全 文 ：核 农 学 报 2010，24(3):507 ～ 512
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2010)03-0507-06
收稿日期:2009-08-29 接受日期:2009-12-04
基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目(nyhyzx2007-1-01)，国家科技支撑计划项目(2008BADB3B03)
作者简介:赵金梅(1977-)，女，内蒙古巴彦淖尔人，博士，助理研究员，从事牧草抗逆遗传育种和分子生物学研究。E-mail:zhaojinmei3276@
126. com
紫花苜蓿组织培养体系的建立
赵金梅 李 芳2 周 禾3 孙启忠1 毕 静2
(1. 中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特 010010;
2. 内蒙古农业大学环境生态学院，内蒙古 呼和浩特 010018;
3. 中国农业大学动物科技学院，北京 100193)
摘 要:通过外植体类型、生长素和细胞分裂素浓度等因素对紫花苜蓿愈伤组织诱导、分化影响的试验，
建立了高效的紫花苜蓿组织培养体系，即以真叶为外植体，在 MS + 0. 2mg /L 2，4-D + 0. 01mg /L NAA +
0. 2mg /L KT 培养基上进行愈伤组织的诱导，诱导率可达到 100%，愈伤组织继代 2 ～ 3 次，然后在 MS 培
养基上分化，分化率可达 90%。分化苗转入 1 /2MS 培养基进行生根，形成完整的组培苗。愈伤组织诱
导的正交试验表明，2，4-D 浓度是影响苜蓿愈伤组织诱导率的主要因素，其次是外植体类型、NAA 浓度、
6-BA 浓度和 KT 浓度;对苜蓿愈伤褐化率影响较大的因素是外植体类型，其次是 KT、2，4-D、6-BA、NAA
浓度。外植体类型对愈伤组织诱导率和褐化率的影响均达到极显著水平(P < 0. 01);生长素(2，4-D、
NAA)对苜蓿愈伤组织的诱导作用大于细胞分裂素(6-BA、KT)。分化试验表明，紫花苜蓿愈伤组织分
化的主要决定因素是愈伤诱导培养基的激素配比。
关键词:紫花苜蓿;愈伤组织诱导;愈伤组织分化
ESTABLISHMENT OF ALFALFA TISSUE CULTURE SYSTEM
ZHAO Jin-mei1 LI Fang2 ZHOU He3 SUN Qi-zhong1 BI Jing2
(1. Grassland Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Huhhot，Inner Mongolia 010010;
2. Ecology and Environment College，Inner-Mongolia Agriculture University，Huhhot，Inner Mongolia 010018;
3. College of Animal Science and Technology，China Agricultural Univeristy，Beijing 100193)
Abstract:The high efficiency alfalfa regeneration system was established by studying the influence of explants type，
auxins and cytokinins concentration on alfalfa callus induction and differentiation in the experiment. The system was that
alfalfa callus were induced on MS + 0. 2mg /L 2，4-D + 0. 01mg /L NAA + 0. 2mg /L KT from leaf;callus was subcultured
2 ～ 3 times and then transferred to MS media for shoot development;and transferred to 1 /2 MS media for roots
formation. In the alfalfa culture system，callus induction rate could reach 100% and differentiation rate 90% . The
orthogonal experiment of callus induction showed that the major factor on alfalfa callus induction ratio was 2，4-D
concentration，the next were explants type，NAA，6-BA and KT concentration. And the factors on alfalfa callus
browning rate in the experiment ordinally were explants types，KT，2，4-D，6-BA，NAA. Explants types were
significantly effect on callus induction rate and browning rate (P < 0. 01). Auxins (2，4-D and NAA)had greater effect
on alfalfa callus induction than cytokinins (6-BA and KT). The shoot development experiment showed that the hormone
component of callus induction media was the determinant factor of alfalfa callus differentiation.
