全 文 ：核 农 学 报 2011，25(1)0032 ～ 0036
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2011)01-00032-05
收稿日期:2010-06-15 接受日期:2010-10-25
基金项目:国家高技术研究发展计划(863 计划)课题(2009AA10Z107)，国家林业局公益性行业科研专项经费(201004004)
作者简介:张晓军(1984-)，男，河北保定人，在读硕士生，研究方向为园林植物遗传育种。E-mail:zhangxiaojun0107@ 163. com
通讯作者:杨敏生(1962-)，男，内蒙古多伦人，教授，博导，林木遗传育种。Tel:0312-7528715;E-mail:deu100@ yahoo. com. cn
外源 rolB基因对已转 Ri质粒的杨树苗期
生长与光合特性的影响
张晓军1 郝 宇1 梁海永2 杨敏生2
(1. 河北农业大学园林与旅游学院，河北 保定 071000;2. 河北农业大学林学院，河北 保定 071000)
摘 要:为研究多拷贝 rolB 基因在转基因植物中的表达，对转入多拷贝 rolB 基因的三倍体毛白杨 1 年生
植株进行了苗期生长、叶绿素含量及光合特性的测定。结果表明:rolB 基因多拷贝株系和转 Ri 质粒三
倍体毛白杨的苗高、节间距和地径(其中多拷贝株系 863B 的地径与未转基因三倍体毛白杨一样)均低
于未转基因三倍体毛白杨;rolB 基因多拷贝株系与 Ri 质粒转化株系的苗高、节间距和地径的差异无规
律性。rolB 基因多拷贝株系和 Ri 质粒转化株系的叶绿素 a、b、和 a + b 含量及净光合速率均低于未转基
因三倍体毛白杨，其中 01B 组多拷贝株系的叶绿素 a、b、和 a + b 含量均低于其 Ri 质粒转化株系，而 63B
组多拷贝株系与其 Ri 质粒转化株系之间的差异无规律性。rolB 基因多拷贝株系与 Ri 质粒转化株系净
光合速率的差异无规律性。对蒸腾速率、气孔导度和胞间 CO2 浓度进行比较，rolB 基因多拷贝株系与
未转基因三倍体毛白杨和 Ri 质粒转化株系差异均为无规律。
关键词:三倍体杨树;rolB 基因;Ri 质粒;苗期生长;光合特性
EFFECT OF EXOGENOUS rolB GENE ON SEEDLING GROWTH AND
PHOTOSYNTHETIC CHARACTERS OF RI PLASMID TRANSFER POPLAR
ZHANG Xiao-jun HAO Yu LIANG Hai-yong YANG Min-sheng
(1. College of Landscape Architecture and Tourism，Agricultural University of Hebei，Baoding，Hebei 071000;
2. College of Forestry，Agricultural University of Hebei，Baoding，Hebei 071000)
Abstract:Seedlings growth，chlorophyll content and photosynthetic characters of one-year old plants of triploid Populus
tomentosa transferred with multicopy rolB gene were tested to study the expression of multicopy rolB gene in transgenic
plant. The results showed that seedling height，internode length and ground diameter of multicopy rolB gene plants and
Ri plasmid transfer poplar were lower than those of non-transgenic poplar (the ground diameter of multicopy plant 863B
was the same as that of non-transgenic poplar). No similar differences in seedling height ，internode length，ground
diameter were found between multicopy rolB gene plants and Ri plasmid transfer poplar. The contents of chlorophyll a，
b，a + b and net photosynthetic rate of multicopy rolB gene plants and Ri plasmid transfermed poplar were lower than
those in non-transgenic poplar. The contents of chlorophyll a，b and a + b of 01B were lower than those in Ri plasmid
transfer poplar，but no similar difference was found between the 63B multiocpy series and Ri plasmid transfer poplar.
Furthermore，the net photosynthetic rate in rolB gene multicopy and Ri plasmid transfer poplar，the transpiration rate，
stomatal conductance，intercellular CO2 concentration among rolB gene multicopy strains，non-transgenic poplar and Ri
plasmid transfer poplar did not follow a consistent trend.
