全 文 ：　文章编号 :100028551 (2001) 0320134207
辐照后转移时间对水稻体细胞愈伤
组织分化的影响
斯华敏1 　Vu Minh Hung1 ,2 　付亚萍1 　陈秋方3 　李西明1 　孙宗修1 3
(11 中国水稻研究所　浙江 杭州　310006 ;21Rice Breeding Dept . ,Cuu Long Delta Rice Research Institute ,Vietnam ;
31 浙江省农业科学院原子能研究所　浙江 杭州　310021)
摘　要 :用137 Csγ射线辐照 3 份籼稻 ( Oryza sativa L. subsp . Indica) 幼穗诱导的愈伤组
织 ,研究了辐照剂量、辐照后转移时间对愈伤组织褐化率与分化率的影响。结果发现
除了基因型和辐照剂量有明显作用之外 ,辐照后转移时间也有重要作用。辐照后延
迟转移时间会不同程度提高褐化率 ,而存活的愈伤组织的分化率却有一定的提高。
辐照后 48h 转移愈伤组织的效果优于辐照后 24h 转移愈伤组织的效果。讨论了扩大
γ射线辐照愈伤组织的应用范围的可能性。
关键词 :水稻 ;137 Csγ辐照 ;组织培养 ;分化
收稿日期 :1999205217
资金项目 :本研究得到国际原子能机构 ( IAEA)的资助 (项目编号为 VIEΠ5Π013)
作者简介 :斯华敏 (1957～) ,女 ,浙江杭州人 ,中国水稻所实验师 ,从事生物技术研究3 联系作者
在植物组织培养过程中 ,用较高剂量的γ射线辐照愈伤组织可扩大变异 ,而低剂量的γ射
线辐照可提高愈伤组织的分化率 ,因此 ,在有条件的地方 ,已把组织培养与辐照技术相结合作
为重要的研究手段[1 ] 。据报道 ,早期的研究 (Holsten 等 ,1965) 曾从经 2Mrad 的γ射线辐照过的
2 %蔗糖溶液中分离出一种具拟辐射作用的白色结晶 ,后来的研究认为辐射过的糖会抑制花
粉、根和愈伤组织的生长 ,并可引起染色体畸变[2 ] 。由于辐照会使培养基发生化学变化并转而
影响愈伤组织的存活和分化 ,因此目前都采用将辐照过的愈伤组织立即转移到新鲜培养基的
方法以避免辐照对愈伤组织的不利影响。但是基于辐射装置费用和环境安全等原因 ,目前只
有若干生物学 (农学)及物理学研究中心才建有辐照中心 ,而多数生物学与农学研究单位距辐
射中心甚远 ,例如越南的湄公河三角洲水稻研究所 (CLRRI) 与越南的原子能辐射中心相距数
百公里。这样 ,要在辐照的当天把愈伤组织转到新的培养基上是不现实的 ,从而大大限制了应
用γ射线辐照愈伤组织的实际应用。
至今为止 ,有关从辐照到愈伤组织转移的间隔时间对愈伤组织分化率的影响的研究却鲜
有报道。为了探讨异地辐照愈伤组织的可行性 ,我们选用 3 个籼稻品种的幼穗愈伤组织 ,经不
同剂量的137 Csγ射线辐照后 ,间隔不同的时间转到分化培养基上 ,观察成苗率的差异。结果表
明辐照后延迟转移时间会不同程度提高褐化率 ,而存活愈伤组织的分化率却有一定的提高。
431　 核 农 学 报　2001 ,15 (3) :134～140Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
辐照后 48h 转移愈伤组织的效果优于辐照后 24h 转移愈伤组织的效果。
1 　材料和方法
111 　材料
籼稻中选 9721、121 和 228 种在中国水稻研究所试验区 ,常规管理。秋季选取处于幼穗分
化第 2～3 期时的主茎 (长约 1～3 cm) ,用 70 %酒精棉球擦拭剑叶和倒 2 叶片 ,保湿置于 8 ℃冰
箱内作为期 3d 的低温预处理。
112 　愈伤组织的诱导
外植体相继在 011 %升汞和 3 %双氧水中灭菌 20min 与 10min 后 ,用无菌水漂洗 3 次 ,剥出
幼穗。把幼穗剪成约 1mm 长的切段 ,接种在添加了 2 ,42D 015 mgΠL、NAA 410mgΠL、BA 015mgΠ
L、蔗糖 3 %的 MS 固体培养基[3 ]上。25 ℃黑暗培养 2～3 周。
113 　愈伤组织的辐照
当愈伤组织长到 2～5mm 大小时 ,连同试管送到浙江省农科院原子能研究所进行γ射线
辐照。辐照剂量为 0、10、20 和 40Gy ,辐射源为137 Cs ,剂量率为 011GyΠmin。
114 　愈伤组织的分化
辐照后立即返回中国水稻研究所 ,按基因型将试管随机均分为 3 份 ,分别在当时、第 24h
和第 48h 把愈伤组织转移到分化培养基上。为防止光修复 ,愈伤组织在转分化前遮光运输和