Key words:alfalfa;callus induction;callus differentiation
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核 农 学 报 24 卷
紫花苜蓿(Medicago stiva L.)是一种高产优质的
多年生豆科牧草，从我国汉朝开始种植，具有 2000 多
年的种植历史，现在全世界广泛种植，已成为美国最重
要的作物之一。在我国，紫花苜蓿也是主要栽培牧草，
是我国农业种植结构中重要的组成部分。紫花苜蓿具
有生物固氮的功能，其植株的蛋白含量一般在 18%以
上，同时由于再生能力强，一年可以收割多次，能连续
多年高产。种植紫花苜蓿是解决当前畜产品质量和生
态环境问题的一个有效途径。苜蓿组织培养的研究在
豆科牧草中相对较多［1，2］，但豆科植物普遍存在体外
再生和转化难，基因型差异大的情况［3，4］，因此限制了
转基因技术在改善苜蓿抗旱、抗寒、抗病虫害以及产
量、质量等方面的应用。本研究在众多研究的基础上，
以紫花苜蓿品种中苜二号为材料，研究外植体类型、激
素浓度对紫花苜蓿愈伤诱导、分化的影响，希望建立高
效的组织培养体系，为紫花苜蓿转基因育种奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
试验材料为紫花苜蓿品种中苜二号，种子由中国
农业科学院北京畜牧兽医研究所杨青川老师和康俊梅
老师提供。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 无菌苗的培养 采用成熟种子，在超净工作台
用 75%酒精浸 60s，再用 0. 1% 升汞溶液浸 6 ～ 8min，
最后用无菌水冲洗 4 ～ 5 次。灭菌后将种子接种到 MS
固体培养基上，每三角瓶接 30 粒。培养条件为光周期
16h，光照强度 2000lx，昼夜温度 25℃ /18℃。
1. 2. 2 外植体来源 愈伤组织诱导:取萌发约 7d 的
中苜二号无菌苗，将其下胚轴、子叶切成约 1cm 长的
小段;取萌发约 15d 的中苜二号的茎、真叶切成约
0. 5cm 宽的小片，根据试验设计分别接种至不同激素
配比的培养基上。培养条件同 1. 2. 1，每隔 12d 继代 1
次。
愈伤组织分化:以愈伤组织诱导试验结果中最佳
组合和最高诱导率处理的愈伤组织为材料，分别转入
分化培养基上进行分化培养试验，每隔 12d 继代 1 次。
生根培养:分化出的组培苗转接到 1 /2MS 培养基
上进行生根试验。
愈伤组织诱导和分化的基本培养基为 MS 培养
基，pH 5. 8，蔗糖 30g /L，琼脂 7. 5g /L。生根培养基为
1 /2MS 培养基。
1. 2. 3 组培苗的移植 组培苗在生根培养基上长到
4 ～ 6cm 时，打开培养基封口膜，炼苗 1 周，然后移植到
由蛭石和草炭配置的灭菌土壤中生长。
1. 2. 4 试验设计 愈伤诱导试验用 SPSS13. 0 软件设
计 L16(4
5)正交试验，研究不同外植体类型、不同浓度
的细胞生长素 2，4-D、NAA 与细胞分裂素 6-BA、KT 配
比对愈伤组织诱导的影响。外植体类型、2，4-D、NAA、
6-BA、KT 的浓度分别选取 4 个水平(表 1)，共 16 个处
理组合(表 3);每组合设置 4 个重复，每重复接种 8 个
外植体。
表 1 紫花苜蓿愈伤诱导培养的正交试验设计因素和水平
Table 1 Orthogonal design of alfalfa callus induction
因素 factor 1 2 3 4
A
外植体类型
explant type
下胚轴
hypocotyl
子叶
cotyledon
茎
stem
真叶
leaf
B 2，4-D(mg /L) 0 0. 2 2 4
C NAA(mg /L) 0 0. 01 0. 1 1
D 6-BA(mg /L) 0 0. 1 1 2
E KT(mg /L) 0 0. 2 2 4
愈伤组织分化的激素配比见表 2，共 6 个处理，每
个处理 3 个重复，每个重复接种 10 个外植体。
表 2 愈伤分化培养基
Table 2 Media for shoot development
编号
number
培养基类型
media types
Ⅰ MS + NAA 0. 1mg /L + KT 0. 5mg /L
