全 文 ：收稿日期： 2012–07–17　　　　接受日期： 2012–10–21
基金项目： 教育部博士点基金项目(20110191110029); 国家自然科学基金项目(30972002， 31071798)资助
作者简介： 林冬波(1986 ~ )，男，在读博士研究生，研究方向为植物分子生物学。E-mail: lindongbo05@126.com
* 通讯作者 Corresponding author. E-mail: zhengguoli@cqu.edu.cn
热带亚热带植物学报　2013， 21(2)： 133~140
Journal of Tropical and Subtropical Botany
番茄SlmiR393基因超表达载体的构建及其靶基因
鉴定
林冬波, 杨迎伍, 李正国*
(重庆大学生命科学学院基因工程研究中心，重庆 400030)
摘要： 为研究番茄(Lycopersicum esculentum)的 SlmiR393 基因功能，采用生物信息学方法从番茄基因组数据库中获得 SlmiR393
的前体序列及其潜在的靶基因。以基因组 DNA 为模板，克隆了番茄 SlmiR393 前体基因并整合到 pLP35S-100 植物表达载体；
采用 5′ RACE RT-PCR 技术验证 SlmiR393 对预测靶基因 mRNA 的剪切作用，采用定量 PCR 技术检测 SlmiR393 及其靶标基
因在番茄不同组织的表达。结果表明，SlmiR393 的前体序列含有完整的茎环结构；成熟 miR393 与 3 个生长素受体同源基因
(SlTIR1、 SlTIR1-like1 和 SlAFB)之间具有识别作用位点。SlmiR393 可对番茄 3 个靶基因的转录本进行剪切降解；SlmiR393 与
3 个不同靶基因(SlTIR1、 SlTIR1-like1 和 SlAFB)的表达模式在叶和茎、花蕾、花中存在一定的互补关系。因此，推断番茄中的
SlmiR393 可能在特定的组织或发育时期介导特定的靶基因 mRNA 的剪切降解 , 初步证实生长素受体同源基因为 SlmiR393 的
靶基因。此外，成功构建以 CaMV 35S 为启动子的植物表达载体 pLP35S-pre-SlmiR393, 为深入研究 SlmiR393 在番茄生长素信
号转导中的功能奠定了基础。
关键词： 番茄； SlmiR393； 生长素受体同源基因； 载体构建
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2013.02.006
Construction of SlmiR393 Over-expression Vector and Identification of
Its Target Genes in Tomato
LIN Dong-bo, YANG Ying-wu, LI Zheng-guo*
(Genetic Engineering Research Center, life science of College, Chongqing University, Chongqing 400030, China)
Abstract: In order to understand the function of SlmiR393 in tomato (Lycopersicum esculentum), the precursor
sequences and potential target genes of SlmiR393 were obtained by searching tomato genome database with
computational algorithms. The SlmiR393 gene was amplified from tomato genomic DNA by PCR and integrated
into plant expression vector pLP35s-100. Sly-miR393 guided-cleavage to putative target genes mRNAs was
validated using 5′ RACE RT-PCR. The expression of SlmiR393 and its target genes in tomato different tissues were
determined by Real-time quantitative PCR. The results showed that the precursor sequence of SlmiR393 contains
the complete hairpin structure. Three auxin receptor gene homologs (SlTIR1, SlTIR1-like1 and SlAFB) mRNAs
contain recognition sites with high complementarities to Sly-miR393 sequence. In tomato, SlmiR393 directs the
cleavage of SlTIR1, SlTIR1-like1 and SlAFB mRNA. The expression of SlmiR393 has opposite effects on SlTIR1,
SlTIR1-like1 and SlAFB in stem, leaf, bud and flower, respectively. Therefore, it was suggested that SlmiR393
might direct specific target gene mRNA cleavage in tomato specific tissue and developmental stage, and the auxin