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1 期 外源 rolB 基因对已转 Ri 质粒的杨树苗期生长与光合特性的影响
Key words:Triploid Populus tomentosa;rolB gene;Ri plasmid;seedlings growth;photosynthetic characters
三倍体毛白杨［(Populus tomentosa × P. alba L.
var. pyramidalisBge. ) × P. tomentosa］是我国培育的
优良白杨新品种，具有生长快速、材质优良等特性，应
用前景广泛［1］。但由于三倍体树种不能用种子繁殖，
扦插不易成活［2］，其快速繁殖和大面积推广应用受到
严重制约。随着发根农杆菌 Ri 质粒促进生根功能的
发现及对其诱根机理的不断了解，国内外已广泛开展
了通过遗传转化途径将 Ri 质粒 rol 基因应用于改良植
物生根性状，促进林木生根的研究。
Ri 质粒及其 T-DNA 区上的 rol 基因对根的形成
与生 长 发 育 起 着 决 定 性 的 作 用。 rol 基 因 是 从
Agrobactecium rhizogenes 菌的 Ri 质粒的 T-DNA 上分离
出来的，可诱导植株发根［3］。 rol 基因由 rolA、rolB、
rolC、rolD 基因组成，将 Ri 质粒、单个或几个 rol 基因组
合转入三倍体毛白杨中，均能提高其生根能力。在诱
导毛根形成的 rol 基因中，rolB 是诱导根形成的最重要
基因［4］，在胡萝卜、烟草和高凉菜属(Kalanchoe)中均
可单独诱导毛根的形成［5］。rolB 基因在不同植物器官
中表达的顺序是根最强，茎次之，叶中表达较弱［6］。
然而，在 rol 基因表达的性状中，既有改良目的所需要
的也有对育种目标不利的性状［7］。Ri 质粒的导入往
往由于 rol 基因的作用会使植株表现出一些不利的生
长变异，如出现植株矮化、顶端优势减弱、叶片皱缩、茎
“之”字形弯曲及叶绿素含量下降等性状，对植物的生
长发育产生很大的影响［8］。在将 Ri 质粒上 T-DNA 区
中决定植物毛状根形成的关键基因 rolB 基因进行克
隆并导入已转 Ri 质粒的三倍体毛白杨植株后，使 rolB
基因在转 Ri 质粒三倍体毛白杨基因组中形成多拷贝。
本试验将未转基因三倍体毛白杨对照，对转入多拷贝
rolB 基因的三倍体毛白杨 1 年生植株的苗期生长、叶
绿素含量及光合特性进行了测定，比较植物在转入多
拷贝 rolB 基因后发生的相关变异，从而为进一步选育
优良的转基因无性系及研究基因的功能奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 试验地概况
研究地点设在河北农业大学西校区农林教学基
地。该地位于河北省保定市西南部，北纬 38°10′ ～ 40°
00′，东经 113°40′ ～ 116°20′，年均气温 12℃，年均降水
550mm。四季分明，冬季寒冷有雪，夏季炎热干燥，属
暖温带大陆性季风气候。土壤肥沃，土层深厚，通透性
好。
1. 2 材料
供试材料为普通三倍体毛白杨 2 个转 Ri 质粒 T-
DNA 的三倍体毛白杨株系 63 和 01［9］，及 63 株系再次
转入 rolB 基因获得的 63B 组株系(163B、263B、463B、
663B、863B)和 01 株系再次转入 rolB 基因获得的 01B
组株系(101B、401B、601B、801B)［10］。对照为未转基
因三倍体毛白杨组培苗。所有材料为 2008 年春季移
栽的组培苗，常规管理。
1. 3 测定方法
1. 3. 1 苗期生长 在生长期结束苗木停止生长后，每
个株系随机选择 5 株苗木，用直尺和游标卡尺测定
rolB 基因多拷贝株系 1 年生植株的苗高、节间距和地
径，所得数据采用 Excel 和 SPSS 软件进行统计分析。
1. 3. 2 叶绿素含量 参照刘秀丽等的方法［11］，用打
孔器取新鲜叶片 0. 1g，重复 3 次，剪成 1mm 细条，放入
试管中。用丙酮 ∶乙醇 = 2 ∶ 1混合液 10ml 浸提。把放
有样品的试管封口，置室温避光处浸泡至无色，过滤得
到叶绿素提取液。将叶绿素提取液置 1cm 厚的比色
