全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 022224204
高产琥珀酸产生菌的60 Coγ射线诱变选育
李兴江　魏兆军　姜绍通　潘丽军
(合肥工业大学生物与食品工程学院 ,安徽 合肥　230009)
摘 　要 :产琥珀酸放线杆菌的主要副产物是乙酸 ,为了有效降低乙酸的生成 ,采用 60 Coγ射线为诱变源 ,
反复筛选氟乙酸抗性突变株。结果表明 ,当 60 Coγ射线诱变剂量为 500Gy 以及氟乙酸浓度为 20gΠL 时 ,
与出发菌株相比 ,所获突变株 HF417 的乙酸浓度由 2517gΠL 降低到 415gΠL ,琥珀酸由 45gΠL 增加到 67gΠ
L ,磷乙酰转移酶最高酶活由 528UΠmg 降低到 112UΠmg ,进一步的基因序列分析表明 ,pta 基因 (磷乙酰转
移酶基因)片段保守序列中发生的 4 处突变 ,是导致磷乙酰转移酶酶活降低的根本原因。因此 ,针对副
产物代谢途径的定向阻断选育能够有效提高琥珀酸产量。
关键词 :产琥珀酸放线杆菌 ;磷乙酰转移酶 ;氟乙酸抗性
SCREENING OF HIGH SUCCINIC ACID PRODUCING STRAIN BY 60 Coγ2IRRADIATION
LI Xing2jiang 　WEI Zhao2jun 　J IANG Shao2tong 　PAN Li2jun
( School of Biotechnology and Food Engineering , Hefei University of Technology , Hefei , Anhui 　230009)
Abstract :Acetic acid as by2product was produced in the fermentation of succinic acid by Actionbacillus succinogenes. With
60 Coγ2irradiation , the pta2deficient strain was expected to be obtained through screening those anti2fluoroacetate mutant
strains repeatedly. A potential mutant strain HF417 was obtained with 500Gy 60 Coγ2irradiation and scteened by using 20gΠL
concentration of fluoroacetate , Comparison with the parent strain , the succinic acid concentration of the mutant strain HF417
was increased to 67gΠL from 45gΠL , the acetic acid was decreased to 415gΠL from 2517gΠL , and the optimal
phosphotransacetylase enzyme activity was decreased to 112UΠmg from 528UΠmg , respectively. Further gene sequences analysis
showed that 4 mutated sites were founded in pta gene (the gene of phosphotransacetylase) of mutant strain HF417 , which
explained the increasing of phosphotransacetylase enzyme activity. It was concluded that the derective breeding method aiming
at the metabolic interdiction of acetic acid could increase the yield of succinic acid effectively.
Key words : Actinobacillus succinogenes ; phosphotransacetylase ; anti2fluoroacetate