receptor homologous (SlTIR1, SlTIR1-like1 and SlAFB) were validated to be as target of SlmiR393. Additionally,
134 第21卷热带亚热带植物学报
MicroRNA (miRNA)是一类内源性的、长度为
21 ~ 24 个碱基的小分子非编码 RNA，它通过对靶
基因 mRNA 的降解或者抑制其翻译等方式，在转
录后水平上特异调控靶基因的表达[1–2]。miRNAs
所作用的靶基因大多数是调控植物生长发育的重
要转录因子和蛋白。因此，miRNA 参与调控植物
生长发育的全过程，如根、叶、花等器官的形态建
成、细胞分化、信号转导以及逆境胁迫响应等生物
学过程[3–4]。miRNA 的相关研究对阐明生物体复杂
的生命调控机制具有非常重要的意义，是目前生物
学研究的前沿领域和热点之一。
miR393 是植物中较保守的 miRNA 家族。在
拟南芥(Arabidopsis thaliana)中， miR393 介导调控
的靶基因 TIR1、 AFB1、 AFB2、 AFB3 所编码的蛋
白属于 F-box 蛋白[2]，该蛋白在植物生长素信号转
导过程中起着重要的调控作用。最近的研究表明，
拟南芥 miR393 的过量表达能够抑制生长素信号
转导，明显提高植株对细菌侵染的抗性[5]，并且在根
发育中导致侧根数目减少，对生长素敏感性下降[6]。
Xia 等的研究表明水稻(Oryza sativa)中 OsmiR393
过量表达下调了 TIR1 / AFB 家族同源基因的表达，
导致分蘖多、提前开花、耐盐性和抗旱性降低[7]。此
外，Sunkar 等对拟南芥进行冷、干旱、高浓度 ABA
和高盐等胁迫处理后，miR393 的表达水平明显上
调，说明 miR393 与非生物胁迫响应有关[8]。因此，
miR393 不仅能够调控生长素信号转导途径，而且
能调控对胁迫的响应。
番茄是植物分子生物研究的重要模式植物之
一，但对于番茄 miRNA 的生物学功能仍知之甚少，
尤其是 miR393 作为重要的转录后调控生长素信号
转导途径因子的生物学功能尚未见报道。本研究
从番茄中分离与鉴定到 SlmiR393 及靶基因；并构
建超表达载体 pLP35S-pre-SlmiR393，为后期研究
SlmiR393 在番茄生长发育中的生物学功能奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
野生型番茄(Lycopersicum esculentum ‘Micro-
Tom’)种 子、大 肠 杆 菌 JM109、植 物 表 达 载 体
pLP100 为本实验室保存。
DNA 提取试剂盒、植物总 RNA 提取试剂盒、
2 × PCR Master Mix、FastDigest 限 制 性 内 切 酶、
T4 DNA Ligase、反转录试剂盒购自 Fermentas 公司；
PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 高保真酶和 5′-
Full RACE Kit (购自 Takara 公司)；质粒提取试剂
盒(E.Z.N.A. Gel Extraction Kit)、凝 胶 回 收 试 剂 盒
(E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I)购 自 OMEGA 公 司；
pEASY-Blunt 克隆载体、DNA Marker plus 2000 购
自北京全式金生物技术有限公司；其他化学试剂均
购于北京索莱宝有限公司；PCR 引物合成和测序工
作均由北京华大科技公司完成。
1.2 番茄基因组DNA提取
根据 DNA 提取试剂盒说明书的方法，提取番
茄叶片 DNA。
1.3 番茄SlmiR393前体基因预测及克隆
在数据库 miRNA Registry Database (Release 17:
April 2011, http://www.mirbase.org/index.shtml)下
载 拟 南 芥 的 成 熟 miR393 序 列(miRBase 登 录 号：
MI0001003)，基于小 RNA 成熟序列的保守性，将其
在番茄基因组数据库(http://solgenomics.net/)中利
用 Blast 工具且修改 Blast 的期望阈值(E-value)为
1e-0 进行比对，寻找番茄 SlmiR393 可能的前体序
列。对预测完全与 SlmiR393 成熟序列 22 nt 匹配
的基因组序列进一步筛选，选择 SlmiR393 两端约
80 nt 的核苷酸序列，采用 RNA Structure 4.6 软件分
析其是否存在典型的发夹二级结构。若能形成完
整的颈环结构且成熟序列完全位于 5′ 端，则推测该
颈环结构对应的核苷酸序列为潜在的 SlmiR393 前
体(pre-SlmiR393)。
以 番 茄 基 因 组 DNA 为 模 板，根 据 SlmiR393
含 有 颈 环 结 构 的 基 因 组 序 列，设 计 特 异 性 引 物
进 行 PCR 扩 增。pre-SlmiR393 上 游 引 物：5′-
CACCTCAGAGTATTTGCGTAAGG-3′；下游引物：
5′-CATGCTTTTGGTGTGTTGGTGG-3′。PCR 反
应 体 系 为 50 µL: 包 含 10 µL 的 5 × PCR buffer、
the pLP35s-pre-SlmiR393 vector containing SlmiR393 gene was successfully constructed with CaMV 35S as
promoter, which laid a foundation for further studies of SlmiR393 function in auxin signaling pathway in tomato.
