全 文 ：热带亚热带植物学报 2003，1 1(2)：181-189
Journa／of Tropical and Subtropical Botany
基因捕捉及其在植物基因分离和
功能基因组学上的应用
江树业 陈启锋 葛学军2
(1．福建农林大学作物遗传育种研究所，福建 福州 350002；2．中国科学院华南植物研究所，广东 广州 510650)
摘要 ：基因捕捉是一种报告基因的随机整合技术。基因捕捉系统已成为分离基因、鉴定基 因功能的重要手段。基因捕
捉(genetraps)包括增强子捕捉(enhancer廿ap)、启动子捕捉(promotertrap)和基因捕捉(genetrap)，通称为基因捕捉(gene
traps)。在增强子捕捉中，报告基因与一个基本启动子融合，这个启动子不能使报告基因表达，但可被临近 的增强子激
活。在启动子捕捉和基因捕捉中，报告基因的启动子被去除，融合基因只有以正确的方向插入到转录单元内才能表达。
对基因捕捉系统的结构特征、构建方法、应用范围、研究现状和应用前景等作 了系统论述，并对有关问题进行 了讨论。
关键词：基因捕捉；基因分离；功能基因组学
中图分类号 ：Q943．2 文献标识码 ：A 文章编号：1005—3395(2003)02—0181-09
Gene Traps and Their Applications 0n Plant
J 1r ● J● 1 1一 ■● l J ‘ I ene lS0Ian0n ann ’UnCn0na I enom ics
JIANG Shuye CHEN Qi．feng GE Xue．jun
(1．Institute of Genetics and Crop Breeding, Agric~ture and Forestry Unwe~ Fuzhou350002，China；
2．South China Institute of Botany,the Chinese Academy of Sciences，Guangzhou510650，China)
Abstract：Gene trap is a system that allows gene activity to be monitored by creating gene fusions、 tl1 a reporter
gene． Gene traps provide apowerful tool for isolating genes and determining gene functions． Reporter genes can
be usedto construct three basic types ofgene traps： enhan cer trap， promoter trap an d gene trap． In an enh an cer
trap，the reportergeneisfusedto aminimalpromoterthatisunableto drive reportergen e expression alonebut can
be activated by neighboring enh ancer elements． Promoter traps and gene traps contain a promoterless report gene，
so that reporter gene expression can OCCUr only when the reporter gene inserts within a transcribed chromosomal
gene， creating a transcriptional fusion． In this review， we describe how gene traps were developed, how to
construct gene trap system ，how gene traps were adopted to isolate genes an d determine gene functions，what is the
present status about applications ofgene traps on plan t molecular biology an d why gene traps are likely to play an
