全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 032413205
秋水仙素诱导石斛多倍体的初步研究
张　莹1 ,2 　王　雁1 　李振坚1
(11 中国林业科学研究院林业研究所 ,北京　100091 ;
21 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 ,浙江 富阳　311400)
摘　要 :本试验以秋水仙素为诱导剂 ,对石斛杂交种 Dendrobium utopia‘Messenger’×Den . whiterabbit
‘Sakurahime’的二倍体试管苗进行了多倍体诱导、细胞学观察及染色体鉴定等研究。结果表明 ,当秋水
仙素浓度为 014 ～016mgΠL 时石斛的诱导率较高 ,最高时可达 6212 %。变异植株的叶片变短变厚 ,假鳞
茎明显增粗。在显微镜下观察到变异株的气孔长度和宽度约增加 21144 %和 28130 % ,保卫细胞的长度
和宽度约增加 30188 %和 24198 %。
关键词 :石斛 ; 组织培养 ; 秋水仙素 ; 多倍体
PRIMARY STUDY ON POLYPLOID OF Dendrobium HYBRID INDUCED BY COLCHICINES
ZHANG Ying1 ,2 　WANG Yan1 — LI Zhen2Jian1
(11 Research Institute of Forestry , Chinese Academy of Forestry , Beijing 　100091 ;
21 Research Institute of Subtropical Forest , Chinese Academy of Forestry , Fuyang , Zhejiang 　311400)
Abstract :The tube seedlings of dendrobium hybrids was induced by colchicines , and morphology observation and cytology
identification of the polyploid seedlings were carried out . The results indicated that the mutation rate could reach 6212 % under
0104 %～0106 % colchicines treatment . The leaves of mutants were shorter and thicker than normal plants and the pseudobulb
enlarged obviously. Microscope observation indicated that the length and width of stoma increased 21. 44 %and 28130 % , and
the length and width of guard cells increased 30. 88 %and 24. 98 % , respectively.
Key words : Dendrobium ; tissue culture ; colchicines ; polyploid
收稿日期 :2008211223 　接受日期 :2009202217
基金项目 :国家林业局 948 项目 (200524237 ,2006242C07) ,中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目 (RISF6801)
作者简介 :张莹 (19822) ,女 ,山东菏泽人 ,硕士 ,研究实习员 ,从事园林植物的应用等研究。E2mail :lingchenzy @1631com
通讯作者 :王雁 (19692) ,女 ,黑龙江哈尔滨人 ,研究员 ,硕士生导师 ,从事园林植物应用研究。E2mail :wangyan @caf . ac. cn　　运用组织培养技术结合秋水仙素诱变处理进行植物选育是一条重要的育种途径。近年来很多研究机构先后对春兰[1 ] 、三色堇[2 ] 、菊花脑[3 ] 及地锦[4 ] 等观赏植物进行了染色体加倍与新品种选育的研究 ,并取得了一定进展。石斛属 ( Dendrobium) 为兰科 (Orchiddaceae)的第二大属 ,石斛属植物不仅具有药用价值 ,更具有较高的观赏价值 ,是世界著名的盆花和切花[5 ] 。石斛多附生在热带、亚热带原始森林的悬崖峭壁上或高大乔木树干上 ,独特的生存环境使石斛异地栽培时会受温度、光照等条件的限制[6 ] 。为增强其观赏性和对环境的适应性 ,并且培育出具自主知识产权的新品种 ,本试 验以石斛二倍体不定芽为材料进行诱变处理 ,以获得多倍体植株 ,从中选育出优良多倍体品种。1 　材料和方法111 　材料取杂交成功率较高的石斛属紫色系大花型品种‘信使’Den . utopia‘Messenger’和白色系大花型品种Den . whiterabbit‘Sakurahime’进行杂交 ,获得优良杂交种 Den . utopia ‘Messenger ’ × Den . whiterabbit‘Sakurahime’。本试验以该杂交种二倍体的试管苗为
314　核 农 学 报　2009 ,23 (3) :413～417Journal of Nuclear Agricultural Sciences
材料。
112 　方法
11211 石斛多倍体的诱导　在 MS 培养基上培养 Den .