Key words: Tomato; SlmiR393; Auxin receptor gene; Construction
第2期 135
4 µL 的 dNTPs (2.5 mmol L–1)、1 µL 上 游 引 物
(10 µmol L–1)、 1 µL 下游引物(10 µmol L–1)、 1 µL 的
DNA (100 ng)、 0.5 µL 的 PrimeSTAR 高 保 真 DNA
Polymerase、 32.5 µL 的 ddH2O。PCR 反应程序为：
98℃预变性 2 min；98℃变性 10 s， 55℃退火 15 s，
72℃延伸 30 s， 35 个循环；最后 72℃延伸 10 min。
反应结束后，分别取 5 µL 的 PCR 扩增产物用 1.5%
的琼脂糖凝胶电泳 , 在紫外凝胶成像系统下观察并
拍照，回收目的条带并纯化，于 –20℃保存备用。
1.4 番茄SlmiR393的靶基因预测
将 SlmiR393 序 列 与 psRNATarget 网 站(http://
bioinfo3.noble.org/psRNATarget/) 中 的 番 茄 ITAG
2.3cDNA 数 据 库 进 行 Blast 比 对 分 析。 与 成 熟
SlmiR393 具有高度保守结合的序列初步推测为
SlmiR393 的靶基因(最多允许 4 个碱基错配)。
1.5 SlmiR393对靶基因转录本的切割位点鉴定
采用 5′ RACE 方法验证小 RNA 对靶标基因
mRNA 的切割作用，相应的原理如图 1 所示，如果
靶标基因被 miRNA 所识别切割，则切割产物在逆
转录过程中，其 5′ 端也会被加上接头，利用两对基
因特异引物与试剂盒的接头引物组合，采用巢式
PCR 扩增产物测序；具体方法如下：Trizol 法提取
番茄混合组织的总 RNA，以 2 µg RNA 为模板，经
过 DNase I 消化之后，进行 5′ RACE RT-PCR 的反
转录，方法参照 5′-Full RACE Kit (TaKaRa)说明书
进行。采用两轮巢式 PCR, 所用引物见表 1，扩增
靶基因的 3′ 端剪切片段，回收扩增产物，经纯化后
克隆到 pEASY-Blunt 载体，通过测序来分析每个靶
基因被切割的位点。
1.6 SlmiR393及其靶标基因的表达分析
参考 Chen 等[9]的方法，采用茎环引物 RT-PCR
技术检测 SlmiR393 在番茄不同组织(根、茎、叶、花
蕾、花、果)中的表达水平。根据 Chen 等[9]的引物
设计原则，通用茎环引物 3′ 端上 7 个碱基与成熟
miR393 序列 3′ 端互补配对 , 反转录和定量 PCR
反应所用引物见表 1。
番茄总RNA的提取样品，经DNase I (Fermentas)
处理去除残留的基因组 DNA，参考提取试剂盒说
明方法合成第一条反转录反应 cDNA 链。为了更
好地检测剪切后靶基因的表达量，我们设计的上下
游定量引物跨越每个靶基因与 SlmiR393 结合的位
点。定量 PCR 检测参考 Yang 等[10]的方法。
1.7 植物表达载体的构建
目的基因的克隆　　将所回收的 PCR 产物，
与 经 过 SmaI 酶 切 的 植 物 表 达 载 体 pLP100-35S
进 行 连 接，其 反 应 体 系 为：10 × T4 DNA ligation
Buffer 1 μL， PEG-4000 1 μL， T4 DNA ligase 1 μL
(5 U μL–1)， pre-SlmiR393 目的片段 7 μL， pLP100-
35S 载体片段 1 μL (50 ng μL–1)，总体积为 10 μL，混
匀后于 4℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌
(Escherichia coli) JM109 感受态细胞，随机挑取 10
个单菌落进行 PCR 鉴定。
阳性转化子的鉴定　　为了快速检测到 pre-
SlmiR393 目的片段正向插入载体的阳性克隆子，
我们根据 pLP100-35S 载体多克隆位点上游的 35S
启动子序列区域，设计 1 个特异性前引物(pLP35S-
cx)，以 pre-SlmiR393 目的片段为后引物，以单菌落
为模板进行 PCR 检测，并初步鉴定阳性克隆子。上
游 引 物(pLP35S-cx): 5′-CCCCGAAAAGTGCCAC-
CTGACGT-3′；下游引物(pre-SlmiR393-R): 5′-CGA-
ATCGAACTCCTTACGCAA-3′。PCR 扩增反应体
系总体积 20 μL：包含 2 × PCR Master Mix 10 μL、
上游引物(10 μmol L–1) 1 μL、下游引物(10 μmol L–1)
1 μL、 ddH2O 8 μL，以菌体细胞为模板。PCR 反应
条件为：95℃预变性 5 min；95℃变性 30 s， 54℃退
图 1 5′ RACE 验证小 RNA 与标靶基因的互作原理