increasingimportant rolein thefuture． ‘
Key words：Gene traps；Isolating gen es；Functional genomics
植物基因分离的方法有多种【 2]，这些方法主要
依赖于经典遗传学上可识别表型的基 因突变或基
于基因的表达形态。
依赖于可识别表型的突变基因的分离要求基
因突变的表现型应与基因的功能一致 。然而 ，许多
基因有 多个功能，且这些功能别的基因也有 ，但它
收 稿 日期 ：2002-09-10 接 受 日期 ：2002—12—20
们的序列不一定相关，这种突变不易产生易识别的
表型 ，因为有 一个或多个基因家族具有相同的功
能。例如，基因敲除 (knockout)分析表明，尽管曾在
广泛生长条件下进行测试 ，仍有相当比例的酵母基
因被敲除时没有明显的表型效应翻。另外，许多基因
的功能在多个发育阶段表现 ，这些基因的突变可能
导致早期致死或可能一因多效而与特 定代谢路径
上的某一基因相混淆而难以分离。
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热 带亚热 带植物学 报 第 11卷
分离基于基因的表达形态的基因，已发展了若
干 新 技 术 ，如 mRNA 差 别 显 示 技 术 (mRNA
diferential display)[41、微阵列 (microaray)圈和基因
表达的系列分析 (Serial Analysis ofGene Expression,
SAGE)[61技术等。这些方法可用来分离某一特定空
间、时间或特定条件下表达的基因。然而，这些方法
最终还是要受到用于分离 RNA探针的组织的来源
所限制，瞬间表达 的、低丰度的和只在少数细 胞中
表达的基因可能不能分离。
在植物基因组学研究方面 ，拟南芥的基因组全
序列的测定工作已于 2000年完成川，并在 GenBank
数据库中登记注册。在水稻方面，1997以来，以日本
为主 的 国际水 稻基 因组 协作组 已发表 了长度 为
174．4 Mb的 BAC／PAC基因组序列Oatp：llwww．tigr．
org／tdb／e3kl／osal／BACmapping／description．shtm1]；
美 国 Monsanto公司于 2000年 4月 6日宣布 已完
成 粳 稻 全 基 因 组 工 作 框 架 图 [htp：／www．
rice—research．org]，但未给公共数据库提供序列；国
际 Syngenta公司也于 2001年 1月 26日宣布 己完
成粳稻全基 因组工 作框架 图[http：／www．syn~nm．
com]，草图数据可在其网站有条件登记使用 。我国
学者于 2001年独立完成了籼稻全基因组工作框架
图[81，其草图数据已在 GenBank中登记注册，并于
2002年与 国际 Syngenta公司在 《科学 》上发表 了
有关水稻全基因组工作框架 图的构建工作 01。还
有报道指 出，45 000个水稻 EST序列 已测序并于
2001年释放到公用互联网数据库，但 只有其 中的
25％可找到已知基因的同源序列，大部分基因的功
能还有待鉴定【lu；到 2002年 6月 28日止 ，释放到
NCBI数据库 的水稻 EST序列 已达 104 973(htp：
／／www．ncbi．nlm．nih．gov／dbEST
_
summary．htm1)。
可见 ，在植物基因的分离克隆方面 ，现有的方
法仍然存在缺 陷；同时随着拟南芥、水稻等植物基
因组全序列的测定、大量 EST序列的测定释放，如
何鉴定未知基因的功能已成为功能基因组学研究
的重 点课 题 。近 几年发 展起来 的基 因捕 捉系统
(Gene trap)， 可望成为植物基因分离和功能基因组
学研究的强有力工具。
1基因捕捉系统的结构体系
基因捕捉 ，又称基因陷阱 ，是一种报告基因的
随机整合技术。20多年前，在细菌遗传学中就曾采
用报告基因与 目的基因的融合来检测 目的基因的
活性旧。根据融合基因在不同时间的表达形态或在
各种条件下突变表型缺失或任何序列信息，就可分
离和鉴定相应的基因。因为被插入的 DNA 的序列
已知，插入序列可用做 “标签 ”很容易地分离染色
体基因。
植物 中建立第一代基因捕捉系统是为了判断
T—DNA插入整合到基 因组中的频率 。An dre等和
Teeri等用无启动子 的抗 生素抗性基 因与 T—DNA
的一端相连后转化烟草原生质体 ，来检测是否发生