收稿日期 :2008208228 　接受日期 :2008211205
基金项目 :国家科技支撑计划 ( 2007BAD34B01) , 国家“863”计划 ( 2007AA10Z361) , 教育部博士点基金 ( 200803590001) , 安徽省自然基金
(070411024) ,合肥工业大学科学研究发展基金 (073002F)
作者简介 :李兴江 (19782) ,男 ,安徽五河人 ,讲师 ,博士 ,从事发酵工程研究。E2mail : lixingjiang1978 @hfut . edu. cn　　琥珀酸广泛应用于食品、医药、油漆、塑料等行业[1 ] ,可以合成 250 种以上的化工产品 ,但目前琥珀酸主要依赖石化原料制备 ,使其广泛应用受到限制[2 ] 。微生物发酵法制备琥珀酸 ,不仅摆脱了对石化原料的依赖 ,而且开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径 ,使琥珀酸成为未来最重要的生物基化工产品之一[3 ] ,其工业规模的微生物转化将成为一个最具发展潜力的绿色工艺模式[4 ] ,将会撑起一个全新的四碳化合物开发 利用平台。许多琥珀酸产生菌是从瘤胃中分离出来的[5 ] ,产琥珀酸放线杆菌就是其中最重要的一种[6 ] 。产琥珀酸放线杆菌在反刍动物瘤胃中能够广泛利用纤维、半纤维、纤维二糖以及大部分六碳糖和五碳糖作为原料合成琥珀酸[7 ] ,同时伴有大量副产物乙酸出现 ,如何对菌株进行选育从而降低副产物产量并提高琥珀酸产量是研究重点[8 ] 。在众多的琥珀酸发酵研究中 , 以
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McKinlay[6 ]与 Van der Werf [9 ] 的研究成果最为杰出 ,他
们的最高产琥珀酸生产速率分别为 0193mmolΠ(g(cell) ·
h)与 0180mmolΠ(g(cell) ·h) 。
辐射诱变是一种有效的育种方法 ,该方法具有突
变率高、后代性状稳定、育种周期短等优点[10 ] 。60 Coγ
射线是一种高能电磁波 ,其诱发的突变率和射线剂量
直接有关。它能产生电离作用 ,直接或间接地改变
DNA 结构[11 ] 。本研究对产琥珀酸放线杆菌进行60 Coγ
射线诱变 ,旨在筛选氟乙酸抗性突变株 ,以期降低副产
物乙酸的产量 ,并同时对突变株进行表征。
1 　材料与方法
111 　材料
11111 　菌种 　产琥珀酸放线杆菌 ( Actinobacillus
succinogenes) ,本实验室保藏。
11112 　培养基及发酵 　发酵培养基 :葡萄糖 100gΠL ,
CSL 15gΠL , 酵母浸粉 10gΠL ,NaH2 PO4 ·2H2O 1116gΠL ,
Na2 HPO4 ·12H2O 017gΠL , NaCl 110gΠL , MgCl2 ·6H2O
012gΠL ,CaCl2 012gΠL ,CaCO3 40gΠL ,TSB 5gΠL ;氟乙酸固
体筛选培养基 :在发酵培养基的基础上添加氟乙酸 5
～20gΠL。37 ℃条件下进行 CO2 厌氧发酵。
11113 　主要试剂与设备 　60 Coγ辐照由中国科技大学
国家同步辐射重点实验室提供 ;J Y922Ⅱ超声波细胞粉
碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司 ;UV21201
紫外可见分光光度计购自北京瑞利分析仪器公司 ;台
式高速冷冻离心机购自美国Marca Reg 公司 ;高效液相
色谱 ( HPLC) 为惠普 1100 系列高效液相色谱系统 ;高
效毛细管电泳色谱 ( HPCE) 采用美国 Beckman Coulter
公司 PΠACE MDQ 型毛细管电泳仪 ;厌氧培养系统为
CBJS25BΠ2 ;DNA 提取、回收及反应试剂均购自大连宝
生物工程 ,PCR 引物合成也由该公司完成。
112 　方法
11211 　糖检测 　HPLC 检测 , 色谱柱为 ZORBAX
Carbohydrate 416mm ×150mm , 5μm ,检测器为视差检测
器 ,进样量 5μl ,室温条件 ,流动相位 75 %乙腈 ,流速为
1100mlΠmin。
11212 　有机酸检测 　HPCE 检测 ,石英毛细管内径
75μm ,外径 375μm ,有效长度 50cm ,以 500mmolΠL H3 PO4
