全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 042426206
萝卜胞质雄性不育正常花蕾
与败育花蕾 DD2PCR 及 EST序列分析
贾　晋1 ,2 　张鲁刚1
(11 西北农林科技大学 园艺学院 ,陕西 杨凌　712100 ; 21 内蒙古科技大学 生物与化学工程学院 ,内蒙古 包头　014010)
摘 　要 :提取了萝卜雄性不育系 BT218 败育花蕾和正常花蕾的 DNA ,并且采用 DD2PCR 技术研究了败育
花蕾与正常花蕾的 mRNA 差异表达。败育花蕾 DNA 表现有规则的Ladder ,而正常花蕾只有单一 DNA 条
带 ,该结果为萝卜败蕾发生了细胞程序化死亡提供了生化证据 ;DD2PCR 得到 107 个差异表达片段 ,其中
败育花蕾差异表达片段 94 个 ,正常花蕾差异表达片段 13 个。BLAST结果显示 ,与功能蛋白同源的差异
序列 50 %以上来源于叶绿体 ,推测萝卜败蕾与叶绿体有很大关系 ;叶绿体Mat K在不同的引物组合扩增
中出现 3 次 ,序列分析后发现长度为 282bp 和 283bp 的为同一片段 ,长度为 396bp 的片段与长度为 282bp
和 283bp 的片段无同源性 ,可能为编码Mat K的不同亚基。Mat K参与叶绿体中 RNA 转录本 Ⅱ型内含子
剪切 ,通过对内含子剪接的影响来调节基因的表达 ,推测 Mat K等叶绿体基因上调表达使其蛋白质的合
成发生变化 ,导致萝卜叶绿体代谢紊乱 ,最终导致败蕾 ;而甲基转移酶可能通过 DNA 甲基化调控萝卜发
育 ,使其发育异常表现花蕾败育。对 BLASTx 比对分值小于 80 及无同源性的片段进行 BLASTn 分析 ,根
据比对结果推测 :细胞程序化死亡可能是萝卜败蕾、植物衰老和植物受逆境胁迫时普遍发生的一种生理
生化现象。
关键词 :萝卜败蕾 ;DD2PCR ; EST序列分析 ;Mat K;DNA 甲基转移酶 ;细胞程序化死亡
收稿日期 :2008211218 　接受日期 :2008201214
基金项目 :国家 863 计划 (2006AA1001082427)和陕西省 13115 工程 (2007ZDKG205)
作者简介 :贾晋 (19752) ,女 ,内蒙古呼和浩特人 ,在读博士 ,主要从事蔬菜育种与生物技术研究。E2mail : jiajin0201 @yahoo. com. cn
通讯作者 :张鲁刚(19632) ,男 ,陕西岐山人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事蔬菜育种与生物技术研究。Tel : (029)287082131 ,E2mail : lugangzh @163. com
mRNA DIFFERENTIAL DISPLAY AND EST SEQUENCE ANALYSIS OF ABORTED BUD
AND NORMAL BUD IN RADISH( Raphanus sativus)
J IA Jin1 ,2 　ZHANGLu2gang1
(1. College of Horticulture Northwest A & F University , Yangling shaanxi 712100 ;
2. School of Biological & Chemical Engineering , Inner Mongolia University of Science & technology , Baotou Inner Mongolia 014010)
Abstract :DNA of aborted and normal buds in Radish male sterility BT218 was extracted , and the mRNA difference of the
aborted and normal bud was studied by DD2PCR. DNA of aborted bud showed regular ladder , while normal bud showed a strip
only , this result provided biochemistry evidence on which cell programmed death occurred in aborted bud of Radish ; 107
sequences were gained by DD2PCR , in which 94 sequences were from aborted bud , 13 sequences were from normal bud. Result
of BLAST showed 50 % homologous different sequences in function protein were from chloroplast , so it is suggested that aborted
bud of Radish had close relations with chloroplast ; Maturase K in chloroplast was amplified thrice in different primer
combinations , it was found that sequences of 282bp and 283bp in length were the same , but sequence of 396bp differed from
sequences of 282bp and 283bp in length , so it is suggested that the two sequences coded different subunit of maturase K.