基因融合和融合基 因的表达状况 41，从而筛选出
已发生基因融合使抗生素抗性基因得 以表达 的转
化体。后来，Koncz等和 Herman 等在 T—DNA中引
进第二个选择标记 13一葡萄糖苷酸酶报告基因 (gl‘
或 u／dA)，以便转化植株再生后可对无启动子的抗
生素抗性基因的表达状况作进一步筛选【l 61。这就
是植物中最早的基因捕捉系统。目前，所采用的报
告基因仍然 以gusA基因为主，也有采用 基因和
2c基因等。细菌的 gusA(u／dA)基因是 目前最常用的
植物报告基因。GUS蛋白的表达相当稳定【l 7】，其活
性可用商业化 的各种底物进行组织化学染色来检
测。GUS活性的检测相当敏感【l 田，甚至能检测单细
胞中的GUS活性。但大部分的底物相当昂贵，且组
织化学染色是破坏性的，GUS分析不能在活体组织
中进行。水母的绿色荧光蛋白 (GFP)基因也 已被用
于植物 的报告基因。因为 GFP可通过荧光来检测 ，
因此检测只要有适当光源即可，相对廉价；GFP的
检测是非破坏性 的，可在活细胞中检测，且可多次
检测。 是类 一Myc转录因子的玉米 r基因家族的
一 个成员，其功能是调控花青素的合成，是一个很
有前景的报告基因；lc在其它植物中的表达会导致
花青素的积累n 201。这个报告基因的优点是检测不
需要昂贵的底物 ，且是非破坏性的。
根据所构建的报告基因的结构，目前已发展了
3种基因捕捉的基本类型：增强子捕捉、启动子捕捉
和基因捕捉 】(图 1)。通常的术语 “基因捕捉”泛
指各个捕捉系统，而不管特异的报告基因的结构如
何 。
在增强子捕捉中 (图 1A)，报告基因与一个基
本启动 子融合 ，这个基 本启动 子通 常包含 一个
TATA盒和转录起始位点，不能使报告基因表达，但
可被临近的增强子激活。在启动子捕捉和基因捕捉
中，报告基因的启动子被去除，融合基因只有 以正
确 的方 向插入到转录单元 内才 能表达 (图 1B和
1C)。启动子捕捉的报告基因只有插入到一个外显
子，导致转录融合时才能表达 (图 1B)。相对地，基
j
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第 2期 江树业等：基因捕捉及其在植物基因分离和功能基 因组学上 的应用 183
因捕捉结构 中，报 告基因前包含一到多个剪接序
列 ，当其插入到 内含子时也可表达 (图 IC)。从染
色体基因的剪接供体位点到报告基因的剪接受体
位点的剪接导致上游外显子与报告基因的融合。从
它们的结构差异可以看出，增强子捕捉只有 以正确
的方向插入到一个基因内的报告基 因才能表达 ，优
点是其插入可导致报告基因的高频表达 ，而启动子
捕捉和基因捕捉则更易导致基因断裂。由于增强子
捕捉能使与报告基因相距较远的基因得到表达 ，在
增强子捕捉中控制报告基 因表达 的基 因比启动子
捕捉或基因捕捉中的更容易被检测到。
可见，判断和鉴定未知基 因的功能只是依据报
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A— 增强子l TATA l_一 外显子l内含子ll#I,B-T I内含子II外显子H TATA I报告基因I——
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图 l增强子 (A)、启动子 (B)和基因捕捉 (C)的结构示意图
Fig．1 Structureofenhancer(A)，promotor(B)andgenetrap(C)element~
SD为染色体基因的剪接供体位 点111e chromosomal splice donor site；
SA 为报 告基 因 的翦接 受体位 点 Splice accepter sequences from the report gone．
告基因的表达状况 ，可不依赖突变表型，并可分离
鉴定杂合子中的致死基因；报告基因检测的敏感性
使瞬间表达的、低丰度的和只在少数细胞中表达 的
基因也可分离，为植物基因分离和功能基因组学的
研究注入了新的活力。
除了以上 3种捕捉系统外 ，人们还构建了 “信
号 -外显子捕捉”(Signal—exon trap，SET)系统 。这
一 系统可在 DNA水平上侦察信号分子，通过筛选
被捕捉的外显子编码的多肽，鉴定信号多肽的功能。
2基因捕捉突变库的构建
为了使用基因捕捉 ，必须构建包含报告基因随
机插入整个基因组的个体突变库。主要采用两种方
