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玉米小孢子胚胎发生启动的超微结构观察
齐延芳 3 　宋建成　姜丽君　杨景成　王启柏
(山东农业大学　泰安　271018)
利用透射电镜观察了玉米花药培养过程中小孢子胚胎发生启动的超微结构特
征 ,发现培养 1d 的小孢子细胞器丰富 ,核仁、核膜清晰 ;培养 3d 后 ,开始进行第 1 次
有丝分裂。不均等分裂以后即在生殖核的外围产生细胞壁 ,有的线粒体、质体以缢缩
方式增殖 ,表明营养细胞处于代谢活跃状态 ,有可能进一步发育 ,按营养细胞途径形
成胚状体或愈伤组织。
关键词 :玉米小孢子胚胎 　超微结构观察
此文于 1997 年 9 月 12 日收到
本研究为国家自然科学基金项目和农业部“八·五”攻关项目3 现工作单位 :山东省农业科学院原子能所
自从 1975 年谷明光等首次获得玉米花粉植株[1 ]以来 ,国内外学者利用花药离体培养方法
在快速获得玉米纯系、缩短育种年限方面取得较大进展[2 ,8 ,9 ] ,对于小孢子胚胎发生的细胞形
态学特征也进行了一定研究。在此基础上 ,国内外研究者在电镜下对许多植物的小孢子胚胎
发生进行了观察[3 ,4 ,6 ,10 ] ,不同程度地报道了孢子体分裂启动过程中的超微结构特征。但是由
于玉米花粉胚诱导频率相当低 ,而超微结构观察要求大量启动和分裂的小孢子 ,因此 ,这方面
的研究进展缓慢。目前 ,现有的易诱导基因型和较成熟的培养方法为此项工作提供了有利条
件 ,本文就我们的研究结果报道如下。
1 　材料与方法
供试材料为高诱导率杂交种 A3 ×A12 - 2 。严格镜检选择花粉发育为单核靠边期的花药接
种在改良“玉培”培养基上 ,经 7 ℃低温预处理 14d 后 ,转到 28 ℃下暗培养 14d ,然后转到弱光
下培养 7d ,再采用微胚早期转移的方法[5 ] ,将新鲜培养物转到分化培养基上进行分化培养。
接种后每隔 24h 取样 ,用醋酸洋红压片镜检 ,选取离体小孢子第 1 次启动分裂前后的花
药 ,用戊二醛2锇酸双固定 ,酒精系列脱水 ,环氧丙烷置换 , Epon2812 包埋。包埋块先在 Re2
ichert2J ung 半薄切片机上进行半薄切片 ,切片厚度 1～2μm , TBO 染色 ,光镜观察、定位 ,再用
L Kb - 7800 型超薄切片机切片 ,醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色 ,在 J EM21200EX 透射电镜下观
察、照相。
2 　结果与分析
211 　即将进行孢子体分裂的小孢子特征
单核后期的离体花药经 7 ℃低温预处理 14d ,再于 28 ℃条件下诱导培养 24h ,小孢子胚胎
07　 核 农 学 报　1999 ,13 (2) :70～74Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
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发生即已启动。在透射电镜下 ,其核仁、核膜清晰可见 ,在核周围分布丰富的线粒体、质体、内
质网、核糖体等细胞器。其中线粒体的内嵴比较整齐 ,有的正以缢缩方式增殖 ,部分质体出现
淀粉粒。中央大液泡消失 ,只有小的液泡存在于细胞质中 (图版 Ⅰ21) 。这些特征表明细胞处
于活跃的代谢状态 ,为第 1 次有丝分裂的进行提供物质和能量基础。花药壁绒毡层细胞的细
胞质电子密度极低 ,只存在一些小的退化碎片 ,细胞核也已变形 (图版 Ⅰ22) ,处于逐步解体过
程中。说明绒毡层细胞在培养早期就退化了。宋佩伦等[1 ]在水稻的花药培养中认为 ,绒毡层
细胞与花粉的诱导无直接关系 ,起诱导作用的大概主要是药壁中层细胞。本研究对绒毡层超
微结构观察结果也说明绒毡层与胚状体的发生与发育没有关系。
17　2 期 玉米小孢子胚胎发生启动的超微结构观察
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图版 Ⅰ
vN :营养核 ,gN :生殖核 , Ta :绒毡层 ,M2L :中层 ,M :线粒体 ,P :质体 ,Va :液泡 , ER :内质网 ,S :淀粉粒 ,CW :细胞壁 ,pW :
花粉壁 ,N :细胞核
11 细胞器丰富 ,即将进行分裂的小孢子　×5 ,000
21 退化绒毡层细胞 ( Ta) 　×3 ,000
31 脱分化启动完成后趋于退化的小孢子　×1 ,000
41 同上 ,长箭头示结构不好的核腊 ,短箭头示细胞质中的空化区域　×3 ,000
51 同上 ,示变形退化质体 ( P) 　×5 ,000
61 核贴近壁的退化小孢子 ,示退化碎片　×7 ,500
71 培养 3d ,不均等分裂的小孢子 ,示生殖核细胞壁　×11 ,250
81 培养 3d ,在靠近花粉壁的位置分裂形成二细胞　×11 ,250
91 图 7 中 ,营养细胞细胞器放大　×10k
27 核　农　学　报 13 卷
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Plate Ⅰ
vN :Vegetative nucleus , gN : Generative nucleus , Vc : Vegetative cell , Gc : Generative cell , Ta : Taptum , M2L : Middle layer ,
