全 文 ：核 农 学 报 2010，24(6):1172 ～ 1176
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2010)06-1172-05
耐辐射菌株筛选及其胞外代谢产物抗紫外辐射物质特性
谢玉清 张志东 宋素琴 茆 军
(新疆农业科学院微生物应用研究所，新疆 乌鲁木齐 830091)
摘 要:从经 8kGy γ 辐照处理的新疆沙漠样本中分离到 1 株红色球菌———RV113，鉴定为奇异球菌属
(Deinococcus)的新菌。试验证明该菌胞外代谢产物具有抗紫外辐射特性，能有效提高 E. oli JM109 紫外
辐射抗性。紫外吸收光谱与清除 DPPH 自由基特性试验说明，菌株 RV113 的正已烷、乙酸乙酯、正丁醇
3 种溶剂萃取的胞外代谢产物具有降低紫外辐射直接损伤与间接损伤的作用。
关键词:奇异球菌;胞外代谢产物;抗紫外辐射
ISOLATION OF RADIATION-RESISTANT BACTERIUM AND ITS ANTI-ULTRAVIOLET
RADIATION PROPERTIES OF EXTRACELLULAR METABOLITES
XIE Yu-qing ZHANG Zhi-dong SONG SU-qing MAO Jun
(Institute of Microbiology，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi，Xinjiang 830091)
Abstract:A red spherical bacterium strain designed as RV113，was isolated from the 8kGy irradiated samples of desert
in Xinjiang Province. It was characterized by strong radiation-resistance and belonged to the genus of Deinococcus
through taxonomic identification. Its extracellular metabolites have the ability to improve the resistance of E. coli JM109
to ultraviolet radiation. It has been proved that N-hexane extracts，ethyl acetate extracts and N-butanol extracts of
extracellular metabolic could reduce the direct injury and indirect injury through the measurement of ultraviolet
absorption spectral properties and free radical scavenging activity of DPPH.
Key words:Deinococcus;extracellular metabolites;anti-ultraviolet radiation
收稿日期:2010-01-27 接受日期:2010-06-17
基金项目:农业公益性行业科研专项经费项目(200803034)，新疆维吾尔自治区自然科学基金(2010211B28)
作者简介:谢玉清(1976-)，女，新疆吉木萨人，助理研究员，生物化学与分子生物学。Tel:0991-4533304;E-mail:xyqmail@ sohu. com
通讯作者:茆 军(1974-)，男，江苏淮安人，副研究员，微生物学。Tel:0991-4520524;E-mail:teamperformance@ live. cn
由于臭氧层的破坏，太阳光中的紫外线(UV)透过
大气层的量增加，对生物体造成威胁。紫外辐射所导
致的损伤包括直接的 DNA 损伤与间接的氧化损
伤［1，2］，为适应 UV 辐射，环境生物体必然产生抵御机
制进行自我保护［3 ～ 5］。目前，对于生物体自我保护方
面的研究主要集中于 DNA 辐射损伤修复，在抗辐射方
面上主要集中于辐射损伤的治疗，对辐射防护的研究
较少。在微生物抗辐射代谢产物研究中，Borchert 用 4
种菌细菌壁为主原枓，加工出一种用于化妆品的紫外
辐射防护剂［6］，王洪媛、梁晓婷等对抗 UV-B 辐射的成
团泛菌(Pantoea agglomerans)胞外紫外吸收物质进行
了初步分析［7 ～ 9］，杨桥等研究了类胡萝卜素在微生物