法：T-DNA和转座子。
T-DNA介导的转化是产生转基 因植株的常用
方法。在转化效率较高的植物中，T-DNA方法是快
速构建插入序列突变库的主要方法。优点是基因组
T-DNA的插入通常是稳定的，且 T-DNA的插入不
具有位点特异性，可以建立饱和的 T-DNA插入突
变库圆。如在拟南芥 中已获得 了大量的 T—DNA插
入突变库[2s,-2gl。然而，T-DNA方法只适用于这些易
被 T-DNA转化的植物。且在转化植株中，通常可以
检测到多个 T-DNA插入到一个转化植株中，一个
位点包含多个 T—DNA插入或多个位点包含多个插
入 ；或产生 T-DNA 的正向和反向重复、与比邻
的染色体 DNA发生重排t]o-]21等，导致随后分子分析
的复杂性 ，增加了驱动报告基因表达的染色体基因
的分离难度 。
转座因子也已广泛用于插入突变库的构建。其
优点是 ，在转座酶不具活性的情况下，整合 的转座
因子是稳定的；当转座酶具有活性 时，可产生 回复
突变 ，从而验证突变性状是否由转座子插入引起
的。但一些转座子 (如玉米的Ac／Ds)具有偏好向邻
近连锁位置转座的特性[31，大大增加了构建饱和突
变库的工作量。目前一些改进措施可有效增加向非
邻近位置转座的频率嗍。
到 目前为止，只有 AciDs系统可用于增强子或
基因捕捉，因为 AciDs具有低的拷贝数嗍，高拷贝数
的转座子，如 En／Spmt~往往会 导致报告基因表达的
复杂化。
AciDs转座系统 由自主元件 Ac和非 自主元件
组成。Ac元素编码的转座酶与 Ac和 末端倒
位重复序列结合，催化 向基 因组新位置转座 。 是
Ac失去转座酶活性而保留末端倒位重复序列 的衍
生物。Ac转座酶基因产生的转座酶能够识别 的
末端序列，从而催化向染色体的新位置转座。这种
双元系统可生产稳定的转座插入，因为 自主元件可
从转座插入中分离。此外，可通过有性杂交将转座
酶导入转座植株从而诱导再次转座 ，引起 回复突
变，验证所分离基因的功能。
这里介绍一个转座子基因捕捉系统的构建方
法[3q(htp：／genetrap．csh1．org)。这个系统采用 AciDs
转座元素和正向 ／反向选择标记基因进行转座的选
择(图 2)。在这个系统中，Ac元素由于去掉了具有转
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热带亚 热带植物 学报 第 l1卷
座能力的两臂，只能合成转座酶 ，由花椰菜花叶病
毒 CaMv 35S启动子驱动，将通用表达的 2’启动子
驱动的反向选择标记基因 iaah也被构建到 T-DNA
上。 元素由玉米 Ac元素发展而来，含有由通用
表达的 1’启动子驱动的 基因和 GUS报告基
因。在增强子捕捉元素 (DsE)中，GUS报告基因与
来 自CaMv 35S的弱启动子融合，这个启动子区域
检测不到活性，除非其附近具有染色体的增强子元
素【Ⅻ。在基因捕捉元素 (DsG)中，G 报告基因缺
乏启动子，但在三个阅读框上均包含一个 SA位点，
与上游的起始密码子相融合。这种结构使 GUS报告
基因在 DsG元素插入内含子时通过转录和翻译融
合而得以表达。另外，位于 元素 3’末端的供体位
点通过 自然剪接 91，使 GUS报告基因在 DsG元素
插入外显子时得以表达。在每一个 T-DNA中，均含
有 由通用表达的 2’启动子驱动的反 向选择标记基
因 iaaH，使转座后 Ac和 元素均能反 向选择。它
们均被亚克隆到双元 T-DNA载体上，通过农杆菌
介导法导入拟南芥基因组。
Ac同源亲本与 Ds同源亲本杂交后 ，Ds在 Ac
转座酶的作用下开始转座 。F。植株 自交后，收获 Fz
种 子 。F2种 子 在 包含 有 萘 乙酰胺 (Naphthalene
acetamide，NAM)和 卡那霉素(Kanamycin，Kan)的
培养基上发芽。对 NAM 和卡那霉素均表现出抗性
的植株表明其基因组的某个位置上插入了发生转
座 的 I)s元素 ，且 所 在 位 点与 Ac元 素 和 供 体
T-DNA均表现出独立分离。这一选择富集 了不与原
始 位点连锁的转座事件。双抗 Fz植株再转移到
土壤中生长，自交结实并收获 F 种子。F 植株再进
行 GUS表达分析。
为了鉴定基因捕捉系统中控制报告基因表达
的 目标基因，首先可采用 PCR技术扩增位于 插
入序列两端 的基 因组序列 。热敏式不对称交错
PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)在扩增这
些序列时特别有效 一。一旦两端序列被测定一小
段，就可以进行基因库数据检索 ，确定其在基 因组
中的位置及其候选基因。因为拟南芥基因组序列已
测定完成，即使一小段序列就有相当高的比率确定
其相应的基因组序列，从而确定相应 的 插入的
图谱位置。因为基因组序列已被系统描述 ，使得插
入区内的基因可以得到初步确定，从而初步确定驱
动报告基因表达的候选基因。如果基因捕捉插入导
致转录融合，就可 以用 5’-RACE-PCR技术 (随机扩
增cDNA末 端 技术 )扩增 插 入 上游 的外显 子序
列[43,41。这种方法对于鉴定相对高丰度表达 的基因
相当有效。因为 RACE·PCR技术扩增的是外显子序
列，可 以直接用作探针筛选 cDNA文库 ，从而获得
目标基因。
目前，美国冷泉港实验室 已建立 了一个有关拟
南芥基因捕捉的专 门网站，网址是：htp：／genetrap．
DsG T·DNA
●．_··___-’
35S lⅣ|P I OCS3 }__——— At’ Transposase I 35S
IAAH I 2 H 5"／9 H { l Ⅲ I OCS3 I-INOS3 l GUS H SA}INTRON H 3 Ds
DsET．DNA
●——-—-一
L8 H IAAH I 2 H 5"Ds H NPTI I OCS3 I--I NOS3 l GUS H TATA H 3"19 H RB
， 黧
图 2用于转化 Ac转座酶以及基因捕捉或增强子捕捉 元件的 T-DNA构建体
Fig 2 T-DNA constructs used to introduce Ac transposase and gene trap or ellhan ~ trap Ds elements
IAAH：吲哚乙酰胺水解酶基因 (对萘乙酰胺NAM 敏感)；NTPII：潮霉素磷酸转移酶基因 (对卡那霉
素敏感)；GUS：B一葡萄糖苷酸酶报告基因；sA：剪接受体；LB，RB：T-DNA的左右臂：l ，2 ：启动
子；OCS3 ，NOS3 ：转录终止子；INTRON：内含子；DsG：基因捕捉转座子；DsE：增强子捕捉转座子。
IAAH： indole acetic acid hydrolase (sensitive to naphthalene acetamide，NAM)； NTPI： neomycin
phosphoWans~ras~(sensitive to Kanamycin，Kan)；GUS：B-glucuronidase；SA：splice accepteT,LB and
RB：left and fight aims ofT-DNA；l’，2’：promoters；OCS3’，NOS3’：transcriptional terminator；INTRON：
non-cod ing region between exons；DsG：gene trap Ds elem en t；DsE：enhancer nap Ds elem ent
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第 2期 江树业等：基因捕捉及其在植物基因分离和功能基因组学上的应用 185
csh1．org。这个实验室已获得 15 000个拟南芥基因
捕捉突变体，到 2002年底预计可达 40 000个，其中
约 6 000突变系 已进行 GUS分析，并获得相应的
Flanking序列。包含这些测序信息的数据库也已建
成，并在不断扩充。这种数据库将最终包含这些序
列的表达资料及其表现型信息。有了这些序列信息
就可进行反向遗传学筛选，确定先前克隆基因及基
因家族的功能。所有这些信息将对全面弄清拟南芥
基因组全部基因的功能起到极其重要的作用。
此外 ，新加坡国立大学分子农业生物学研究院
也正在进行拟南芥和水稻基因捕捉突变库的构建
工 作 ，具 体情 况可 参见 网站(htp：／www．tl1．org．sg／
research／plant／sri／)及相关文献【4 91。
3基 因捕捉系统在植物基因分离和功
能基因组学上的应用
基因捕捉系统应用于植物基因分离和 功能基
因组学研究的一个重要特 点是 ，不但可 以分离基
因，还能研究其功能。
基 因捕捉系统可有效分离鉴定可差异调控 的
具特异表达形态的基因。具有细胞、组织、特异性表
达、暂时性表达或有条件表达的基因，通过报 告基