Fig. 1 Validation of interaction between miRNA and target genes by 5′
RACE test
林冬波等：番茄SlmiR393基因超表达载体的构建及其靶基因鉴定
136 第21卷热带亚热带植物学报
火 30 s， 72℃延伸 1 min， 30 个循环；最后 72℃延
伸 5 min。反应结束后，分别取 5 μL PCR 反应液在
1.2% 琼脂糖凝胶上电泳。然后将初步验证为含有
阳性转化子的单菌落，接种于含有 Kan (100 mg L–1)
的 LB 液体培养基中，于 37℃恒温以 250 r min–1 振
荡培养过夜。提取阳性转化子质粒送北京华大基
因科技公司进行测序验证。
2 结果和分析
2.1 番茄SlmiR393的前体序列预测
通过生物信息学方法，在番茄基因组数据库
(http://solgenomics.net/index.pl) 中 进 行 Blast 序 列
比 对，搜 索 到 两 个 基 因 组 序 列 SL2.40sc04696 和
SL2.40sc039022 分别与成熟 miR393 序列完全匹
配；对预测的成熟 miR393 所对应基因组的两翼序
列进行二级结构分析表明，只有 SL2.40sc04696 基
因组上两端的 80 nt 序列能够形成完整的颈环结构
且符合植物 miRNA 前体的特征。图 2: A 中 5′ 端
粗体字标明的序列 (UCCAAAGGGAUCGCAUUG-
AUCC)为成熟 miR393 序列。因此，我们推测该颈
环结构对应的核苷酸序列为潜在 SlmiR393 前体
(pre-SlmiR393)。
以番茄基因组 DNA 为模板，根据颈环结构的
两端序列分别设计特异性 pre-SlmiR393 的前、后引
物，进行 PCR 扩增，经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳确认
目的片段。电泳结果可见，目的条带单一，DNA
片段大小与预期的一致，为 334 bp (图 2: B)。
2.2 靶基因编码的蛋白
植物 miRNA 与靶基因 mRNA 序列之间的高
度互补性，有助于进行 miRNA 靶基因的生物信息
学预测[11]。将 SlmiR393 序列与 psRNATarget 网站
(http://bioinfo3.noble.org/psRNATarget/)中 的 番 茄
ITAG2.3cDNA 数据库进行比对分析，结果表明，
Solyc09g074520、 Solyc02g079190 和 Solyc06g008780
表 1 5′ RACE PCR 和定量 PCR 所用的引物
Table 1 Primers used for 5′ RACE PCR and RT-PCR
引物 Primer 序列 Sequence
5′ RACE Outer CATGGCTACATGCTGACAGCCTA
TIR1-GSPI GTTGCAGTGCCAGTTGAGGGTTGGAA
TIR1-like1-GSPI GCGTGGAGTGGATAGATGATATGC
AFB-GSPI ACCTGCATTTACTTGCTTGA
5′ RACE Inner CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG
TIR1-GSPII GCAAGACTTCACATGGAAAGATGGGCAG
TIR1-like1-GSPII TTACTCTCCCTCTGTCCTATGCTCG
AFB-GSPII GGG ATTTCTCTTTGGCTTCTTCT
Stem-loop RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGATCAA
UP-R CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA
SlmiR393-F GCGCGGTCCAAAGGGATCGCA
U6-F TCTAACAGTGTAGTTTGTCCCTTCG
U6-R TTGTGCGTGTCATCCTTGC
SlTIR1-F GGCTCTCTTGGCTAATGCTGC
SlTIR1-R GGCCTTGTATCTGGAGGACCCC
SlTIR1-like1-F TGAGATGGAAATGAATCCGAGC
SlTIR1-like1-R CATATCATCTATCCACTCCACGCTA
SlAFB-F GGCTCTGTTGGCTATTGCTGCAAAG
SlAFB-R CATTGCTATATGGAGTCGATGTTGC
SlActin-F TGTCCCTATTTACGAGGGTTATGC
SlActin-R CAGTTAAATCACGACCAGCAAGAT
第2期 137
基因序列与成熟 SlmiR393 序列相互结合位点有
3 ~ 4 个碱基错配，且他们编码的蛋白在功能上属于
生长素 F-box 蛋白。在前期研究中，我们已经从番