Maturase K is concerned with cutting intron of RNA transcription Ⅱin chloroplast and modulates expression of gene through
624　 核 农 学 报　2008 ,22 (4) :426～431Journal of Nuclear Agricultural Sciences
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influencing introns cut , so we suggested increment of maturase K gene expression in chloroplast might change protein synthesis ,
and induced abnormal development and aborted bud in Radish ; DNA methyltransferase might regulate and control development of
Radish , and also induced abnormal development and aborted bud of Radish by DNA methylation. If BLASTx score was less than
80 and no significant similarity found , BLASTn will be carried through , the results suggested that PCD might be a physiology and
biochemistry phenomenon which existed in aborted bud of Radish , plant senescence and adversity intimidating.
Key words : radish aborted bud ; DD2PCR ; EST sequence analysis ; maturase K; DNA methyltransferase ; cell programmed
death
　　细胞程序化死亡 ( Programmed Cell Death , PCD) 是
由基因编程调控的细胞自主性自杀过程 ,其特征是 :细
胞被诱导产生核酸内切酶 , 核 DNA 从核小体间降解
断裂 , 产生带有 3′2OH 端的、大小不同的寡聚核小体
片段。这些片段在凝胶电泳上可以见到以 140bp 倍增
的DNA 弥散梯形条带 (DNA Ladder) [1 ] 。许多研究都将
DNA Ladder 的产生作为鉴定细胞程序化死亡的一个重
要生化指标[2 ,3 ] 。
败蕾是萝卜育种实践中普遍存在的一种不利生物
学现象 (萝卜败蕾在田间的表现见图 1) ,阐明其分子
机制对育种者的知识产权保护具有重要的实践意义。
本文首先对萝卜败育花蕾和正常花蕾 DNA 的琼脂糖
凝胶电泳图谱进行比较 ,观察前者中是否有 DNA
Ladder 的出现 ,以此确定萝卜败蕾是否是细胞程序化
死亡 ;然后通过 DD2PCR 技术研究萝卜败育花蕾与正
常花蕾中差异表达的 cDNA 片断 ,分析各差异表达 EST
的可能功能。笔者希望以此丰富植物细胞程序化死亡
研究内容 ,为阐明萝卜败蕾机制奠定基础。
图 1 　萝卜败蕾现象
Fig. 1 　Aborted bud of Radish
1 　材料和方法
111 　试验材料
西北农林科技大学园艺学院白菜研究室提供的萝
卜雄性不育系 BT218 萌动种子经低温春化后播种于温
室 ,开花期取同一株上停止生长并开始转黄的花蕾 (败
育花蕾)与表现正常的花蕾混样存于 - 70 ℃冰箱用于
后续 DNA 及 RNA 的提取。
试验所用研钵和玻璃器皿均在 160 ℃下处理 8 h
以上 ,试剂用新开封或经 DEPC 过夜处理后再经高压
灭菌的双蒸水配制 ,离心管等塑料制品均用 011 % (VΠ
V) DEPC水浸泡过夜 ,高压灭菌除去 DEPC后使用。
112 　萝卜正常花蕾与败育花蕾DNA 提取
以萝卜败育花蕾及正常花蕾为材料 ,采用 CTAB
法提取 DNA ,2 次重复。经 RNA 酶处理后 ,用 1 % (质
量体积比)琼脂糖凝胶电泳检测。
113 　萝卜正常花蕾与败育花蕾 RNA 提取
将存于 - 70 ℃冰箱的萝卜花蕾加液氮磨细 ,用博