Ⅱ MS + NAA 0. 3mg /L + KT 0. 5mg /L
Ⅲ MS + NAA 0. 3mg /L + KT 0. 1mg /L
Ⅳ MS + 2，4-D 2mg /L + KT 0. 05mg /L
Ⅴ MS + 2，4-D 2mg /L + KT 0. 01mg /L
Ⅵ MS
1. 2. 5 试验数据计算
诱导率 =(产生愈伤组织的数量 /接种的外植体数量)
× 100%
褐化率 =(褐化外植体数 /接种外植体数)× 100%
分化率 =(分化出苗的愈伤个数 /接种的愈伤个数)×
100%
1. 3 数据统计
愈伤培养约 20d 后，观察愈伤组织的生长情况，统
计诱导率、褐化率。愈伤分化过程观察愈伤的变化，分
化 45 ～ 60d 后统计数据。统计结果采用 Excel、
SPSS13. 0 进行数据分析。
805
3 期 紫花苜蓿组织培养体系的建立
2 结果与分析
2. 1 不同处理愈伤组织的诱导率、褐化率和生长状况
从表 3 可以看出在 16 个正交试验处理中，AI 6、
AI 8 、AI 9 三个组合的诱导率达到 100%，其中 AI 6、
AI 8 褐化率为 0%，表现性状好，AI 9 有轻微褐化，褐
化率为 25%。AI 1、AI 3 诱导率达到 80%以上，均有
轻微褐化。AI 4、AI 12 、AI 14、AI 16 诱导率在 50%左
右，表现性状一般。其余组合诱导率较低，表现性状较
差，其中 AI 7 、AI 13 两个组合的诱导率为 0%。褐化
率较高的处理有 AI 4 、AI 12、AI 13 、AI 15 、AI 16，均
在 40%以上。
表 3 不同处理的苜蓿愈伤组织诱导率、褐化率和生长状况的比较
Table 3 Comparison on induction rate，browning rate and grow status of alfalfa callus from different media
处理号
treatment
因素 factor
A B C D E
诱导率
induction
rate(%)
褐化率
browning
rate(%)
颜色
color
生长状况
growth status
AI 1 2 2 2 2 1 81. 25 36. 25 褐色 brown 致密 compact +
AI 2 2 4 3 1 3 31. 25 0 浅褐色 beige 水渍状 watery +
AI 3 1 2 3 4 2 91. 67 33. 33 浅黄色 buff 疏松 loosen + + + +
AI 4 3 3 3 3 1 45. 83 45. 83 黄绿色 kelly 疏松 loosen + + + +
AI 5 1 1 1 1 1 8. 33 29. 17 褐色 brown 疏松 loosen + +
AI 6 1 4 2 3 4 100 0 黄绿色 kelly 疏松 loosen + + + +
AI 7 3 1 2 4 3 0 21. 88 褐色 brown －
AI 8 1 3 4 2 3 100 0 黄色 yellow 疏松 loosen + +
AI 9 4 3 2 1 2 100 25 黄色 yellow 水渍状 watery +
AI 10 2 3 1 4 4 28. 13 6. 25 褐色 brown 致密 compact +
AI 11 3 4 1 2 2 8. 33 25 黄绿色 kelly 疏松 loosen + + +
AI 12 2 1 4 3 2 65. 63 40. 63 浅褐色 beige 致密 compact +
AI 13 4 1 3 2 4 0 53. 13 浅褐色 beige －
AI 14 3 2 4 1 4 65. 63 9. 38 浅绿色 aqua 疏松 loosen + +
AI 15 4 4 4 4 1 6. 25 46. 88 乳白色 ivory － white 致密 compact +
AI 16 4 2 1 3 3 66. 67 62. 5 褐色 brown 致密 compact +
注:+ + + +表示生长好;+ + +表示生长较好;+ +表示生长一般;+表示生长差。
Note:+ + + +，+ + +，+ +，+ means the state of alfalfa callus was very good，good，general and bad，respectively.