皿中，用丙酮 ∶乙醇 = 2∶ 1混合液作参比，用 UV8500 型
分光光度计分别在 663、645nm 波长处测定叶绿素 a、b
的吸光值，并计算叶绿素含量。
1. 3. 3 光合性状 2008 年 8 月 15 － 20 日之间，晴天
上午 8:00 － 9:00，用美国生产的便携式 CI-301PS 型光
合分析仪测定叶片的净光合速率(Pn)、蒸腾速率
(Tr)、气孔导度(Gs)和胞间 CO2 浓度(Ci)等指标，开
放气路。每个株系随机选取 3 ～ 5 株，选择枝条中部成
熟的主要功能叶片进行测定，在不同时期测定 3 次，计
算其平均值。
2 结果与分析
2. 1 苗高生长的变化
2. 1. 1 rolB 基因多拷贝株系苗高的变化 由图 1 可
以看出，Ri 质粒转化株系的 1 年生苗木的苗高低于未
转基因三倍体毛白杨，其中株系 63 的平均苗高为
0. 76m，株系 01 的平均苗高为 0. 59m，均未超过 1m，而
未转基因三倍体毛白杨的平均苗高达到了 1. 17m。
rolB 基因多拷贝株系的平均苗高也全部低于未转基因
三倍体毛白杨，大部分低于其转 Ri 质粒的对照株系。
其中株系 863B 的长势最好，平均苗高达 0. 80m，株系
801B 的长势最弱，苗高均值为 0. 28m。
33
核 农 学 报 25 卷
图 1 rolB 基因多拷贝株系的苗高
Fig. 1 Seedling height of rolB transgenic plants
2. 1. 2 rolB 基因多拷贝株系节间距的变化 由图 2
可知，rolB 基因多拷贝株系与 Ri 质粒转化株系的 1 年
生苗木节间距均小于未转基因三倍体毛白杨，其节间
距均值在 4cm 以上，而其他株系的节间距均值都在
2. 5cm 以下。但各 rolB 基因多拷贝株系与 Ri 质粒转
化株系的节间距差异不大，其中节间距最大的株系为
263B，最小的株系为 101B，均值相差 0. 97cm。
图 2 rolB 基因多拷贝株系节的间距
Fig. 2 Internode length of rolB transgenic plants
2. 1. 3 rolB 基因多拷贝株系地径的变化 由图 3 可
知，未转基因三倍体毛白杨的地径大于 rolB 基因多拷
贝株系的。但 rolB 基因多拷贝株系与 Ri 质粒转化株
系相比，却没有规律性的变化。地径最大的株系为 CK
和 863B，均达到 1. 01cm，地径最小的株系为 801B，仅
达到 0. 5cm。
图 3 rolB 基因多拷贝株系的地径
Fig. 3 Ground diameter of rolB transgenic plants
2. 2 rolB 基因多拷贝株系叶绿素含量的差异
由表 1 可以看出，未转基因三倍体毛白杨株系叶
片中的叶绿素 a、b 和 a + b 含量最高，分别达到了
1. 567 ± 0. 042mg / g FW、0. 486 ± 0. 042mg / g FW 和
2. 053 ± 0. 084mg / g FW。其中，在 63B 组株系中，3 个
株系的叶绿素 a 含量、4 个株系的叶绿素 b 含量和 4
个株系的叶绿素 a + b 含量分别高于其转 Ri 质粒的对
照 63，而 01B 组株系的变化较为一致，叶绿素 a、b 和 a
+ b 的含量都低于其转 Ri 质粒的对照 01。
2. 3 rolB 基因多拷贝株系的光合性状差异
由表 2 可知，对供试材料的净光合速率进行比较，
rolB 基因多拷贝株系、Ri 质粒转化株系均低于未转基
因三倍体毛白杨。在 63B 组多拷贝株系中，净光合速
率低于其转 Ri 质粒对照的比率为 60%;在 01B 组多
拷贝株系中，净光合速率低于其转 Ri 质粒对照的比率
为 75%。
对供试材料的蒸腾速率、气孔导度和胞间 CO2 浓
度进行比较，未转基因三倍体毛白杨与 rolB 基因多拷
贝株系和 Ri 质粒转化株系均存在无规律性的差异。
在蒸腾速率方面，未转基因三倍体毛白杨低于大部分
63B 组多拷贝株系、全部 01B 组多拷贝株系和全部 Ri
质粒转化株系，其中，80% 的 63B 组株系低于其转 Ri
质粒对照，50%的 01B 组株系低于其转 Ri 质粒对照;
在气孔导度方面，80%的 63B 组株系气孔导度低于其
转 Ri 质粒对照，75%的 01B 组株系气孔导度低于其转