日公司生产的 BIOZOL 试剂提取总 RNA。DEPC 水溶
解总 RNA ,取 1μl 进行 1 % (质量体积比) 琼脂糖凝胶
电泳检测 ,1μl 用 ND21000 型微量紫外分光光度计测
OD 值和浓度 ,其余样品 - 20 ℃保存备用。
114 　反转录和 DD2PCR 扩增
总 RNA 纯化和反转录参照 Promega 公司 RNase
free DNase Ⅰ及反转录酶使用说明书进行。取 1μl 反
转录合成的 cDNA 作为 DD2PCR 模板 ,3 条 3′端锚定引
物和 26 条随机引物组成的 78 个引物组合 (引物由上
海 sangon 公司合成 ,采用上海 sangon 公司统一编号)对
萝卜败蕾材料和正常材料反转录产生的 cDNA 模板进
行扩增。20μl 反应体系中加入 10 ×buffer 215mmolΠL ,
Mg2 + 218mmolΠL ,dNTPs 0125mmolΠL , Taq 酶 115U ,锚定
引物 215μmolΠL ,随机引物 1125μmolΠL ,cDNA 1μl。PTC2
200 型 PCR 仪扩增。扩增程序 :94 ℃预变性 2min ;94 ℃
变性 30s ,45 ℃退火 2min ,72 ℃延伸 1min ,40 个循环 ;
72 ℃延伸 7min。每个引物组合的 PCR 扩增重复 2 次。
115 　DD2PCR 产物电泳和差异片段回收、二次扩增、克
隆与测序
差异片段用北京天根公司生产琼脂糖凝胶回收试
剂盒回收、纯化后连接到 pMD182T 载体 ( TaKaRa 公司
生产) 。重组质粒热击 (42 ℃,45s) 转化大肠杆菌 DH5α
724　4 期 萝卜胞质雄性不育正常花蕾与败育花蕾 DD2PCR 及 EST序列分析
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菌株感受态细胞 ,在含有氨苄青霉素 (工作液浓度为
100mgΠml)培养基上培养 ,挑取阳性克隆转接培养 ,经
PCR 验证为阳性克隆的 ,送菌液到上海 Sangon 公司测
序 ,手工去除测序原始序列中的载体序列以及插入片
段中的引物序列和 polyA 序列 ,挑选长度大于 100 bp
的插入片段进行后续分析。预处理后的 EST 序列先
与非冗余的 NCBI蛋白质数据库 (http :ΠΠwww. ncbi . nlm.
nih. govΠblastΠ)进行 BLASTx 分析 ,序列比对分值大于
80 的认为有生物学意义的相似性 ,对这部分蛋白质参
照拟南芥 EST分类方法 ,按其生物学功能进行功能分
类。BLASTx 比对分值小于 80 的序列通过因特网
(http :ΠΠwww. ncbi . nlm. nih. gov) 利用 BLASTn 程序在核
苷酸水平上再次进行序列同源性分析 ,比较阈值 E2
value < 10 - 5[4 ] 。2 种比对分析中均无同源性的 EST 序
列再与 EST2others 数据库 (包含已获得的除人类、小鼠
外的所有物种的 EST) 进行 BLASTn 比对 ,以寻找生物
学意义上相似 EST片段。部分 BLASTn 比对统计结果
列于表 1。所用数据库为 2007 年 8 月 26 日更新。
2 　结果与分析
211 　DNA 提取
由图 2 可见 ,萝卜败育花蕾 DNA 表现有规则的
DNA Ladder ,而正常花蕾仅见单一 DNA 条带。DNA
Ladder 是用以鉴定细胞程序化死亡的重要生化指标 ,
宁顺斌等[5 ]利用 H2O2 诱导玉米根尖细胞凋亡后检测
到了 DNA Ladder ,周军等[6 ] 利用乙烯诱导胡萝卜原生
质发生凋亡后也检测到 DNA Ladder。本研究检测到萝
卜败育花蕾出现 DNA Ladder ,说明萝卜败蕾是一种细
胞程序化死亡现象。
图 2 　萝卜败育花蕾与正常花蕾 DNA 提取结果
Fig. 2 　DNA extraction from aborted
and normal bud in Radish
1、2 :萝卜败育花蕾 ;3、4 :萝卜正常花蕾
1 ,2 :DNA of aborted bud in Radish ; 3 ,4 :DNA of hormal bud in Radish
212 　RNA 提取质量
由图 3 可见 ,提取的 RNA 带型完整 ,且由 ND21000
型微量紫外分光光度计测得败育花蕾 OD260ΠOD280 为
1195 ,质量浓度为 214μgΠμl ; 正常花蕾 OD260ΠOD280 为
