，
2007，29(1):41 － 46
［5 ］ 李春寿，阮关海，张琳琳，吴殿星 . TILLING 技术的原理、特点及
其在点突变筛选中的应用［J］. 核农学报，2005，19(4):317 －
321
［6 ］ Yang B，Wen X，Kodali N S，Oleykowski C A，Miller C G，
Kulinski J，Besack D，Yeung J A，Kowalski D，Yeung A T.
Purification，cloning，and characterization of CEL I nuclease［J］.
Biochemistry，2000，39(13):3533 － 3541
［7 ］ Oleykowski C A，Bronson Mullins C R，Godwin A K，Yeung A T.
Mutation detection using a novel plant endonuclease［J］. Nucleic
Acids Research，1998，26(20):4597 － 4602
［8 ］ Till B J，Burtner C，Comai L，Henikoff S. Mismatch cleavage by
single － strand specific nucleases［J］. Nucleic Acids Research，
2004，32 (8):2632 － 2641
［9 ］ 韩锁义，杨玛丽，盖钧镒，喻德跃 . CEL I 酶的粗提取及其活性检
测［J］.遗传，2006，28(9):1112 － 1116
［10］ 林 英，陈冬妹，赵 萍，杨瑜，林立鹏，夏庆友 . CEL I 酶的粗纯化
及活性分析［J］.农业生物技术学报，2007，15(6):1006 － 1011
［11］ Till B J，Zerr T，Comai L，Henikoff S. A protocol for TILLING and
Ecotilling in plants and animals［J］. Nature Protocols，2006，1(5):
2465 － 2477
［12］ Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein － dye
binding［J］. Analytica1Biochemistry，1976，72:248 － 254
［13］ 廖凤贤，黎佳佳，余舜武 . CEL I 酶的高效检测及其在 Eco －
TILLING 中的高效应用［J］. 现代农业科学，2009，16(1):1 － 3，
14
［14］ 张志刚，谢 勇，李成云，陆春明，王云月，朱有勇 .琼脂糖凝胶电
泳在水稻 Eco － TILLING 技术中的应用［J］. 中国水稻科学，
2008，22(5):527 － 532
［15］ Raghavan C，Naredo M B，Wang H，Atienza G，Liu B，Qiu F，
McNally K L，Leung H. Rapid method for detecting SNPs on agarose
gels and its application in candidate gene mapping［J］. Molecular
Breeding，2007，19(2):87 － 101
(责任编辑 王媛媛
櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀
)
(上接第 25 页)
［131］ Watanabe N，Lam E. Bax inhibitor － 1，a conserved cell death
suppressor，is a key molecular switch downstream from a variety of
biotic and abiotic stress signals in plants［J］. Int J Mol Sci，2009，
10:3149 － 3167
［14］ Xu Q，Reed J C. Bax inhibitor-1，a mammalian apoptosis suppressor
identified by functional screening in yeast［J］. Mol Cell，1998;1:
337 － 346
［15］ Bolduc N， Ouellet M， Pitre F， Brisson L F. Molecular
characterization of two plant BI-1 homologues which suppress Bax －
induced apoptosis in human 293 cells［J］. Planta，2003，216:377
－ 386
［16］ Chae H J，Ke N，Kim H R，Chen S，Godzik A，Dickman M，Reed
J C. Evolutionarily conserved cytoprotection provided by Bax
inhibitor-1 homologs from animals，plants，and yeast ［J］. Gene，
2003，323:101 － 113
［17］ Ihara-Ohori Y，Nagano M，Muto S，Uchimiya H，Kawai-Yamada
M. Cell death suppressor Arabidopsis Bax Inhibitor-1 is associated
with calmodulin binding and ion homeostasis［J］. Plant Physiol，
2007，143:650 － 660
(责任编辑 王媛媛)
24