utopia‘Messenger’×Den . whiterabbit‘Sakurahime’的
试管苗 ,培养温度为 25 ℃±2 ℃,光照强度为 40μmolΠ
m
2·s , 光照时间为 12hΠd。秋水仙素浓度分别为 012、
014、016 和 018mgΠL。分 2 种方法处理 : (1)秋水仙素浸
泡诱导法 :在无菌条件下 ,将试管苗浸泡在 4 种不同浓
度的秋水仙素溶液中分别处理 12 和 24h ,用无菌水冲
洗后接种到 MS 培养基上培养成苗。(2) 培养基中加
入秋水仙素诱导法 :将试管苗接种在含不同浓度秋水
仙素的固体培养基中诱导加倍 ,培养 20d 后将不定芽
洗净转接到新鲜的 MS 培养基中培养成苗。
11212 　形态观察及细胞学鉴定 　选取生长稳定的变
异植株 ,对其外部形态如叶片厚度、形状 ,假鳞茎的高
度和粗度 ,根的长度和粗度等进行观察、测量和分析 ;
用尖嘴镊子撕取植株基部向上第 2～3 片叶的下表皮 ,
撕取部位尽量均匀 ,置于载玻片上 ,加 1 滴无菌水 ,盖
上盖玻片 ,在 OLYMPUS 显微镜下观察叶片气孔和保
卫细胞大小及叶绿体数目。
2 　结果与分析
211 　秋水仙素处理对石斛诱导率的影响
21111 　浸泡法　采用不同浓度秋水仙素浸泡和不同
时间处理对材料诱导率与死亡率的影响见表 1。由表
1 可以看出 ,不同浓度秋水仙素和不同处理时间对石
斛不定芽的死亡率和诱导率有明显影响。随着秋水仙
素浓度的增高 ,石斛的死亡率逐渐升高 ,当浓度为
018mgΠL 时 ,死亡率达到最高 ,为 4718 % ;而诱导率随
秋水仙素浓度加大呈先升高后降低的趋势 ,以 016mgΠ
L 的秋水仙素处理 24h 时的诱导率最大 ,达 6010 % ,其
次是 016mgΠL 秋水仙素处理 12h ,诱导率达 5516 %。对
数据进行统计分析显示 ,秋水仙素浓度为 016 和 018mgΠ
L 时 ,处理时间对各浓度下诱导率的影响差异不显著 ;
秋水仙素浓度为 012mgΠL 处理 24h 与 014mgΠL 处理 12h
间 ,秋水仙素浓度为 014mgΠL 处理 24h 与 016mgΠL 处理
12h 间的诱导率和死亡率差异均不显著 ,说明在对石斛
不定芽进行诱变处理时 ,低浓度、长时间的药剂处理与
高浓度、短时间的药剂处理效果大致相同。
表 1 　不同浓度秋水仙素浸泡与时间处理对石斛不定芽的诱导效果
Table 1 　Mutagenic effects on buds of Dendrobium hybrid (method 1 :soaked at colchicines solution)
浓度
concentration
(mgΠL) 时间soaking time(h) 处理数No. oftreated samples 死亡数No. ofdeath 死亡率rate ofdeath ( %) 平均值average( %) 变异数No. ofmutagenesis 诱导率rate ofmutagenesis( %) 平均值average( %)
012 12 30 2 617 819 e 6 20 20 e
30 3 10 5 1617
30 3 10 7 2313
24 30 7 2313 2414 cd 12 40 3516 cd
30 8 2617 10 3313
30 7 2313 10 3313
014 12 30 6 20 2212 d 11 3617 3617 c
30 8 2617 12 40
30 6 20 10 3313
24 30 8 2617 3111 bc 15 50 50 b
30 10 3313 17 5617
30 10 3313 13 4313
016 12 30 7 2313 2516 cd 18 60 5516 ab
30 9 30 16 5313
30 7 2313 16 5313
24 30 11 3617 3212 bc 17 5617 6010 a
30 9 30 18 60
30 9 30 19 6313
018 12 30 10 3313 3718 b 8 2617 3212 cd
30 12 40 11 3617
30 12 40 10 3313
24 30 13 4313 4718 a 7 2313 2617 de
30 15 50 9 30