因的表达就可得以分离。如已分离出在侧根和正在
发育的胚胎中特异表达 的基因[so-sz,l，以及在一定条
件下 表达 的基 因 ，如 被线 虫类 感 染而 表达 的基
因ts堋等。一个典型例子是基因捕捉系统在有关衰
老基因的分离鉴定上的应用：总共筛选了 1 300个
拟南芥增强子捕捉系，发现其 中 147个系的 GUS活
性 只 在 衰 老 叶 片 中表 达 ；分 析 了 6种 可 能与
衰 老有关 的 因子 ： 乙烯 、茉莉 酮 酸 、脱 落 酸 、
brassinosteroids、脱水和黑暗对 GUS表达调控的影
响，从而建立 了调节植物衰老的网络路径 ：对其 中
的 Se1139系作了进一步的分析鉴定，分离出一个与
衰老有关的基因 SAGIO1，它只在衰老叶片中表达 ，
‘ 其编码的蛋 白具有酰基水解酶活性，反义 RNA的
转基因植株分析和化学诱导分析表明，此基因在叶
片衰老中具有重要作用；还分离了一个 OPRJ基因，
它与叶片衰老有关，同时受茉莉酮酸的调控[5-58]。
在拟南芥中具有许多胚胎致死突变，表现出多
种类型，使得胚胎致死原因难以判断is9]。基因捕捉系
统的应用可以克服这一问题 ，因为在分离基 因之
前，根据 GUS表达形态就可预测其功能。如在基因
捕捉分析中 ，DsG插 入分化细胞 中表现 出 GUS活
性，据此分离到 PROLIFERA(PRL)基因。PRL基因
是真核生物中 MCM 基因家族的一个成员，为启动
DNA复制所必须；DsG的插入打断了PRL基因，从
而导致大量配子体和胚胎致死 。
A GL8基因是通过鉴定增强子捕捉中 DsE元素
的插入突变而分离的。DsE元素在 AGL8基因 5’非
转录区的插入导致受精后长角果不能伸长，使长角
果变短且挤满了种子，因此 AGL8基因被重新命名
为全果 FRUITFUL(FUL)基因。FUL突变引起 的长
角果伸长受阻与此基因在心皮中的突变表型相一
致；然而，FUL基因也在茎尖分生组织中表达 ，诱导
茎尖分 化至开花 ，被认为在营养生长转 向生殖生长
中起作用；当 MADS盒基因APETALAJ(A )和
CA ULIFLOWER．(CAL)发生突变时，FUL突变会导
致无法开花[61,621。这样，FUL基因表现出多效性 ，与
AP／和 CAL一起共 同控制是否开花。
越来越多的文献报道表明，基因捕捉系统在分
离基因、鉴定基因功能上 的应用潜力是 巨大 的。
Kumaran等通过筛选拟南芥基因捕捉系而分离了
一 个与拟南芥花发育有关的新基因 【4习。Dubreucq
等通过筛选 10 000基因捕捉转基因系，获得一个与
种子发芽有关的基因 AtEPR1，此基因在种子发芽
过程中的表达明显受 GA的正向调控 ，但不受 ABA
的负向调节t631。Swaminathan等在筛选拟南芥增强
子捕 捉系中分离 到一个 与细胞周期有 关 的 D类
Cyclin基因 Cl，CD3，2，GUS分析和 Northern杂交分
析表明，突变体中这个基 因的功能已丧失，但没有
明显的突变表型，互补实验进一步验证 了此基 因的
功能 。Hiwatashi等构建了包含 235个基因捕捉系
和 1 037个 增 强子捕捉 系 的苔藓 (PhyscomitreUa
patens)突变库，并分离、鉴定出一个酸性 Q-葡萄
糖苷酸酶基因Pp 嘲。Weijers等在拟南芥的启动
子捕捉系中首次分离和鉴定 出一个不完全显性基
因RPS5，此基因在杂合状态下细胞分裂延迟或被破
坏 ，但在纯合状态下会降低配子体的生存能力和胚
胎致死 。Yoshioka等从拟南芥基因捕捉突变库中
分离鉴定出一个编码单功能天门冬氨酸激酶的基
因AK-lys3，在叶的木质部、下胚轴和根维管组织中
部等高水平表达 。Hal等利用拟南芥增强子基因
捕捉系分离和鉴定 了一个富含羟脯胺酸的糖蛋 白
基因RSH，它在决定胚胎发育中细胞板的正确位置
上是必要的，此基 因功能的缺 失导致 根、苗和胚轴
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热带 亚热 带植 物 学报 第 l1卷
的严 重畸 型 ，形 成 玻璃 质幼 苗 ，最 高 可长 至 1—
3 Ilnl，存活期不到 3周嘲。Lechner等利用基因捕捉
系 SGT6304分离和鉴定了拟南芥 中 finger蛋 白基
因家族中的一个 RHA2b基 因，尽管此基 因已被打
断，也没有导致 明显的生长和发育缺 陷，但通过