M :Mitochondrion , P : Plastid , Va :Vacuole , ER : Endoplasmic reticulum , S :Starch , CW :Cell wall , PW : Pollen wall , N :Nucleus.
1. Microspore with numerous organelles just before division. ×5 ,000
2. Degenerating taptum cell. ×3 ,000
3. Microspore which has finished dedifferentation is about to degenerate. ×1 ,000
4. Same as above , the disintegrated nucleus membrane is pointed out by long arrow and the region with few organelles by short
arrow. ×3 ,000
5. Same as above , showing the deforming and degenerating plastid. ×5 ,000
6. Degenerating microspore with nucleus attaching to the intine , showing degeneration segments(arrow) . ×7 ,500
7. Microspore with asymmetric division 3 days after culture , showing cell wall of the generative nucleus (arrow) . ×11 ,250
8. Two cells close to the pollen wall are formed 3 days after culture. ×11 ,250
9. The Organelles of vegetative cytoplasm. ×10k
212 　小孢子第 1 次有丝分裂后的超微结构特征
培养 3d 时 ,许多小孢子已经完成了第 1 次有丝分裂 ,图版 Ⅰ27、8 为观察到的不均等分裂
形式 ,有时分裂面与萌发孔的位置相垂直 (图版 Ⅰ27) ,形成的两个子细胞与萌发孔几乎在一条
直线上 ;有时小孢子分裂面与萌发孔相对的细胞壁切线相垂直 ,形成两个靠壁的子细胞 (图版
Ⅰ28) 。此次分裂最明显的特征是分裂之后即在生殖核的外围形成新壁。不均等分裂形成的
两个子细胞的细胞质和细胞核有明显区别 ,生殖核较营养核体积小 ,电子密度高。生殖细胞的
细胞器较营养细胞少 ,在生殖细胞的细胞壁与营养细胞的核膜之间分布着许多质体。营养细
胞的线粒体、质体、内质网、核糖体等细胞器丰富 (图版 Ⅰ29) ,有的线粒体、质体正以缢缩方式
增殖 ,还有的质体含有淀粉粒。这些特征表明 ,营养细胞处于代谢活跃状态 ,有可能进一步发
育 ,形成胚状体或愈伤组织。
213 　退化小孢子的超微结构特征
培养 3d 时 ,观察到有的小孢子的细胞核脱离花粉壁 ,似乎完成了脱分化的启动 (图版 Ⅰ2
3 ,4 ,5) ,但是核膜结构不完整 ,核质电子密度极低 ,细胞质中有许多空白区 ,只在与萌发孔相对
的区域具有线粒体、退化质体 ,而没有内质网。由此可见 ,完成脱分化启动的小孢子在第 1 次
有丝分裂之前也有退化的可能。另一种退化细胞比较容易识别 ,这种细胞虽然核质电子密度
较高 ,但从超微结构上可以看出 ,细胞器极少 ,只有少许线粒体和质体 ,细胞质内分布着许多碎
片状物质 ,可能是细胞器裂解的产物 (图版 Ⅰ26) 。如果进一步研究揭示这两种细胞退化的原
因 ,就可以从抑制退化的角度来提高花粉胚胎发生的诱导频率。
3 　讨 　论
Dunwell 等[7 ]在用电镜研究烟草花药培养时发现 ,大约经历诱导期一半的时间 ,胚胎发生
的花粉中出现明显的溶酶区 ,随着时间的推移溶酶区逐渐扩大 ,许多细胞器结构退化 ,导致细
胞质中出现大片空化区域。一旦营养细胞发生第 1 次孢子体分裂 ,细胞器又很快重新构建 ,并
认为这种细胞器重组是清除配子体世代的影响而转向孢子体发育的先决条件。而本研究中观
察到的脱分化小孢子 ,绝大多数细胞器丰富、代谢活跃 ,细胞核由靠近花粉壁的位置移向细胞
中央 (图版 Ⅰ21) ,尽管也有少数小孢子整体结构完善、细胞器稀少、质体呈退化状态、细胞核也
37　2 期 玉米小孢子胚胎发生启动的超微结构观察
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脱离了花粉壁 (图版 Ⅰ23～5) ,但由于这种小孢子是在培养 3d 后观察到的 ,与同时期脱分化小
孢子存在明显的差异 ,因此认为这种小孢子正处在败育过程中。也就是说 ,花粉细胞脱分化启
动可能并不进行细胞质和细胞器的解体和重组过程。
由于超薄切片操作原因和观察细胞数目的限制 ,未能对生殖细胞分裂途径和均等分裂方
式进行探讨 ,这有待于进一步深入研究。
参 　考 　文 　献
1 　中科院遗传所组织培养室 ,诱导玉米花粉植株的初步研究 1 遗传学报 ,1975 ,2 (2) :138～142.