2107 ,质量浓度为 212μgΠμl ,因此提取的 RNA 符合后续
试验的要求。
图 3 　RNA 提取结果
Fig. 3 　Results of RNA extraction
1 :败育花蕾 ;2 :正常花蕾
1 :RNA of aborted bud ; 2 :RNA of normal bud
213 　DD2PCR 扩增结果及 EST序列分析
经 DD2PCR 分析后将所有差异条带根据在“败育
花蕾 →正常花蕾”的表现分为“有 →无”、“无 →有”、
“弱 →强”和“强 →弱”4 种类型 ,图 4 所示为“有 →无”
(引物组合 B0301ΠB0329 和 B0302ΠB0329 扩增的差异条
带)和“无 →有”(引物组合 B0303ΠB0329 扩增的差异条
带) 。
图 4 　部分引物组合的 mRNA 差异显示结果
Fig. 4 　Results of mRNA differential display
in part primer combinations
1 ,2 ,3 ,4 :引物组合 B0301ΠB0329 的扩增结果 ;
5 ,6 ,7 ,8 :引物组合 B0302ΠB0329 的扩增结果 ;
9 ,10 ,11 ,12 :引物组合 B0303ΠB0329 的扩增结果
1 ,2 ,3 ,4 :DD2PCR results of B0301ΠB0329 ;
5 ,6 ,7 ,8 :DD2PCR results of B0302ΠB0329 ;
9 ,10 ,11 ,12 :DD2PCR results of B0303ΠB0329
824 核　农　学　报 22 卷
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选择重复出现的差异条带进行测序 ,测序后共得
到 107 条序列 ,其中长度大于 100bp 的序列全部为表
达量差异。从表 1 可见 ,在 107 条序列中 13 条序列为
正常花蕾上调表达的片段 ,占 12 % ,94 条序列为败育
花蕾上调表达的片段 ,占 88 %。人工去除载体序列后
发现插入片断长度小于 100 bp 的 EST 共有 18 条 (占
107 条序列的 1618 %) ,考虑到这部分序列提供的有效
信息量太少 ,不进行后续的 BLAST 分析。去除这部分
序列后最终获得的有效 EST序列数目为 89 条 ,占全测
序量的 8312 % (见表 2) 。
BLASTx 分析发现在蛋白质水平上能找到同源序
列的 EST共 42 条 ,占有效 EST总数的 4712 %。所有同
源蛋白质中 ,BLASTx 比对分值大于 80 的有 16 条 , 其
中 13 条功能已知 ,3 条与功能未知蛋白质有相似性。
表 1 　根据表达类型对 EST序列分类
Table 1 　Classification of EST sequence
according to expression type
类型 type 数量 number (strip) 比率 ratio ( %)
正常花蕾上调表达的条带 13 12
败育花蕾上调表达的条带 94 88
合计 107 100
表 2 　根据片段长度对 EST序列的分类
Table 2 　Classification of EST sequence
according to strip length
类型 type 数量 number (strip) 比率 ratio ( %)
长度小于 100bp 的序列 18 1618
长度大于 100bp 的序列 89 8312
合计 107 100
表 3 　BLAST比对统计结果
Table 3 　Statistical results of BLAST
分类 category ESTs 数目 No1of ESTs
相似搜索结果 ESTs 分类 classification of ESTs by similarity search
功能已知蛋白 known function protein 13 (1416 %)
功能未定假想蛋白 hypothetical protein 3 (314 %)
无相似性同源物 homologues with no similarity 73 (8210 %)
合计 total 89
与已知蛋白基因同源的 ESTs 功能分类 functional categories of ESTs with homology to known genes
代谢 (包括来自叶绿体的成熟酶) metabolism (including maturase Kfrom chloroplast) 4 (3018 %)