30 15 50 8 2617
414 核　农　学　报 23 卷
21112 　培养基诱导法 　培养基中加入不同浓度秋水
仙素和不同时间处理对材料诱导率和死亡率的影响见
表 2。由表 2 可以看出 ,不定芽在初始浓度为 012mgΠL
时诱导率即达到较高值 4111 % ,比浸泡法同浓度下的
诱导率高 2111 % ;当浓度为 016mgΠL 时诱导率达最高
值 ,为 6212 %。对数据进行统计分析显示 , 014 和
016mgΠL、012 和 018mgΠL 两种浓度处理之间的诱导率
差异均不显著。与表 1 相比 ,培养基诱导法 (表 2) 中
每种浓度下不定芽的诱导率均比浸泡法中的诱导率要
高 ,而死亡率又较浸泡法要低。由此可以推断 ,诱导不
定芽较适宜的方法是培养基中加入秋水仙素诱导法。
但是利用此方法对石斛不定芽进行处理后 ,不定芽的
生长速度变慢 ,生长势也较差 ,且随着培养时间的延
长 ,不定芽不断有褐化死亡的现象。
212 　多倍体的初步鉴定
21211 　形态鉴定 　取变异株与正常株各 30 株 ,分别
测量它们的叶长、叶宽等形态参数 ,取其平均值 ,其外
表 2 　培养基中加入不同浓度秋水仙素对石斛不定芽的诱导效果
Table 2 　Mutagenic effects on buds of
Dendrobium hybrid treated with different concentration
colchicines(method 2 :added colchicines in medium)
浓度
concen2
tration
(mgΠL) 处理数No. oftreatment 死亡数No. ofdeath 死亡率rate ofdeath( %) 平均值average( %) 变异数No. ofmutage2nesis 诱导率rate ofmutage2nesis( %) 平均值average( %)
012 30 5 1617 1212 c 10 3313 4111 b
30 3 10 13 4313
30 3 10 14 4617
014 30 5 1617 2111 c 16 5313 5414 a
30 7 2313 16 5313
30 7 2313 17 5617
016 30 11 3617 3111 b 17 5617 6212 a
30 9 30 19 6313
30 8 2617 20 6617
018 30 15 5010 4313 a 10 3313 3819 b
30 11 3617 13 4313
30 13 4313 12 40
部形态参数比较见表 3。不定芽处理 5d 后 ,即有个别
出现变异现象 ,待长至 20d 左右 ,变异明显 (图 1 和图
2) ,变异苗主要表现为 :顶芽和侧芽膨大至球状 ,假鳞
茎变粗 ,茎粗增加量可达 167124 % ;外层叶片多呈畸
形 ,在生长过程中逐渐脱落 ,新生叶宽、短而厚 ,呈圆锥
形 ,变异株叶宽比正常株叶宽增加 71105 % ;叶色浓
绿 ,叶表面粗糙 ,凹凸不平 ,有泡状凸起 ,叶片脆而易折
断 ;苗前期不定芽生长势明显受到抑制 ,生长速度缓
慢 ,生根较晚 ,且根短而粗壮 ,变异株的根比正常株增
粗 9210 %。
图 1 　变异株
Fig. 1 　Mutagenesis plants
图 2 　变异株与正常株比较
Fig. 2 　Mutagenesis (left) and normal (right) plants
表 3 　变异株与正常株的外部形态观察
Table 3 　Comparison of seedlings morphology between mutagen and normal plants
材料
materials
叶长
leaf length
(cm)
叶宽
leaf width
(cm)
茎长
stem length
(cm)
茎粗
stem diameter
(cm)
根长
root length
(cm)
根粗
root diameter
(cm)
正常株 normal plants 2108 0138 1144 0158 2177 0125
变异株 mutagenesis plants 1123 0165 2103 1155 2101 0148