黑暗保存。分化培养基为添加了 NAA 015mgΠL、BA 210mgΠL、蔗糖 2 %的 N6 固体培养基[4 ] 。每
支试管接 4 块愈伤组织 ,每处理 10～20 管。愈伤组织置于 25 ±1 ℃的光照条件下 (光强为 2000
～2500 Lux ,每天照光 14h)培养 ,以不辐照的愈伤组织作为对照。定期观测愈伤组织的生长和
分化情况。
2 　结 　果
211 　辐照剂量与转移愈伤组织的时间对愈伤组织褐化率的影响
愈伤组织转到分化培养基上之后 ,有一部分会褐化死亡。图 1 比较了不同剂量的γ射线
辐照后立即转移到分化培养基上的愈伤组织褐化情况。由图 1 可见 ,随着时间的推移 ,所有处
理愈伤组织的褐化率都有所增加。不同基因型对辐照剂量的反应不同。与对照相比 ,121 的
愈伤组织经 10～20Gy 的γ射线辐照后可降低褐化率 ,228 的愈伤组织只有受较低剂量 (10Gy)
的辐照后褐化率才有明显下降 ,而 9721 的愈伤组织受到辐照后褐化率均高于对照。但 3 个基
因型表现出一个共同的特点 ,即同一基因型的不同处理之间 ,愈伤组织褐化率在 3 周内基本相
似 ,从第 4 周起开始出现明显差异。
基于以上观察 ,比较了辐照后不同时间转移的愈伤组织在第 4 周时的褐化率 (表 1) 。由
表 1 可见 ,辐照后立即转移愈伤组织能使褐化率控制在最低水平 ,延迟转移时间会不同程度提
高褐化率。从表 1 中还可见到一个有趣的现象 :辐照后 48h 转移的愈伤组织褐化率反而比辐
照后 24h 转移的愈伤组织褐化率低 ,在可比较的 9 对数据中 ,除了 1 对数据 (10Gy 的γ射线辐
照 121 的愈伤组织)之外 ,其余 8 对都表现出这一趋势。
531　2 期 辐照后转移时间对水稻体细胞愈伤组织分化的影响
图 1 　辐照后立即转移的愈伤组织的褐化率
Fig. 1 　Effect of irradiation on callus browning frequency
(The calli were immediately transferred to regeneration medium afterγ2radiation)
212 　辐照剂量与转移愈伤组织的时间对愈伤组织分化率的影响
愈伤组织转到分化培养基后 ,10d 就有绿苗分化。图 2 是辐照后立即转到分化培养基的
愈伤组织在 45d 内的分化动态。从图 2 可见 ,随着时间的推移 ,绿苗分化率随之提高 ,但上升
速率不同 ,而且辐照后分化的绿苗在后期会发生死苗。基因型之间的差异非常大 ,主要表现在
两方面 :11 分化频率相差很大。以对照为例 ,121 的分化率仅 13175 % ;而 9721 的分化率高达
85142 %。21 辐照剂量对分化率的影响不同。9721 的愈伤组织经γ射线照射后 ,分化率显著下
降 ,10Gy 和 20Gy 辐照后的分化率约 50 %左右 ,40Gy 辐照后仅 23121 %。而 10Gy 的γ射线照射
使 228 和 121 的愈伤组织分化率明显提高 ,对于 121 而言 ,20Gy 的辐照也使愈伤组织的分化率
一度超过对照。尽管辐照对分化率的影响因基因型而异 ,然而有一点是一致的 ,即 40Gy 的辐
照抑制愈伤组织的分化。
631 核　农　学　报 15 卷
表 1 　辐照后不同时间转移的愈伤组织在第 4 周时的褐化率
Table 1 　Effect of irradiation dose and interval between irradiation and
callus transfer on the browned callus frequency ( %)
辐照剂量
dose ( Gy)
转移时间
interval (h)
228 9721 121
0 0 33. 33 16. 67 66. 25
0 12. 50 26. 79 54. 17
10 24 33. 33 80. 77 68. 75
48 31. 25 57. 14 81. 25
0 43. 75 25. 0 47. 22
20 24 55. 00 75. 00 72. 50
48 37. 50 41. 07 45. 00
0 36. 36 48. 21 81. 25
40 24 68. 75 75. 00 80. 26
48 64. 58 44. 64 67. 50
　　注 :愈伤组织转移到分化培养基后第 4 周未进行数据统计。
Note :The data were calculated at the end of the 4 week after calli were transferred to regeneration medium.