能量代谢 (包括光合作用) energy metabolism (including photosynthesis) 7 (5318 %)
其他 else 2 (1514 %)
合计 total 13
BLASTx 无同源性序列 BLASTn 分类 classification of BLASTn without similar sequence in BLASTx
未知功能 cDNA unknown function cDNA 30 (5117 %)
与花器官相关 cDNA cDNA related with floral organ 10 (1712 %)
与衰老相关 cDNA cDNA related with senescence 7 (1211 %)
与逆境胁迫相关 cDNA cDNA related with adversity intimidating 11 (1910 %)
合计 total 58
表 4 　BLASTx 比对部分统计结果
Table 4 　Partially statistical results of BLASTx
引物
primer
长度
length (bp)
推测功能
putative identification
器官Π部位
organism
相似性
identity ( %)
分值
score
E2值
E2value
B0308ΠB0329 108 photosystem I assembly protein Ycf4 Arabidopsis thaliana 100 8019 2e214
B0301ΠB0327 751 PSII 47KDa protein Arabis hirsuta 98 510 3e2143
B0320ΠB0329 283 maturase K Raphanus sativus 100 171 1e241
B0320ΠB0329 143 hypothetical protein LeviCp082 Lepidium virginicum 89 9918 5e220
B0304ΠB0327 543 cytochrome bΠf Arabis hirsuta 100 316 5e285
B0308ΠB0329 457 methyltransferase Arabidopsis thaliana 58 8316 4e215
B0310ΠB0328 484 ATP2dependent Clp protease proteolytic subunit Arabidopsis thaliana 95 299 3e280
B0304ΠB0329 396 maturase K Raphanus sativus 100 8312 5e215
B0321ΠB0327 298 reverse transcriptase related protein Homo sapiens ( human) 75 127 2e228
B0303ΠB0327 308 Chain B , The Complex Of Cytochrome F And
Plastocyanin
Brassica rapa 99 207 2e252
B0321ΠB0327 387 Alu subfamily J sequence contamination warning
entry
Homo sapiens ( human) 53 8210 6e215
B0311ΠB0329 207 hypothetical protein Arthcp087 Arabidopsis thaliana 84 128 1e228
B0303ΠB0329 405 Ycf2 protein Arabidopsis thaliana 95 271 1e271
B0308Π0329 282 maturase K Raphanus sativus 98 159 5e238
B0318ΠB0329 253 Ycf1 protein Atropa belladonna 54 8019 2e214
B0301ΠB0327 444 putative protein Arabidopsis thaliana 80 194 2e248
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对这些蛋白质进行生物学功能分类 (见表 3) 发现 :与
能量代谢相关蛋白 7 条 ,其中多数来自叶绿体 ;与代谢
相关蛋白 4 条 ,其中 3 条来自叶绿体的成熟酶 K,1 条