抗辐射中的作用［10 ～ 12］，随着研究的深入，微生物抗辐
射代谢产物显示出重大的开发价值［13］。本文报道 1
株胞外代谢产物对其他微生物具有保护作用的抗辐射
菌株，从抗 UV 辐射代谢产物方面阐释微生物的抗 UV
辐射机制，探讨其潜在的应用前景。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株 菌株:RV113 由本研究组自新疆塔克拉
玛干沙漠沙土样本分离获得;试验对照菌株:大肠杆菌
(Escherichia coli，E. coli)JM109 为本研究所微生物菌
2711
6 期 耐辐射菌株筛选及其胞外代谢产物抗紫外辐射物质特性
种保藏室提供。
1. 1. 2 主要试剂及培养基 细菌基因组提取试剂盒
(TIANamp Bacteria DNA Kit)和 PCR 试剂盒(Pfu DNA
Polymerase)均购自天根生化科技公司;菌株分离及培
养用的 TGY 培养基均按常规方法配制。
1. 2 RV113 菌株的分离、纯化与鉴定
1. 2. 1 菌株分离 按文献［14］中的方法将新疆塔克
拉玛干沙漠的混合沙土样本经 8kGy γ 射线辐照，剂量
率为 140Gy /min，然后用生理盐水悬浮溶解，取上清液
涂布于 TGY 培养基上进行分离纯化(30℃、7 ～ 15d)。
1. 2. 2 菌株鉴定及培养基 将分离纯化的菌株用
TGY 液体培养基进行增殖培养。以 8000r /min 离心收
集菌体，按细菌基因组提取试剂盒提取菌株基因组
DNA，以细菌 16S rRNA 基因通用引物(上游引物为 5′-
GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;下 游 引 物 为 5′-
AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′)按 PCR 试剂盒操作
说明进行 16S rRNA 基因序列的扩增;PCR 产物经上
海生工生物技术公司测定，测序结果在 GenBank 上用
Blastn 进行同源性比对，获取同源序列，用 MEGA 4. 0
进行系统进化树的构建。参照文献［15］进行形态学
观察及生理生化特性测定，以微生物自动鉴定系统
(BIOLOG)GP2 检测板进行碳氮源的利用检测。
1. 3 胞外代谢产物提取及特性测定
1. 3. 1 胞外代谢产物提取 将试验菌株 RV113 接种
于液体 TGY 培养基中，30℃、200r /min、发酵培养 5d;
菌株发酵培养物经 8000r /min 离心处理，上清液用真
空旋转蒸发仪 65℃下浓缩 10 倍，浓缩液分别用正丁
醇、乙酸乙酯、正乙烷以 1 ∶ 1(V /V)进行萃取，回收萃
取物，45℃下真空浓缩干燥。
1. 3. 2 提取物对 UV 辐照下 E. coli JM109 的保护作
用测定 将 E. coli JM109 接种于 LB 培养基中，180r /
min、37℃恒温培养至对数生长期末期，8000r /min 离
心收集菌体，以生理盐水制备 8 ～ 10 × 107个 /ml 的菌
悬液，并向菌悬液中添加 RV113 菌株胞外代谢产物提
取物，使其终浓度为 0. 1g /L;取 5ml 菌悬液于 9cm 的
培养皿中，置 15W UV 紫外灯下 20cm 处振荡辐照处
理，每 10s 取样 1 次，以平板涂布法检测 E. coli JM109
的存活量;以未进行发酵培养的 TGY 培养基提取物为
对照。
1. 3. 3 提取物 UV 吸收特性测定 每 1L 离心处理液
所得的提取物以 20ml 正丁醇溶解，并以正丁醇调整紫
外扫描分析基线，对各正丁醇溶解物进行 UV 扫描分
析。
1. 3. 4 提取物抗氧化特性测定 参照文献以 1，1-二
苯基苦基苯肼(DPPH·)法对萃取物的抗氧化特性进
行测定［16，17］。以甲醇为溶剂配制 25μg /ml DPPH·溶
液，3. 9ml DPPH·溶液中加入 0. 1ml 正丁醇溶解液，
迅速混合，测定 5min 内 515nm 下混合物吸光值的变
化，以正丁醇为空白对照。
1. 3. 5 提取物的 TLC 层析分析 将提取物点样于
TLC 板上，以正丁醇 ∶ 乙酸 ∶ 水 = 4 ∶ 2 ∶ 1(V∶ V∶ V)为展
层剂，在 254、315nm 紫外灯下观察层析结果并回收荧
光斑点，以甲醇 ∶氯仿 = 1∶ 1(V∶ V)溶解，进行 UV 吸收
及抗氧化特性的测定。
2 结果
2. 1 菌株筛选与鉴定
从辐照处理过的土壤样本中分离到 1 株红色、表
面黏稠的球菌，编号 RV113。经测定，菌株 RV113 为
革兰氏阳性、无运动性，好氧，最适生长温度为 30℃，