及 015mmolΠL CTAB (pH615 ,以 10molΠL NaOH 调节) 为
运行电解质 ,运行电压 9kV ,运行时间 20min ,柱温
20 ℃,检测波长 200nm。
11213 　60 Coγ辐射诱变及氟乙酸抗性株的筛选 　无菌
制备 107 个Πml 菌悬液 ,分别采用 100～700Gy 剂量的
60 Coγ射线辐照 ,同时以未经辐照的菌悬液为对照。
将经过60 Coγ辐照处理的菌株涂布于含有 5gΠL 氟乙酸
盐的固体平板上培养 ,挑取生长旺盛菌落 ,采用上述方
法继续诱变 ,并依次增加氟乙酸浓度至 20gΠL。
11214 　酶活检测及分析 　磷乙酰转移酶酶活的检测
方法参考文献[9 ] ,突变株与出发菌株的磷乙酰转移酶
活比较采用 40h 内每隔 8h 取样进行分析。
11215 　菌株突变前后的 pta 基因对比分析 　对磷酸
乙酰转移酶活力降低的阳性突变株进行 pta 基因克隆
分析 , 原始菌株及突变株克隆引物相同 , H1 : 5′2
ATGTCTCGTACATTTATTCT23′, H2 : 5′2TTAAGCT
TGCGTAGCCTGAA23′。PCR 反应 : 25μl PCR 反应基本
体系中 ,10 ×Buffer 215μl ,dNTP (215mmolΠL) 2μl ,H1 (20
皮摩尔) 1μl ,H2 (20 皮摩尔) 1μl , Taq 酶 (20UΠμl) 012μl ,
模板 DNA 1μl ,用水补足到 25μl。PCR 反应条件为 :
94 ℃5min ;94 ℃40s ,55 ℃40s ,72 ℃1min 40s ,35 个循
环 ;72 ℃10min。扩增得到的 PCR 产物使用试剂盒纯
化 ;取 1μl 回收的 PCR 产物 ,按照 pMD18T载体试剂盒
说明书 ,16 ℃连接 1h 以上 ;取连接混合物 315μl 加到
200μl 感受态细胞液中 ,冰浴 30min 后转化 ;再对阳性
克隆株进行 PCR 鉴定 ;序列测定由大连宝生物工程公
司完成。
2 　结果与分析
211 　pta 途径缺陷型菌株的筛选机理分析
因出发菌株具有很高的磷乙酰转移酶酶活 ,所以
将乙酰辅酶 A 转化生成大量副产物乙酸 ,同时 ,若将
出发菌株涂布于氟乙酸平板上 ,由于高酶活的磷乙酰
转移酶可将氟乙酸转化为氟乙酰辅酶 A ,而氟乙酰辅
酶 A 进入柠檬酸循环 ( TCA) 后迅速引起细胞致死效
应 ,从而造成出发菌株不能够在氟乙酸平板生长。但
是 ,如果对菌株进行大量的诱变处理 ,一旦造成细胞的
磷乙酰转移酶合成出现障碍 ,则该类突变株的氟乙酸
致死效应就会消失 ,进而能够在氟乙酸平板生长。而
磷乙酰转移酶的降低将进一步降低乙酸的生成 ,最终
实现选育目的。产琥珀酸放线杆菌的简单代谢图见
图 1[6 ] 。
212 　60 Coγ射线对菌株的致死效应
分别采用 100～700Gy 剂量的60 Coγ射线对菌株进
行辐照 ,其致死率见图 2。
从图 2 可看出 ,在60 Coγ射线诱变的过程中 ,随着
辐照剂量的增大 ,射线对产琥珀酸放线杆菌的致死率
522　2 期 高产琥珀酸产生菌的60Coγ射线诱变选育
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图 1 　产琥珀酸放线杆菌代谢简图
Fig. 1 　Basic metabolic pathway for
Actinobacillus succinogenes
图 2 　60 Coγ射线对菌株的致死率曲线
Fig. 2 　Effection of 60 Coγ irradiation on the
lethal rate of Actionbacillus succinogenes
逐渐升高 ,在剂量为 700Gy 时 ,致死率接近 100 % ,而过
低剂量辐照时正突变率小且筛选工作量较大 ,因此本
试验选取致死率为 85 %时的 500Gy 剂量进行诱变
选育。
213 　氟乙酸抗性株的筛选
结合 11213 的方法 ,最终筛选出高浓度氟乙酸抗
性株 Actinobacillus succinogenes HF417。
214 　突变株与出发株的乙酸生成比较
将突变株与出发株同时进行 40h 的发酵 ,每隔 8h
取样检测 ,将突变株与出发株的乙酸生成情况进行对