来自甲基化酶。叶绿体中成熟酶 K在不同的引物组
合 PCR 扩增中出现 3 次 ,且都为败育花蕾中扩增条带
增强 ,表现为上调表达 ,说明萝卜败蕾与叶绿体存在很
大关系。3 个成熟酶 K 同源片段中长度 282bp 和
283bp 的序列经 BLAST Align 发现为相同序列 ,而长度
为 396bp 的序列与 282bp 和 283bp 的序列无同源性 ;此
外还有 2 条与人类蛋白具有相似性。其余 BLASTx 比
对分值小于 80 的序列作为未知蛋白功能核苷酸序列
进行 BLASTn 比对 ,发现这些序列为萝卜败蕾材料特
异表达的片段。73 条未知蛋白功能的核苷酸序列经
BLASTn 比对后发现除 15 条无同源序列外 ,其余 58 条
序列中 ,功能未知的 cDNA 占 5117 % ,和植物花器官相
关的 cDNA 占 1712 % ,与衰老和逆境胁迫相关 cDNA 分
别占 1211 %和 1910 % ,部分 BLASTx 比对结果总结于
表 4。
3 　讨论
植物细胞程序性死亡是近期研究的热点 ,其过程
相当复杂 ,目前作用机制尚不清楚。本研究提取萝卜
胞质雄性不育材料败育花蕾与正常花蕾的 DNA ,发现
败育花蕾 DNA 经 RNA 酶处理后 ,仍表现有规律 DNA
Ladder ,而正常花蕾则无 DNA Ladder 现象 ,DNA 片断化
为萝卜败蕾属于细胞程序化死亡范畴提供了证据 ;通
过 DD2PCR 技术研究了败育花蕾和正常花蕾基因表达
差异并且分析了差异序列 ,结果表明差异显示得到的
片段 50 %左右功能未知 ,为萝卜败蕾材料中特异条
带。功能已知同源序列中 50 %以上是叶绿体蛋白 (表
3) ,其中与成熟酶 K(Mat K) 同源的序列在 3 个引物组
合中重复扩增出现 ,根据表 4 结果 ,长度为 283bp 和
396bp 的序列与成熟酶 K同源性为 100 % ,而长度为
282bp 的序列与成熟酶 K 同源性为 98 % ,经 BLAST
Align 分析发现长度为 282bp 的序列与 283bp 的序列几
乎完全重叠 ,说明为同一序列 ,由于长度为 282bp 序列
的第 23 位碱基与 283bp 的第 25 位碱基不同 ,造成编
码的 2 个蛋白序列存在 1 个氨基酸差异 ,判定为同一
个序列由测序引起 1 个碱基错误。长度为 396bp 的序
列与长度为 282bp 的序列和 283bp 的序列无同源性 ,
推测可能编码成熟酶 K的不同亚基。资料显示 ,叶绿
体 mat K 基因位于 trn K 基因的内含子中 ,编码参与
RNA 转录本 Ⅱ型内含子剪切的成熟酶 ,通过对内含子
剪接的影响调节基因的表达[7 ,8 ] ,据此推测成熟酶 K
基因表达量变化改变了叶绿体基因组中某些基因
mRNA 转录后的剪接方式 ,从而影响叶绿体蛋白质的
合成 ,导致萝卜代谢紊乱 ,发生败蕾。该推测需要在获
得 mat K基因全长后 ,经 RNA 干扰进行验证。3 个与
成熟酶 K同源的序列经 NCBI ORF Finder 发现 ,长度分
别为 282bp 的序列和长度为 396bp 的序列内均没有完
整的阅读框 ,长度为 396bp 的序列编码的氨基酸序列
与向日葵成熟酶 K部分序列同源性为 53 %。此外 ,本
研究得到一个与甲基转移酶同源的长度为 457bp 的片
断 ,ORF 分析发现该序列从第 28 位碱基到第 207 位碱
基为一个完整的 ORF ,编码长度为 60 个氨基酸的蛋白
质 ,经 BLASTp 分析与拟南芥的甲基转移酶同源性达
到 67 %。
DNA 甲基化是基因组 DNA 的一种主要的表观遗
传修饰形式 ,是调节基因功能的重要手段 ,是 DNA 甲
基转移酶 (DNA methyltransferase)催化 DNA 的一种天然
修饰方式。DNA 甲基化可以引起 DNA 高级结构的变
化 ,从而引发一系列的生物学功能变化。在动物中 ,
DNA 甲基化异常是通过影响癌基因和抑癌基因的表
达以及基因组的稳定性而参与肿瘤的发生和发展的 ,
与动物细胞中不同 ,植物细胞中甲基化不会致死 ,而是
发生发育异常或出现新的表型[9 ] 。在本研究中 ,花蕾
中甲基转移酶基因上调表达可能是导致 DNA 甲基化
异常 ,使萝卜花蕾发育发生变化 ,表现出败蕾的原因 ,
相关机制需要通过差异片段的全长克隆和功能验证等
研究加以阐明。此外 ,本研究还得到与叶绿体中 2 个
光系统相关的蛋白的同源序列和与叶绿体中的细胞色
素蛋白同源的序列 ,说明萝卜败蕾与叶绿体和能量代