不同正交试验处理中，愈伤组织的大小和颜色有
所不同(表 3)。从颜色看，愈伤组织主要有绿、黄绿、
黄、褐、乳白等颜色;从质地看，主要有疏松、致密、水渍
状。其中 AI 3、AI 4 、AI 6 三个组合中形成的愈伤组
织生长状况良好，颜色为浅黄色、黄绿色，且质地为疏
松颗粒状;AI 1、AI 2、AI 8、AI 9、AI 10 、AI 15、AI 16 生
长状况较差，颜色多为褐色或浅褐色，其中 AI 2、AI 9
还呈现轻微水渍状。
2. 2 各因素对愈伤组织诱导率和褐化率的影响
经方差分析(表 4)表明，外植体类型及 2，4-D、
NAA、6-BA、KT 的浓度对愈伤组织诱导率的影响均达
到极显著水平，各因素对愈伤组织诱导率的影响程度
次序为:2，4-D > 外植体类型 > NAA > 6-BA > KT;各
因素对褐化率影响的顺序为:外植体类型 > KT >
2，4-D > 6-BA > NAA(表 5)，5 个因素中只有 NAA 对
褐化率的影响没有达到显著水平。
表 4 各因素对苜蓿愈伤组织诱导率影响的方差分析
Table 4 Variance analysis of alfalfa callus induction rate with the five factors in the experiment
差异来源
source
平方和
sum of square
自由度
df
均方
mean square
F 显著性
significance
外植体 explant type 14753. 534 3 16555. 990 11. 954 0. 000
2，4-D concentration 31502. 928 3 5104. 167 25. 525 0. 000
NAA concentration 14546. 903 3 2128. 906 11. 787 0. 000
6-BA concentration 10392. 369 3 2076. 823 8. 420 0. 000
KT concentration 6396. 059 3 2975. 260 5. 182 0. 004
误差 error 17278. 646 42 384. 115
总和 total 240625. 000 58
905
核 农 学 报 24 卷
表 5 各因素对苜蓿愈伤组织褐化率影响的方差分析
Table 5 Variance analysis of alfalfa callus browning rate with the five factors in the experiment
差异来源
source
平方和
sum of squaure
自由度
df
均方
mean square
F
显著性
significance
外植体 explant type 7779. 948 3 2593. 316 7. 516 0. 000
2，4-D concentration 4301. 800 3 1433. 933 4. 156 0. 011
NAA concentration 1322. 756 3 440. 919 1. 278 0. 294
6-BA concentration 3180. 576 3 1060. 192 3. 073 0. 038
KT concentration 4516. 781 3 1505. 594 4. 363 0. 009
误差 error 14492. 188 42 345. 052
总和 total 76875. 000 58
2. 2. 1 外植体类型对愈伤组织诱导率、褐化率的影响
图 1 显示，在外植体类型中，下胚轴的愈伤组织诱导
率最高，平均达到 77. 6%，茎最小，只有 34%，子叶和
真叶居中。以真叶为外植体诱导愈伤组织时褐化率最
大，达到 48%，下胚轴最小，只有 13%，子叶和茎居中。
图 1 外植体类型对苜蓿愈伤组织诱导率、褐化率的影响
Fig. 1 The influence of explants type on alfalfa callus induction and browning rate
表示不同外植体间的差异极显著
means there are greatly significantly different among explants type
2. 2. 2 激素对愈伤组织诱导率、褐化率的影响 2，
4-D对紫花苜蓿愈伤组织的诱导具有重要作用。培养
基中添加 0. 2、2 和 4mg /L 2，4-D 的愈伤诱导率极显著
高于不添加处理(图 2)。随着 2，4-D 浓度的增加，苜