　
图 2 　辐照后立即转移的愈伤组织的分化率
Fig. 2 　Effect of irradiation on callus regeneration frequency based on total calli
(Calli were immediately transferred to regeneration medium afterγ2radiation)
　　表 2 比较了辐照后转移的时间对分化的影响。由表 2 可见 ,辐照后 24h 转移的愈伤组织
分化率普遍下降 ,而 48h 后转移的愈伤组织分化率又有不同程度的回升。尤其当辐照剂量较
高时 (20～40Gy) ,分化率可以达到或超过相同剂量辐照后立即转到分化培养基上的愈伤组织
分化率 ,个别处理 (如 228 和 121 的愈伤组织经 20Gy 辐照后 48h 转移) 的分化率甚至比不辐照
731　2 期 辐照后转移时间对水稻体细胞愈伤组织分化的影响
的对照还高。
考虑到不同处理的愈伤组织褐化率的差异 ,进一步以存活的愈伤组织为基数计算了分化
率 (表 3) 。结果发现存活的愈伤组织分化率普遍较高 ,例如 9721 有 2Π3 的存活愈伤组织分化
(59 %～91 %) ,即使属于分化率较低的 121 ,也有约 1Π3 以上存活的愈伤组织分化成苗 (27 %～
78 %) 。但是辐照后立即转移的愈伤组织分化率都明显低于不辐照的对照 ,而且表现出随着辐
照剂量的加大分化率下降的趋势 (图 3) 。比较辐照后不同时间转移对存活愈伤组织的影响 ,
发现延迟转移反而提高分化率。除个别处理外 ,辐照后 24h 转移的愈伤组织与辐照后立即转
移的相比 ,分化率持平或有所提高 ;辐照后 48h 转移的愈伤组织与另 2 个处理相比 ,分化率均
有明显提高。提高幅度最大的为 20Gy。辐照后 48h 转移的处理 ,分化率与对照持平 ( ±6 %)或
超过对照 ( + 21 %) ,与同剂量辐照后立即转移的处理相比 ,分化率提高了 20 %～40 %。然而由
于褐化率的变化峰值出现在辐照 24h 后转移的处理中 ,因此辐照后不同时间转移对存活的愈
伤组织分化率与以愈伤组织总数为基数的分化率的变化趋势并不一致。
表 2 　辐照后不同时间转移对愈伤组织分化率的影响 3
Table 2 　Effect of irradiation dose and interval between irradiation and
callus transfer on the regeneration frequency ( %)
辐照剂量
dose ( Gy)
转移时间
interval (h)
228 9721 121
0 0 52. 78 85. 42 13. 75
0 66. 67 48. 21 19. 44
10 24 54. 17 9. 62 12. 50
48 58. 33 39. 29 8. 75
0 35. 42 55. 36 15. 28
20 24 30. 00 15. 38 13. 75
48 62. 50 55. 36 37. 50
0 29. 55 23. 21 10. 00
40 24 14. 58 20. 83 3. 95
48 16. 67 42. 86 12. 50
　　注 :转分化后第 45 天的数据
Note :The data were calculated at the 45 th day since calli were transferred to regeneration medium.