谢密切相关。对 BLASTx 比对结果分值小于 80 和无同
源性的片段进一步通过 BLASTn 比对 ,结果表明 :细胞
程序化死亡可能是萝卜花蕾败育、植物衰老和植物受
逆境胁迫时普遍发生的一种生理生化现象。刘文娜
等[10 ]研究发现 TMV 接种番茄叶片后 ,光镜和电镜检测
发现茎尖出现了 PCD 现象 ,说明病害胁迫能引发植物
细胞程序化死亡 ,沙莉娜等[11 ] 模拟干旱处理玉米耐旱
自交系 ,经 mRNA 差异显示分析得到与水稻天冬氨酸
特异性半胱氨酸蛋白酶类同源性达到 99 %的基因片
断 ,推测干旱处理诱发玉米叶片发生了细胞程序化死
亡 ,笔者期望本研究结果为萝卜败蕾后发生了细胞程
序化死亡提供证据 ,丰富植物细胞程序化死亡研究内
容 ,为进一步阐明萝卜败蕾机制奠定基础。
目前 ,用于功能基因组研究的基因差异表达新技
术不断涌现和完善 ,不同技术各有其优缺点 ,DD2PCR
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技术虽然存在假阳性率高、差异片段短等不足 ,但同时
具有操作简便、起始 mRNA 用量少、纯度要求不高、可
区别不同的表达强度等其他技术难以取代的优点。本
研究为了克服 DD2PCR 技术假阳性率高的缺点 ,采用
了较高的退火温度 (45 ℃) 和改进的长度为 15bp 的锚
定引物 ,以提高扩增片段的特异性和长度。此外 ,设置
了 2 次重复试验 ,只有在 2 次重复试验中都稳定出现
的差异条带才进行下一步研究 ,从而大大降低了假阳
性 ,目前笔者正在采用荧光定量 PCR 技术验证试验结
果 ,进一步排除假阳性。
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《中国农业科学》由农业部主管、中国农业科学院主办。主要刊登农牧业基础科学和应用科学研究论文、综
述、简报等。设有作物遗传育种 ;耕作栽培·生理生化 ;植物保护 ;土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境 ;园艺 ;贮藏·
保鲜·加工 ;畜牧·兽医等栏目。读者对象是国内外农业科研院 (所) 、农业大专院校的科研、教学人员。
《中国农业科学》中文版影响因子、总被引频次连续多年居全国科技期刊最前列或前列位次。1999 年起连续
10 年获“国家自然科学基金重点学术期刊专项基金”资助 ;2001 年入选中国期刊方阵双高期刊 ;1999 年获“首届国
家期刊奖”,2003、2005 年获“第二、三届国家期刊奖提名奖”;2004～2006 年连续荣获第四、五届全国农业优秀期刊
特等奖 ;2001 年起 6 次被中信所授予“百种中国杰出学术期刊”称号。在北京大学《中文核心期刊要目总览 (2004
年版)》中位居“农业综合类核心期刊表”首位。
《中国农业科学》英文版 ( Agricultural Sciences in China) 2002 年创刊 ,2006 年 1 月起正式与国际著名出版集团
Elsevier 合作 ,海外发行由 Elsevier 全面代理 ,全文数据在 ScienceDirect 平台面向世界发行。
《中国农业科学》中文版大 16 开 ,每月 10 日出版 ,国内外公开发行。每期 384 页 ,定价 82150 元 ,全年定价
990100 元 ,国内统一刊号 :CN1121328ΠS ,国际标准刊号 : ISSN057821752 ,邮发代号 :22138 ,国外代号 :BM43。
《中国农业科学》英文版大 16 开 ,每月 20 日出版 ,国内外公开发行。每期 128 页 ,国内订价 20100 元 ,全年
240100 元 ,国内统一刊号 :CN1124720ΠS ,国际标准刊号 : ISSN167122927 ,邮发代号 :22851 ,国外代号 :1591M。
邮编 :100081 ;地址 :北京 　中关村南大街 12 号《中国农业科学》编辑部
电话 :010282109808 ,82106279 ,62191638 ,62191637 ,传真 :010282106281
网址 :www. ChinaAgriSci . com 　E2mail :zgnykx @mail . caas. net . cn
134Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2008 ,22 (4) :426～431
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