蓿愈伤组织诱导率表现先升高后降低的趋势，在添加
浓度为 0. 2mg /L 时，愈伤诱导率最高，与添加 4mg /L
的处理差异极显著，与添加 2mg /L 的处理差异不显著
(图 2)。
NAA 对紫花苜蓿不同类型外植体也有较强的诱
导作用(图 2)。对愈伤组织诱导率影响的曲线从 0 到
0. 01mg /L 呈上升趋势;从 0. 01 到 0. 1mg /L 呈下降趋
势，而在对愈伤组织褐化率的影响中，则呈先下降后升
高再下降的趋势。经 LSD 多重比较分析，不同浓度的
NAA 对愈伤组织诱导率在 0、0. 01 和 1mg /L 水平下差
异极显著;而对愈伤组织褐化率的影响在各水平下均
不显 著。由 图 2 可 以 清 晰 地 看 出 NAA 浓 度 在
0. 01mg /L 时，紫花苜蓿的诱导率最大，褐化率最小，因
此，NAA 诱导苜蓿愈伤组织的最佳浓度是 0. 01mg /L。
愈伤组织诱导率在 6-BA 浓度为 0 到 0. 1mg /L 时
呈下降趋势，从 0. 1 到 1. 0mg /L 呈上升趋势，但从 1 升
至 2mg /L 时又呈下降趋势。而愈伤组织褐化率随 6-
BA 浓度的增加，表现先上升后下降的趋势，在 1mg /L
时褐化率最高。经 LSD 多重比较分析，不同浓度的 6-
BA 在对愈伤组织诱导率影响中除了 0 和 0. 1mg /L 之
间差异不显著，其余浓度间均差异显著;而在对愈伤组
织褐化率的影响中，0 和 0. 1、0 和 1mg /L 之间的差异
均极显著。因此，在 6-BA 浓度为 1mg /L 的条件下诱
导效果最好。
不同浓度 KT 对愈伤组织诱导率影响表现为先升
高后下降(图 2);而对愈伤组织褐化率影响则呈下降
趋势。经 LSD 多重比较分析，KT 浓度 0 与 0. 2mg /L 之
间的愈伤诱导率的差异极显著，0. 2 与 2mg /L、0. 2 与
4mg /L 之间差异显著;而对褐化率的影响，0 与 2mg /L、0
与 4mg /L 之间存在显著差异。综合考虑诱导率、褐
015
3 期 紫花苜蓿组织培养体系的建立
图 2 激素对愈伤组织诱导率、褐化率的影响
Fig. 2 Effect of hormone on induction rate and browning rate of alfalfa callus
* 表示激素不同浓度间的差异显著;表示激素不同浓度间的差异极显著。
* means significantly different among hormone levels. means greatly significantly different among hormone levels.
化率和多重比较 3 个因素，KT 的最佳浓度应为
0. 2mg /L。
2. 3 紫花苜蓿愈伤组织诱导的最佳组合及其验证
愈伤组织诱导的正交试验及其方差分析表明，紫
花苜蓿愈伤诱导的最佳组合为下胚轴作外植体，MS 培
养基中添加 0. 2mg /L 2，4-D、0. 01mg /L NAA、1. 0mg /L
6-BA、0. 2mg /L KT。对此方案的验证试验表明紫花苜
蓿幼苗的下胚轴在上述培养基上的诱导率达到
100%，愈伤组织呈疏松状，米黄色略带绿色，质量较
好。
2. 4 紫花苜蓿愈伤的分化
表 6 紫花苜蓿愈伤在不同培养基上的分化率比较
Table 6 Comparison of differentiation rate
of alfalfa callus on six types media
培养基
编号
number
of
media
AI 9 处理愈伤
callus from AI 9
treatment
最佳组合愈伤
callus from best combination
接种数
inoculated
callus
分化
愈伤数
differen-
tiated
callus
分化率
ratio of
differenti-
ation
(%)
接种数
inoculated
callus
分化
愈伤数
differen-
tiated
callus
分化率
ratio of
differen-
tiation(%)
Ⅰ 30 3 10 30 0 0
Ⅱ 30 0 0 30 0 0
Ⅲ 30 3 10 30 0 0
Ⅳ 30 0 0 30 0 0
Ⅴ 30 0 0 30 0 0
Ⅵ 30 27 90 30 3 10
注:培养基编号同表 2。Note:Number of media was same as in
Table 2.