图 3 　辐照后立即转移的愈伤组织在第 45 天时存活愈伤组织的分化率
Fig. 3 　Callus regeneration frequency of survival calli on the 45th day after theγ2irradiation
(Calli were transferred immediately to regeneration medium after radiation)
831 核　农　学　报 15 卷
3 　讨 　论
离体辐照在农作物的品种改良上有重要的应用前景。关于基因型和辐射剂量对愈伤组织
分化率的作用 ,前人已有大量报道。自从 Holsten 报道培养基受 2Mrad 的γ射线辐照 ,糖会变
成二聚体对愈伤组织产生负面影响后 ,虽然通常愈伤组织接受辐照的剂量远低于 2Mrad ,但是
愈伤组织辐照后立即转移已成为水稻、大麦、小麦等离体辐射的基本做法[5～7 ] 。前人已注意到
愈伤组织经低剂量γ射线照射后会提高分化率 ,而高剂量的γ射线照射后会使分化率下降[6 ] ,
但未作进一步的分析。有关转移时间对愈伤组织的影响更鲜有报道。我们以 3 个籼稻为材
料 ,研究了愈伤组织辐照后间隔不同时间转移到分化培养基上对愈伤组织存活与分化的影响。
结果发现愈伤组织辐照后的分化率受基因型、辐射剂量与转移时间等多方面的影响。我们将
辐照后的愈伤组织分解为褐化的与存活的两类 ,发现即使辐照剂量高达 40Gy ,存活的愈伤组
织仍有较高的分化率。这提示如果在辐照时或辐照后采取适当防护措施降低愈伤组织的死亡
(褐化)率 ,就有可能保持和提高愈伤组织分化率。我们的结果表明 ,就所研究的基因型和所采
用的辐照剂量而言 ,辐照后立即转移愈伤组织能使褐化率控制在最低水平 ,也就是说愈伤组织
的成活率最高。从这个意义上说 ,辐照后及时转移愈伤组织是保证分化率的重要措施之一。
表 3 　辐照后不同时间转移对存活的愈伤组织分化率的影响
Table 3 　Effect of irradiation dose and interval between irradiation and
callus transfer on the regeneration frequency based on survival calli ( %)
辐照剂量
dose ( Gy)
转移时间
interval (h)
228 9721 121
0 0 82. 61 97. 62 57. 89
0 74. 42 84. 38 42. 42
10 24 76. 47 71. 43 52. 63
48 80. 00 88. 00 46. 67
0 62. 96 72. 09 36. 67
20 24 63. 16 88. 89 64. 71
48 88. 24 91. 18 78. 95
0 41. 94 59. 09 42. 11
40 24 41. 18 66. 67 27. 27
48 50. 00 82. 76 58. 82
　　　　注 :转分化后第 45 天的数据
Note :The data were calculated on the 45 th day since calli were transferred to regeneration medium.
根据电离辐射的原理 ,生物体受γ射线照射后 ,能在一定范围内通过修复与修补 ,缓解乃
至消除辐照引起的损伤[8 ] 。胡天赐等以小麦成熟胚愈伤组织为材料 ,观察辐照后 6d 和 12d 愈
伤组织的超微结构的变化 ,认为低剂量 (500R) 的电离辐射损伤是可以修复的[6 ] 。还有一些报
道认为 ,适宜剂量的γ射线辐照可以提高愈伤组织分化率 ,其机理目前尚不清楚 ,可能是适宜
剂量的γ射线辐照刺激了愈伤组织内某种化学物质的形成和亚显微结构的改变 ,有利于细胞
的分裂[9 ,10 ] 。我们的结果表明 ,延迟转移时间会不同程度提高存活愈伤组织的分化率 ,尤其是
辐照后 48h 转移的愈伤组织的反应普遍优于辐照后 24h 转移的愈伤组织 ,其中部分处理的综
合结果 (分化的愈伤组织Π辐照的愈伤组织) 比辐照后立即转移的对照还要好。这一现象提示
愈伤组织辐照后的修复可能需要“安静”和一定的时间 ,而修复并存活的愈伤组织具有良好的
931　2 期 辐照后转移时间对水稻体细胞愈伤组织分化的影响
分化潜力。虽然这是一个有待验证的假设 ,但现象本身已为扩大离体辐照的应用范围 ,特别是
异地辐照的可行性提供了有力的实证。
致谢 :中国水稻研究所严学强先生和胡培松先生提供实验用的水稻材料 ,谨致谢意。
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THE EFFECT OF TRANSFER TIME AFTER IRRADIATION ON THE REGENERATION OF
CALLI ( Oryza sativa L . subsp. Indica)
SI Hua2min1 　VU Minh Hung1 ,2 　FU Ya2ping1 　CHEN Qiu2fang3 　LI Xi2ming1 　SUN Zong2xiu1
(11 Chinese Rice Reasearch Institute , Hangzhou , Zhejiang prov . 310006 ;21 Rice Breeding Dept . Cuu long Delta Rice Reasearch Institute ,
Vietnam ;3. Institute of Application of Atomic Energy , Zhejiang Academy of Agricultural Sciences , Hangzhou , Zhejiang prov. 310021)
ABSTRACT :The immature influorence2induced calli( Oryza sativa L. subsp. Indica) were irradiat2
ed with 137 Csγray and transferred to regeneration medium after different interval . Besides geno2
type and irradiation dose , the effect of interval between irradiation and callus transfer on the
browned callus frequency and plant regeneration rate were also obvious. Transfer delay increased
the browned callus frequency , while the regeneration frequency of the survival calli improved at
certain degree at the same time especially for those calli which were transferred at the 48th hour
after irradiation. The potential of widening application of in vitro irradiation was discussed.
Key words :137 Csγ2ray irradiation ; calli ; regeneration ; rice
041 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2001 ,15 (3) :134～140