变异株较正常株的增加量 increased rate ( %) - 40187 71105 40197 167124 - 27144 9210
21212 　叶片气孔鉴定 　选正常株与变异株中有代表
性的外全展叶 4～6 片 ,在 10 ×40 倍显微镜下观察气
孔形态 (图 3 和图 4) ,并用测微尺随机测量 30 个气孔
及其保卫细胞的长度和宽度。从显微镜下可以发现变
514　3 期 秋水仙素诱导石斛多倍体的初步研究
异植株单位面积的气孔数目明显减少 ,大部分气孔与
正常二倍体的气孔形状相似 ,但体积要明显增大很多 ,
由于宽度增加的比例大 ,多倍体的气孔更接近于圆形 ,
而二倍体则多呈长圆形。多倍体中有些气孔的外形不
太规则 ,气孔的保卫细胞表现出一个大一个小 ,不像二
倍体气孔那样均匀 ,并且同一植株的同一部位的气孔 ,
图 3 　正常株气孔器
Fig. 3 　Stomas of normal plant (10 ×40)
其大小表现也不尽相同 ,这说明存在嵌合体现象。此
外 ,试验还发现保卫细胞中叶绿素的含量明显增多。
从表 4 可见 ,石斛多倍体气孔的长和宽比二倍体增加
了 21144 %和 28130 % , 保卫细胞的长和宽增加了
30188 %和 24198 %。
图 4 　变异株气孔器
Fig. 4 　Stomas of mutagenesis plant (10 ×40)
表 4 　多倍体与二倍体的气孔及保卫细胞大小的比较
Table 4 　Comparison of leaf stoma and guard cell size between polyploid and diploid
材料
materials
气孔及保卫
细胞数目
No. of stomas
and guard cell
气孔长度
stoma length
(μm)
气孔宽度
stoma width
(μm)
保卫细胞长度
guard cell length
(μm)
保卫细胞宽度
guard cell width
(μm)
二倍体 diploid 30 141279 121649 391286 141135
多倍体 polyploid 30 171340 161229 511417 171666
多倍体较二倍体的增加量 increased rate ( %) — 21144 28130 30188 24198
3 　讨论与小结
目前国内外学者对石斛的研究多集中在种质鉴
定[7～10 ] 、杂交育种[11 ,12 ] 、药用价值[13～16 ] 、转化体系及基
因克隆[17～22 ]等方面 ,对倍性育种的研究较少[23 ,24 ] 。在
石斛多倍体诱导过程中 ,采用组织培养结合秋水仙素
诱导的方法具有明显的优越性 :试验材料充足 ,试验条
件容易控制 ,试验结果重复性强 ,秋水仙素用量较少。
不同植物对秋水仙素的敏感度不同 ,一般植物如花叶
绿萝[25 ] 、金鱼草[26 ]等秋水仙素诱导多倍体处理浓度都
大于 110mgΠL ,而石斛用 012mgΠL 的浓度处理 24h 就可
达到 2414 %的诱导率 ,用 016mgΠL 的浓度处理 24h 就
可达到 6010 %的诱导率。因此石斛比一般植物对秋
水仙素更敏感。
试验中发现两个问题 :第一 ,采用培养基中添加秋
水仙素的方法处理材料 ,虽然转接前对不定芽进行了
无菌水冲洗的处理 ,但是由于诱导时间较长 ,秋水仙素
的抑制作用较大 ,植株生长一段时间后 ,部分材料逐渐
死亡。虽然此方法对石斛不定芽的诱导作用较用秋水
仙素浸泡法显著 ,但最终成活率却远低于浸泡法 ,故在
石斛多倍体诱导试验中 ,选择浸泡法处理较理想。第
二 ,在秋水仙素处理后的初代培养中 ,变异植株数量较
多 ,但是随着继代次数的增多 ,部分变异株的变异特征
逐渐消失 ,最终还原为正常植株 ,由此可以推测变异株
中存在混倍体植株。
变异植株的外部形态观察、气孔及保卫细胞的大
小比较等手段是选择石斛多倍体植株的一种间接有效
的方法 ,但是要具体判定变异植株的倍数还需依赖于
染色体鉴定和遗传分析。目前本研究尚未得到更为清
晰的染色体图片 ,但已采取多种改进方法 ,力求尽快明
确石斛变异植株的倍性。此外 ,部分变异株已移栽成
活 ,本研究将在温室对其进行进一步观察 ,以期筛选出
具目标性状的优良品种。
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