GUS分析也能分离相应的基因【硼。Tanaka等从拟南
芥启动子捕捉系中筛选鉴定出与大豆基 因 GH3同
源的基因AtGH3a，受光敏色素 B调控，通过改变激
素水平来调节其表达[7o1。
除了用于分离基因外，基因捕捉也可用于分离
驱动特异表达的启动子。分离的特异表达的启动子
又可用于驱动基 因的异位表达而检测此基 因的表
达形态。如 Tsugeki等利用增强子捕捉系统分离 了
一 个 根 冠特 异 表 达 启动 子 ，并 用 于启 动 DT-A
(diphtheria toxin)基因来研究拟南芥中根冠细胞切
除后的发育状况 】。
基因捕捉的另一个潜在应用是分离调节基因
下游的目标基因。这个方法在果蝇中应用得相当成
功，如已用来分离受 Antennapedia调控的基因旧。其
基本原理是，经筛选获得的候选基因捕捉系中，报
告基因的表达受感兴趣的调节基因的调控。这样的
基因捕捉系与失去调节基 因功能的突变株或调控
基因得 以异位表达的转基 因植株杂交 ，杂交后代 中
报告基 因的表达就会发生改变，这种改变是受调节
基因控制的。
4值得探讨的问题
利用基因捕捉系统分离基因，并研究其功能的
前提是报告基因必须能真 正反映染色体基因的表
达状况。然而实际情况是不是这样呢?在果蝇和老
鼠的研究中，大部分增强子和基因捕捉的报告基因
是能够真正反映内源基因的表达的嗍。在植物中，初
步结果也表明，报告基因的表达的确能够反映植物
基因的表达 q。事实上，在基因捕捉系统中，报
告基因比通常用于表达分析的启动子 -报告基因更
能反映其表达 ，因为基 因捕捉元素插入到植物基因
组后，基 因组可提供所有的调控元素 (基因捕捉元
素插入到调控元素位置的情况例外)；且这些元件
是 以自然状态保存于植物染色体上，不存在可能导
致转基因植株不能正确表达的位置效应问题。而启
动子 一报告基因不可能包含从内含子或 3’端到转
录区的调控序列，能否真正反映报告基因的表达 已
引起人们的质疑，并认为单纯用启动子 -报告基因
模式进行表达分析是不够的 。
然而，也有报道报告基因与其染色体基因的表
达不一致的例子 ，这可能与基因捕捉元素刚好插入
到调控元素位置上有关。例如，一个增强子捕捉插
入导致根冠特异表达形态，然而 ，克隆出的相应基
因具有不同的表达形态，可能是插入打断了 GUS报
告基 因表达所需的启动子 】。又如，T-DNA插入烟
草后，导致 GUS报告基因在种子外壳特异表达 ，但
在插入区却找不到可转录表达的基因，这是因为
T·DNA 的插 入激 活 了烟草 中本不具活性 的启动
子嗍。然而，也可能这个特殊的启动子驱动了非编
码 RNA或小多肽的表达，但无法被所采用的检测
方法检测到。
另外 ，一个值得提及的问题 是，个体突变库的
群体到底需要多大才可 以形成一个饱和的突变库，
即一个基因至少可以找到一个相应的突变体。普遍
认为这个问题与所研 究的植物种的基因总数及其
在基因组内的分布情况有关。就水稻而言，基因组
大小约 430Mb，若要构建 以平均每 l5 kb范围内就
可找到一个插入的突变库，则需约 30 000个插入突
变体。在禾谷类植物中，基 因在基 因组中的分布是
不均匀的，存在基因的集中区嗍。初步研究表明，水
稻中的基 因集中区大约占水稻基 因组的 25％，而大
部分的 T-DNA具有插入到水稻基 因组基因集中区
的偏好嗍。这样，突变库的群体似乎可以比用基 因组
大小和基因密度预测的小。但通过拟南芥突变库的
构建认为，所构建的突变库的群体还不够大，且群
体越大，发现被打断基因的个体的机会就越高[Stl。
另一个值得注意的问题是，只有单拷贝插入的
基因捕捉突变体为分析相应基因的功能提供 了方
便，但由于多因一效或基因家族的存在，以及高等
植物对各种生理压力、遗传变异 的高适应性，单个
基因的打断并不会导致其相应功能的丧失或功能
太弱而无法检测，因而增加了对功能基因鉴定的难
度 ，但在分析多因一效或基因家族上仍然是有效
的。此外，由于基因间的相互作用，对单个基因打断
的分析有时可能会扭曲对相应基因功能的解释 。可
见，尽管基因捕捉系统具有许多优点，但对许多基
因功能的分析还应结合其它的分析方法。
总的来说，基因捕捉系统 已成为分离基因、鉴
定基因功能的有效工具；随着拟南芥 、水稻基 因组
全序列的测定，在应用于鉴定基因组功能方面将起
到越来越重要的作用。
蓬
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