Ri 质粒对照;在胞间 CO2 浓度方面，未转基因三倍体
毛白杨的含量高于大部分转基因株系和全部 Ri 质粒
转化株系，60%的 63B 组株系低于其转 Ri 质粒对照，
75%的 01B 组株系低于其转 Ri 质粒对照。
43
1 期 外源 rolB 基因对已转 Ri 质粒的杨树苗期生长与光合特性的影响
表 1 rolB 基因多拷贝株系的叶绿素含量
Table 1 Chlorophyll content of rolB transgenic plants
试验株系
experimental line
叶绿素 a
chlorophy a (mg / g FW)
叶绿素 b
chlorophy b(mg / g FW)
叶绿素 a + b
chlorophy a + b (mg / g FW)
叶绿素 a / b
chlorophy a / b
CK 1. 567 ± 0. 042 0. 486 ± 0. 042 2. 053 ± 0. 084 3. 222
63 0. 641 ± 0. 049 0. 206 ± 0. 028 0. 847 ± 0. 077 3. 080
163B 0. 753 ± 0. 048 0. 240 ± 0. 020 0. 992 ± 0. 068 3. 143
263B 1. 023 ± 0. 050 0. 315 ± 0. 037 1. 338 ± 0. 186 3. 241
463B 0. 629 ± 0. 037 0. 253 ± 0. 011 0. 882 ± 0. 047 2. 487
663B 0. 386 ± 0. 048 0. 136 ± 0. 018 0. 522 ± 0. 066 2. 834
863B 1. 000 ± 0. 030 0. 324 ± 0. 079 1. 324 ± 0. 021 3. 139
01 1. 042 ± 0. 076 0. 374 ± 0. 033 1. 415 ± 0. 109 2. 792
101B 0. 847 ± 0. 056 0. 314 ± 0. 054 1. 160 ± 0. 107 2. 728
401B 0. 804 ± 0. 020 0. 247 ± 0. 050 1. 051 ± 0. 025 3. 231
601B 0. 967 ± 0. 024 0. 351 ± 0. 020 1. 318 ± 0. 043 2. 752
801B 0. 483 ± 0. 044 0. 195 ± 0. 010 0. 678 ± 0. 053 2. 478
表 2 rolB 基因多拷贝株系的 Pn、Tr、Gs 和 Ci 值
Table 2 Pn，Tr，Gs，Ci of rolB transgenic plants
试验株系
experimental line
净光合速率(Pn)
photosynthesize rate
(μmol /m2·s)
蒸腾速率(Tr)
transpiratory rate
(μmol /m2·s)
气孔导度(Gs)
stomatal resistance
(μmol /m2·s)
胞间 CO2 浓度(Ci)
intercellular CO2 concentrations
(‰)
CK 28. 24 ± 3. 96 9. 06 ± 0. 28 0. 91 ± 0. 35 0. 341 ± 0. 009
63 16. 32 ± 3. 26 13. 14 ± 0. 81 1. 05 ± 0. 02 0. 312 ± 0. 003
163B 16. 11 ± 2. 36 9. 40 ± 1. 31 1. 06 ± 0. 05 0. 307 ± 0. 013
263B 17. 08 ± 0. 53 12. 46 ± 0. 19 0. 99 ± 0. 05 0. 304 ± 0. 004
463B 8. 73 ± 1. 55 8. 59 ± 1. 19 0. 38 ± 0. 02 0. 339 ± 0. 012
663B 10. 43 ± 1. 59 7. 87 ± 0. 50 0. 81 ± 0. 18 0. 350 ± 0. 001
863B 19. 99 ± 3. 57 13. 51 ± 0. 33 0. 94 ± 0. 08 0. 293 ± 0. 004
01 12. 75 ± 0. 95 10. 93 ± 0. 60 1. 39 ± 0. 41 0. 331 ± 0. 008