最适生长 pH 为 7. 0，可以蔗糖、山梨醇、麦芽糖、半乳
糖、果糖、甘露糖、松三糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、糊
精、甘露醇、胱氨酸、脯氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸作
为唯一碳源，主要脂肪酸为 C16 :1ω7c (54. 3%)，
C16:0 (21. 0%)，C16:1ω9c (6. 0%)，主要醌为 MK-
8，基因组 DNA (G + C)mol%含量为 63. 8%。
以基因组 DNA 为模版，进行 16S rRNA 基因的扩
增，PCR 产物直接测序，获得 1498bp 的 16S rRNA 基因
片段，经 GenBank \ Blast 同源序列比对分析，其与目前
所报道的奇异球菌 (Deinococcus)同源性较高。从
GenBank 中获取奇异球菌属标准菌株 16S rRNA 基因
序列，进行同源进化分析，构建系统进化树，结果如图
1。结果显示，RV113 菌株隶属于奇异球菌属，与耐辐
射奇球菌(Deinococcus radiodurans)DSM 20539T 亲源
关系最近，同源相似性为 96. 7%，确定菌株 RV113 为
奇异球菌属新种。
2. 2 胞外代谢产物对 E. coli JM109 的 UV 辐射保护
作用
按 1. 3. 1 和 1. 3. 2 中所述的方法进行 RV113 菌
株的培养、胞外代谢产物的提取，并以乙酸乙酯为萃取
剂所获的提取物进行胞外代谢产物对 UV 辐射下 E.
coli JM109 的保护作用测定。结果(图 2)显示，添加菌
株 RV113 胞外代谢产物提取物对 UV 辐射下的 E. coli
JM109 存活率有较大的提高，说明菌株 RV113 胞外代
谢产物具有抵御 UV 损伤的作用。
2. 3 提取物 UV 吸收与抗氧化特性
将获得的胞外代谢产物提取物按 1. 3. 3 和 1. 3. 4
3711
核 农 学 报 24 卷
图 1 基于 16S rRNA 基因序列构建的
RV113 及相关菌株的系统进化树
Fig. 1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene
sequences showing the relationships of train RV113
and related Deinococcus species
所述方法进行 UV 吸收和抗 DPPH·自由基氧化特性
图 3 提取物对 UV 辐射的吸收光谱和清除自由基特性
Fig. 3 The character of absorption spectra and free radical scavenging of extracts
A-1:正已烷提取物紫外吸收光谱;A-2:正已烷提取物清除自由基特性;B-1:乙酸乙酯提取物紫外吸收光谱;B-2:乙酸乙酯提
取物清除自由基特性;C-1:正丁醇提取物紫外吸收光谱;C-2:正丁醇提取物清除自由基特性
A-1:absorption spectra of N-hexane extracts;A-2:free radical scavenging of N-hexane extracts;B-1:absorption spectra of ethyl acetate extracts;
B-2:free radical scavenging of ethyl acetate extracts;C-1:absorption spectra of butanol extracts;C-2:free radical scavenging of
butanol extracts
的测定，结果(图 3)显示，正已烷提取物对紫外线的吸
图 2 胞外代谢产物对 E. coli
JM109 抗辐射特性的影响
Fig. 2 The effect of extracellular metabolites on the
resistance of E. coli JM109 to UV radiation
E:对照;E-R:处理
E:control;E-R:treatment
收段主要在 UV-C(200 ～ 280nm)区间，乙酸乙酯和正
丁醇提取物吸收段主要在 UV-C 和 UV-B(280 ～
315nm);三者均有清除 DPPH·自由基的能力。
4711
6 期 耐辐射菌株筛选及其胞外代谢产物抗紫外辐射物质特性
图 4 不同的乙酸乙酯提取物组分对 UV 辐射的吸收光谱和消除自由基氧化特性
Fig. 4 The character of absorption spectra and free radical scavenging of