比分析 ,结果见图 3。
从图 3 可以看出 ,与出发菌株相比 ,突变株的副产
物乙酸产量明显降低 ,由于其磷乙酰转移酶代谢可能
出现障碍 ,故所筛突变株具有氟乙酸抗性 ,从而进一步
导致乙酸合成受阻。
图 3 　突变株与出发株的乙酸生成比较
Fig. 3 　Comparison of the acetic adid production
of mutant strain with that of parent strain
215 　突变株与出发株的琥珀酸生成比较
每隔 8h 取样检测琥珀酸的产量 ,将突变株与出发
株的琥珀酸生成情况进行对比分析 ,结果见图 4。
图 4 　突变株与出发株的琥珀酸生成比较
Fig. 4 　Comparison of the succinic acid production
from mutant strain with that from parent strain
由图 4 可以看出 ,与出发菌株相比 ,突变株的琥珀
酸产量明显提高 ,经过 40h 发酵 ,由 45gΠL 增至 67gΠL。
可见突变株在降低副产物乙酸的同时 ,乙酸的碳代谢
被有效转移到琥珀酸的生成途径中 ,使得突变株琥珀
酸产量大大提高。
216 　突变株与出发株的磷乙酰转移酶酶活性比较
对发酵过程中的磷乙酰转移酶酶活性检测 ,结果
见图 5。
图 5 　发酵过程中突变株与出发株的
磷乙酰转移酶酶活性比较
Fig. 5 　Comparison of phosphotransace tylase activity
from mutant strain with that from parent one
in the fermentation
图 5 显示 , 突变株的磷乙酰转移酶最高酶活
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(112UΠmg)明显低于出发菌株 (528UΠmg) 。且在整个发
酵过程中 ,突变株的磷乙酰转移酶都明显较出发菌株
低 ,可见突变株的副产物乙酸的降低是由磷乙酰转移
酶酶活性的降低导致的。
217 　突变株的 pta 基因分析 经对突变株的 pta 基因序列进行克隆与测序 (原菌株的 pta 基因序列号为 : EU256480 ,突变株的 pta 基因序列序列号为 : EU284747) ,进一步将突变株的 pta基因序列与出发菌株的 pta 基因序列对比分析 ,结果见图 6。　　
图 6 　出发菌株与突变株的 pta 基因序列对比
Fig. 6 　Comparison of pta gene sequences of mutant strain with that of parent one
图中每两行的第一行为出发菌株的 pta 基因序列 ,第二行为突变株的 pta 基因序列 ,包括被省略的序列在内 ,
从第 1 位以 ATG为起始密码子开始阅读框的阅读。
from Fig16 , the first line was for the pta gene of parent strain and the second line was for that of mutant strain ,
and both of the ORF were begun with the“ATG”codon , which was locted at the head of the sequence
　　由图 6 的对比分析可知 ,该基因产生了 4 个突变
位点 ,其中第 1 个突变位点造成缬氨酸突变为亮氨酸 ,
第 4 个突变位点造成亮氨酸突变为缬氨酸 ,且生物信
息学分析表明 ,这两个突变位点均处于该类基因的保
守序列位置 ,因此基因序列的突变影响了其编码的氨
基酸及酶蛋白的表达。
3 　结论
通过60 Coγ射线诱变并结合氟乙酸抗性平板筛选
获得了 1 株优良突变株 Actinobacillus succinogenes
HF417。发酵的产物检测分析显示 ,该菌株副产物乙
酸的产量大大降低 ,且琥珀酸得到了明显提高。同时
酶活分析发现突变株磷乙酰转移酶酶活性显著降低 ,
针对突变株 pta 基因的分子表征解释了突变株代谢改
变的机理 ,最终突变株产琥珀酸浓度达到 67gΠL ,具有
工业开发潜力。
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