101B 9. 91 ± 2. 84 13. 17 ± 0. 76 1. 51 ± 0. 08 0. 360 ± 0. 013
401B 16. 06 ± 1. 28 13. 25 ± 1. 47 1. 15 ± 0. 48 0. 317 ± 0. 008
601B 10. 12 ± 1. 71 10. 39 ± 0. 42 0. 77 ± 0. 07 0. 326 ± 0. 009
801B 12. 13 ± 2. 89 9. 79 ± 0. 07 0. 92 ± 0. 01 0. 312 ± 0. 008
3 结论与讨论
在将 Ri 质粒上 T-DNA 区中的 rolB 基因转入经 Ri
质粒(其上包含 rol 基因)转化的三倍体毛白杨后，使
rolB 基因在转基因植株中形成多拷贝。根据本试验结
果，rolB 基因多拷贝株系和 Ri 质粒转化株系的苗高、
节间距和地径，(除了多拷贝株系 863B 的地径与未转
基因三倍体毛白杨一样之外)均低于未转基因三倍体
毛白杨。这说明 rolB 基因的表达降低了转化植株的
苗高、节间距和地径，对转化植株茎干的形成层生长具
有一定影响。多拷贝株系的苗高、节间距和地径与 Ri
质粒转化株系相比较，一些株系的生长指标超过了 Ri
质粒转化株系，而一些株系的生长指标则进一步下降，
表现出了无规律的变化情况。这说明 rolB 基因的插
入位置不同，从而导致表达量的不同，进而对植物生长
产生的影响也不同。
叶绿素变异是一种十分明显的性状突变，在几乎
所有的植物上都有发生，转基因无性系间的差异更加
明显。本试验测定了 rolB 基因多拷贝株系、Ri 质粒转
化株系和未转基因三倍体毛白杨的叶绿素含量，结果
表明所有转基因株系的叶绿素 a、b 和 a + b 含量均低
于未转基因三倍体毛白杨，说明 rolB 基因的表达显著
降低了植株叶片内的叶绿素含量，干扰了杨树叶片组
织中叶绿素的正常合成。
光合作用是树木生长的物质基础，叶片光合速率
的高低直接影响林木的生长和产量。对杨树不同无性
系间光合特性的变异已进行了许多研究［12 ～ 15］。通过
对供试材料的光合性状进行比较，rolB 基因多拷贝株
系和 Ri 质粒转化株系的净光合速率普遍低于未转基
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Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2010，25(1):0032 ～ 0036
因三倍体毛白杨。这说明 rolB 基因的表达对植物叶
片组织的光合性状存在影响，也可能是 rolB 基因的表
达干扰了叶绿素的正常合成，进而影响到植物的净光
合速率。将 rolB 基因多拷贝株系与 Ri 质粒转化株系
进行比较，发现不同多拷贝株系间的差异较大，一些株
系的净光合速率得到加强，而另一些却减弱。分析其
原因可能是由于多拷贝 rolB 基因的插入位点不同，造
成其表达量各异，进而影响到植物的叶绿素含量与净
光合速率。另外，通过对蒸腾速率、气孔导度及胞间
CO2 浓度的比较，rolB 基因多拷贝株系与未转基因三
倍体毛白杨和 Ri 质粒转化株系均存在无规律性的差
异。
在比较各株系的叶绿素含量和净光合速率的试验
中，还观察到某些转基因无性系的叶绿素含量保持较
高的水平，而净光合速率却下降的现象，可能是由于光
合作用的暗反应跟不上光反应而引起的［16］，也可能与
光氧化或光抑制有关，深入的研究正在进行中。
一般认为，转基因植株中外源基因拷贝数与表达
量不一定有直接关系，即拷贝数多的基因表达量不一
定高，而且多拷贝还可能造成基因的共抑制，反而降低
了基因的表达量［17］。许多研究表明，多拷贝的转基因
整合到染色体上，通过异位配对引起染色质结构的变
化，重复序列位点染色质发生收缩，即异染色质化，从
空间上阻碍了转录因子与转基因上的启动子结合，使
基因处于关闭状态，可以使转基因表达受到干扰［18］。
rolB 基因转化的三倍体毛白杨表现出了丰富的遗
传多样性，根据本试验的结果，其多样性反映在转化植
株苗期的生长变异及光合特性上。转化植株的多样性
为三倍体毛白杨育种提供了大量的原始材料，也为进
一步选育优良的转基因无性系及研究基因的功能奠定
了基础。
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