分别以 AI 6、AI 8、AI 9 和最佳组合得到的愈伤组
织为材料，转入分化培养基进行分化试验，AI 6、AI 8
诱导的愈伤组织在各分化培养基上的分化率均为 0。
表 6 为 AI 9 和最佳组合诱导愈伤组织的分化率比较。
在试验设计的 6 种不同分化培养基上，AI 9 愈伤组织
在 MS 培养基上的分化率最高(方案Ⅵ)，达到 90%，
其他试验方案的分化率均很低，最佳组合的愈伤组织
在 MS 培养基上的分化率仅有 10%，其他分化培养基
上的分化率为 0。
2. 5 紫花苜蓿组培苗的生根
AI 9 诱导的紫花苜蓿愈伤组织在 MS 培养基分化
成苗的后期，会逐渐长出少量的根系，分化苗剪下根系
后在 1 /2MS 培养基上培养 10d 即可长出新的根系，生
根率可达到 95% 以上。生根的组培苗经过 3 ～ 5d 的
炼苗，即可移栽到土壤中生长，只有个别再生苗死亡。
图 3 为苜蓿组织培养试验中，AI 9 诱导的愈伤组
织的诱导、分化到成苗的过程。
3 讨论
3. 1 2，4-D 浓度是影响紫花苜蓿愈伤组织诱导率的
主要因素。李聪等［2］研究认为在 MS 上诱导苜蓿产生
愈伤组织，2，4-D 是不可缺少的，且适宜水平为2mg /L。
本研究也证明 2，4-D 是影响紫花苜蓿愈伤诱导的主要
因素。对苜蓿愈伤诱导影响较大的还有外植体类型，
其次是 NAA 浓度、6-BA 浓度和 KT 浓度。本研究的愈
伤诱导正交试验中，3 个诱导率达到 100%的处理，2，
4-D 含量在 2 ～ 4mg /L，其中有 2 个处理以下胚轴为外
植体，培养基是 MS + 4mg /L 2，4-D + 0. 01mg /L NAA +
1. 0mg /L 6-BA + 4mg /L KT 和 MS + 2mg /L 2，4-D +
1. 0mg /L NAA + 0. 1mg /L 6-BA + 2mg /L KT，另 1 个处
115
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2010，24(3):507 ～ 512
图 3 紫花苜蓿组织培养
Fig. 3 The pictures of alfalfa tissue culture from callus to plant
a，b，c 分别为紫花苜蓿的愈伤组织、分化出的茎和移植的苗
a，b，c were induced callus，developed shoot and replanted alfalfa，respectively
理以真叶为外植体，培养基为 MS + 2mg /L 2，4-D +
0. 01mg /L NAA + 0. 2mg /L KT。但正交试验分析出的
最佳组合以下胚轴为外植体，MS + 0. 2mg /L 2，4-D +
0. 01 mg /L NAA + 1. 0mg /L 6-BA + 0. 2mg /L KT，其中
2，4-D 含量较低，愈伤诱导率也达 100%。因此真正起
作用的可能是生长素和细胞分裂素的比例，但这还有
待进一步试验研究、验证。通过本试验结果可以看出，
生长素(2，4-D、NAA)对苜蓿愈伤组织的诱导具有较
大的影响，但要获得高质量愈伤组织和较高的诱导率
需要生长素(2，4-D、NAA)和细胞分裂素(6-BA、KT)
的互相作用。师尚礼［5］在红豆草、百脉根、鹰嘴紫云