different fractions of ethyl acetate extract
E1-1:组分 E1 紫外吸收光谱;E1-2:组分 E1 清除自由基特性;E2-1:组分 E2 紫外吸收光谱;E2-2:组分 E2 清除自由基特性;
E1-1:absorption spectra of fraction E1;E1-2:free radical scavenging of fraction E1;E2-1:absorption spectra of fraction E2;
E2-2:free radical scavenging of fraction E2
图 5 正丁醇萃取物组分 B1、B2、B3 UV 辐射吸收和清除自由基氧化特性
Fig. 5 The character of absorption spectra and free radical scavenging of
different fractions of ethyl acetate extract
B1-1:组分 B1 紫外吸收光谱;B1-2:组分 B1 清除自由基特性;B2-1:组分 B2 紫外吸收光谱;B2-2:组分 B2 清除自由基特性;
B3-1:组分 B3 紫外吸收光谱;B3-2:组分 B3 清除自由基特性
B1-1:absorption spectra of fraction B1;B1-2:free radical scavenging of fraction B1;B2-1:absorption spectra of fraction B2;
B2-2:free radical scavenging of fraction B2;B3-1:absorption spectra of fraction B3;B3-2:free radical scavenging of fraction B3
5711
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2010，24(6):1172 ～ 1176
2. 4 抗辐射物质组分分析
利用 TLC 法对各种提取物进行初步分离，发现正
己烷提取物仅为 1 个组分，乙酸乙酯提取物获得 2 个
组分，标记为 E1、E2;正丁醇提取物获得 3 个组分，标
记为 B1、B2、B3。对乙酸乙酯和正丁醇分离的各组分
进行回收，分别进行紫外吸收及消除 DPPH·自由基
特性的测定，结果如图 4、图 5 所示。从测定结果上可
以看出，乙酸乙酯和正丁醇提取物经 TLC 分离为不同
的组分，各组分的紫外吸收光谱与清除 DPPH·自由
基特性呈现差异性。
3 讨论
自 1956 年 发 现 耐 辐 射 奇 球 菌 Deinococcus
radiodurans R1［18］以来，至今奇异球菌属已发现 41 个
种，其中部分菌株具有超强的 γ 辐射或 UV 辐射抗性，
是研究生物抗辐射特性重要的生物材料。对耐辐射奇
球菌的抗辐射机理研究主要集中于 DNA 的损伤修复、
抗氧化酶类和色素及特殊的细胞结构方面，而对胞外
代谢产物研究几乎无人问津［19 ～ 24］。
本试验以新分离的 1 株耐辐射菌 RV113 为研究
对象，利用正已烷、乙酸乙酯、正丁醇 3 个有机系统进
行胞外代谢产物的提取。胞外代谢产物对 E. coli
JM109 抗辐射特性的影响作用说明 RV113 菌株可在
胞外产生紫外辐射屏蔽物质，有效降低紫外辐射损伤
作用。
紫外光谱分为 3 个区段，UV-A(315 ～ 380nm)、
UV-B(280 ～ 315nm)和 UV-C(200 ～ 280nm)，其中 UV-
C 杀伤能力最强，常见于紫外光源灭菌灯等;UV-B 在
自然界中可大量到达地球表面，对生物体危害最大。3
种有机相提取物及其 TLC 分离物的紫外吸收光谱差
异性，说明 RV113 菌株可产生多种能吸收 UV-C、UV-
B 的胞外代谢产物，可有效抵御紫外线的直接损伤。
DPPH 自由基法是判断化合物体外消除自由基特
性的经典方法，以氮为中心的［DPPH·］在甲醇溶液
中较为稳定，其含量与吸光度呈线性关系，因此可以从
吸光度的变化观测其含量的变化。本文以 DPPH·自
由基法进行胞外代谢产物抗自由基氧化特性的测定，
虽未进行定量的检测，但在测定过程中呈现的吸光度
下降现象说明提取物可与［DPPH·］结合，使其在溶
液中的含量降低。因此，RV113 菌株的胞外代谢产物
具有抵御紫外线间接损伤的作用。
从目前所获得的试验数据分析，本试验所获得的
胞外抗紫外辐射物质不同于目前研究较多的类胡萝卜
类物质，也与目前所报道的一些菌株的抗辐射代谢产