2 　北京海淀区东北旺公社试验站 1 玉米花药培养的研究初报 1 植物学报 ,1975 ,18 (2) :180～181.
3 　孙敬三 ,等 1 小麦离体花药中小孢子分裂的电子显微镜观察 1 植物学报 ,1983 ,25 (4) :295～299.
4 　滕俊琳 ,等 1 水稻花培愈伤组织在分化条件下的超微结构变化 1 浙江农业大学学报 ,1994 ,20 (1) :57～52.
5 　姜丽君 ,等 1 微胚早期转移及染色体早期加倍技术对提高玉米花药培养效率的作用 1 植物花培育种进展 1 北京 :中国
农业科技出版社 11996 ,249～253.
6 　B. Barnabas , et al. Ultrastructural studies on pollen embryogenesis in maize ( Zea mays L . ) . Plant Cell Reports , 1987 ,6 :212
～215.
7 　Dunwell J M , et al. Pollen ultrastructural in anther cultures of Nicotiana tabacum. Ⅱ:changes associated with embryogenesis.
J Exp Bot . 1974 , 25 :363～373.
8 　Petolino J F , et al. Anther culture of elite genotypes of maize. Crop Science , 1986 , 26 (5) :1072～1074.
9 　Sarah L , et al. Barley anther culture :pretreatment on mannital stimulates production of microspore2derived embryos. Plant
Cell , Tissue and Organ Culture. 1990 , 20 :235～240.
10 　Sangwan2Norreel BS. Cytochemical and ultrastructural peculiarities of embryogenic pollen grains and of young androgenic em2
bryos in Datura innoxia. Can J Bot . 1978 , 56 :805～817.
11 　Sun PL , et al. The induction effect of somatic tissue in the anther cultured i n vit ro on androgenesis and its control in :proceed2
ings of symposium on plant tissue culture. Science Press , Beijing , China , 1978 , 143～148.
ULTRASTRUCTURE OBSERVATION OF MAIZE MICROSPORIC EMBRYOGENESIS
Qi Yanfang 　Song Jiancheng 　J iang Lijun 　Yang Jingcheng 　Wang Qibo
( S handong A gricut ural U niversity , Taian 　271018)
ABSTRACT
To study the mechanism of maize microsporic embryogenesis the ultrastructural features
were observed. The microspores which had f inished dedifferentiation contained numerous or2
ganelles and clear nucleol i af ter one day of incubation. The f irst division occured 3 days after in2
cubation. Cell walls around the generative nuclears formed following asymmetric divisions. The
vegetative cytoplasm had more organelles and the f issions of some plastids and mitochondria
through the ways of constriction were also observed. This indicated that vegetative cell was in
active metabol ic status and probably would divide to develop embryoids or callus.
Key words :Maize microsporic embryogenesis , ult rast ructure observation
47 Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1999 ,13 (2) :70～74