英花药培养中也证明 2，4-D 和 KT 成分量的适度选择
对愈伤组织形成有促进作用。Meijer 和 Brown［6］指出
苜蓿愈伤组织诱导需要 2，4-D 和 KT 的共同作用。
3. 2 对苜蓿愈伤褐化率影响较大的因素是外植体类
型，其次是 KT、2，4-D、6-BA、NAA 浓度。不同外植体
类型之间的愈伤组织的诱导率和褐化率均有极显著差
异，其中下胚轴为诱导愈伤组织的最佳外植体，这与苏
玉春等［7］对紫花苜蓿的研究结果一致。主要是因为
下胚轴和子叶的细胞活动性较强，褐化率较低，茎和真
叶的分化、再生能力较弱，褐化率较高。本试验研究表
明，KT、2，4-D、NAA 对苜蓿愈伤组织的褐化具有抑制
作用，而 6-BA 会促进苜蓿愈伤组织褐化的发生，同时
6-BA 具有促进苜蓿愈伤组织成熟的作用，在高浓度生
长素(2，4-D、NAA)的处理中，不添加 6-BA 的愈伤组
织均表现水渍状，而添加 6-BA 的培养基中愈伤组织
质量较好，这与黄远新等［8］的研究结果一致。
3. 3 紫花苜蓿愈伤组织的分化主要决定于愈伤组
织的背景。Meijer 和 Brown［6］和 Ivanova 等［9］研究指
出苜蓿愈伤组织的生长和分化主要决定于愈伤组织
诱导培养基的激素配比。吕冬霞和曲长福［10］指出，
生长素和细胞分裂素的结合使用比单一使用更有利
于植物愈伤组织的产生和分化。Ana 等［11］在添加
2，4-D 和 KT 的培养基上诱导的苜蓿愈伤组织，悬浮
培养后，在 MS 培养基上的分化率达到 54. 5%。本
研究中 AI 9 处理的愈伤组织，即以真叶为外植体，在
MS + 2mg /L 2，4-D + 0. 01mg /L NAA + 0. 2mg /L KT
培养基上诱导出的愈伤组织在 MS 培养基上的分化
率达到 90%，有明显的提高。最佳组合诱导的愈伤
组织在 MS 培养基上仅有 10% 的分化率，在其他含
激素的培养基上则不能分化出苗。另 2 个 100% 诱
导率的处理形成的愈伤组织在继代和分化中形成致
密的绿色胚性愈伤组织，但不能分化出苗。因此紫
花苜蓿愈伤组织的分化主要决定于愈伤组织的背
景。黄远新等［8］的研究表明紫花苜蓿愈伤组织诱导
培养基中添加 6 － BA 可提高愈伤组织的生长质量，
但形成的是非胚性愈伤组织，不能分化出苗，在本研
究中，愈伤组织诱导率达到 100% 的 4 个处理中，3
个含 6-BA 的处理诱导的愈伤组织均不能分化出苗，
而 AI 9 处理的培养基中不含 6-BA，形成的愈伤组织
表现水渍状，但分化率最高可达 90%，因此在诱导培
养基中添加 6-BA 会抑制苜蓿愈伤组织的分化。
4 结论
通过试验，本研究建立了高效的紫花苜蓿组织培
养体系，即以真叶为外植体，在 MS + 0. 2mg /L 2，4-D +
0. 01 mg /L NAA + 0. 2mg /L KT 培养基(AI 9 处理)上
进行愈伤组织的诱导，诱导率可达到 100%，愈伤组织
继代 2 ～ 3 次，然后在 MS 培养基上分化，分化率可达
90%。分化苗转入 1 /2MS 培养基上进行根的发生，形
成完整的组培苗，生根率可以达到 95%以上。组培苗
炼苗 3 ～ 5d 后，既可移植到土壤中生长。
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