物有所差异，但 RV113 代谢产物中紫外吸收与抗氧化
物是否相同、是否存在新结构化合物及其功能效价等
仍需深入解析，这也是本研究的下步重点。
此外，在目前所发现的 Deinococcus 属菌株中尚未
发现致病性菌株存在，这点预示 RV113 菌株可能在抗
紫外辐射物质及抗氧化剂开发研究上具良好的应用前
景。
参考文献:
［1 ］ Kramer G F，Ames B N. Oxidative mechanism of toxicity of low-
intensity near-UV light in Salmonella typhimurium［J］. J Bacteriol，
1987，169(5):2259 － 2264
［2 ］ O’Brian P A，Houghton J A. Photoreactivation and excision repair of
UV induced pyrimidine dimers in the unicellular cyanobacterium
Gloeocapsa alpicola (Synechocystis pee 6308) ［J］. J Photoche
Photobiol，1982，35(2):359 － 362.
［3 ］ Oppezzo O J，Pizarro R A. Sublethal effects of ultraviolet A radiation
on Enterobacter cloacae［J］. J Photochem Photobiol B:Biol，2001，
62(3):158 － 162
［4 ］ Em M， Teramura A H， The role of flavonol (lycosides and
carotenoids，in protecting soybean from ultraviolet-5 damage［J］.
Photoche Photobiol，1993，35(3):7 － 11
［5 ］ Eker Ap M，Kooiman P，Hessels Jk C E A. DNA photoreactivating
enzyme from the cyanobacterium Anacystis nidulans［J］. Bioi Chem，
1990，265(5):800 － 809
［6 ］ Stefan Borchert，Rolf-Dieter Petersen. Topical cosmetic composition
［P］. US 6，790，434 B2. 2004，9
［7 ］ 王洪媛 . 抗 UV-B 辐射菌 Pantoea agglomerans KFS-9 的选育及其
抗辐射机制的研究［D］. 中国海洋大学，2006
［8 ］ 王洪媛，江晓路，任 虹，梁晓婷，管华诗 . 抗 UV-B 辐射菌紫外吸
收代谢产物分析及其抗紫外辐射活性研究［J］. 中国海洋药物，
2006，25(4):1 － 5
［9 ］ 梁晓婷 . Pantoea agglomerans TCa_7 抗紫外辐射损伤作用的研
究［D］. 中国海洋大学，2006
［10］ 杨 桥，张晓玲，张 磊，代 俊，张俊祥，焦炳华 . 类胡萝卜素在
耐辐射奇球菌辐射抗性中的作用［J］. 生物化学与生物物理进
展，2009，36(6):715 － 721
［11］ 杨 桥，张俊祥，朱石桥，范成鹏，张珞珍，方呈祥 . 耐辐射奇球菌
抗辐射物质的研究［J］. 分析科学学报，2004，20(5):465 － 467
［12］ 邹颖颖，方呈祥，杨 桥，罗雪松，张 磊 . 新疆分离细菌的提取物
对 λ 噬菌体紫外诱导的抑制作用［J］. 中国病毒学报，2006，21
(5):499 － 505
［13］ Zhang H Y，Li X J，Gao N，et al. Antioxidants used by Deinococcus
radiodurans and implications for antioxidant drug discovery［J］. Nat
Rev Microbiol，2009，7(6):476 － 476
［14］ de Groot A，Chapon V，Servant P，Christen R，Saux M F，Sommer S，
Heulin T. Deinococcus deserti sp. nov.，a gamma － radiation －
tolerant bacterium isolated from the Sahara Desert［J］. Int J Syst
Evol Microbiol，2005，5(6):2441 － 2446
(下转第 1197 页)
6711