茄中分离到生长素受体 TIR1/AFBs 家族基因中的
同源基因 SlTIR1 (GenBank 登录号：GQ370812)[12]。
对 所 预 测 到 的 3 个 靶 标 基 因 氨 基 酸 序 列 进 行
比 对，结 果 表 明 Solyc09g074520 即 是 SlTIR1，
Solyc02g079190 与番茄中的 SlTIR1 同源相似性达
55%，Solyc06g008780 则与拟南芥的 AFB 基因家
族的同源相似性为 60%。因此，将番茄中 SlmiR393
的 3 个 潜 在 靶 基 因 分 别 命 名 为：SlTIR1、SlTIR1-
like1 和 SlAFB。
2.3 SlmiR393对靶基因的剪切鉴定
miRNA 是通过剪切降解的方式对靶基因的
表 达 进 行 负 调 控，为 了 进 一 步 验 证 番 茄 体 内 的
SlmiR393 对潜在的靶基因转录本是否存在有剪
切作用，采用改良的 5′ RACE 方法对 3 个靶基因
mRNA 的 3′ 端剪切产物进行扩增(图 3: A)，3 个不
同目的片段经过琼脂糖凝胶电泳分离，分别切胶回
收，克隆到中间载体上，并随机挑选 8 个阳性克隆
子进行测序鉴定。测序结果显示，SlmiR393 对靶
标 SlTIR1、SlTIR1-like1 和 SlAFB 均存在剪切作用；
对每个靶基因被 SlmiR393 剪切的作用位点进行分
析表明，SlTIR1 和 SlAFB 均在 CGA/UCC 位点被
剪 切，SlTIR1-like1 却 在 CGG/UGU 位 点 被 剪 切，
但是这些剪切位点都是位于成熟 miR393 结合序
列的第 10 和 11 个碱基之间(图 3: B)。这也表明在
番茄中 3 个生长素受体同源基因 SlTIR1、SlTIR1-
like1 和 SlAFB 均为 SlmiR393 的靶基因。
2.4 SlmiR393及其靶基因的表达
分析 miRNA 的组织和发育特异性表达，可为
研究 miRNA 在生长发育过程中的潜在生理生化功
图3 SlmiR393对靶基因mRNA剪切作用的验证。 A. 5′RACE RT-PCR分离靶基因3′端剪切产物, SlTIR1、SlTIR1-like1和SlAFB为第二轮巢式PCR
的扩增产物; M：DNA marker I; B. SlTIR1、SlTIR1-like1和SlAFB转录本的剪切位点(箭头), 分数为每个切割位点由5′-RACE实验验证的频率。
Fig. 3 Validation of Sly-miR393 guided cleavage of target gene mRNA. A. Amplification of 3 cleavage-sequence of target gene; The
electrophoretogram shows the nested PCR products representing the 3-cleavage fragments that were cloned and sequenced for each gene; M: DNA
marker I; B. Mapping of cleavage sites of SlTIR1, SlTIR1-like1 and SlAFB; Cleavage sites in the target recognition sequences are marked with
arrowheads, and their frequency among sequenced clones of the same approximate size is noted above.
图 2 番茄 SlmiR393 基因发夹结构及克隆。A. SlmiR393 的发夹结构；
B. SlmiR393 前体基因的 PCR 产物； 1：SlmiR393 目的片段；M: Trans
2000 DNA Marker。
Fig. 2 Hairpin structure and clone of tomato SlmiR393. A. Hairpin
structure of SlmiR393; B. PCR products of SlmiR393; 1. SlmiR393; M:
Trans 2000 DNA Marker.
林冬波等：番茄SlmiR393基因超表达载体的构建及其靶基因鉴定
138 第21卷热带亚热带植物学报
图 4 SlmiR393 及其靶基因在番茄不同组织中的表达模式。
Fig. 4 Expression pattern of SlmiR393 and targets in different tissueses of tomato. R. Root; S. Stem; L. leaf; B. Bud; Fl. Flower; Fr. Red friut.
能提供重要的依据。本研究采用茎环引物 RT-PCR
方法分析 SlmiR393 在番茄不同组织中的表达模式。
结果表明，SlmiR393 在不同组织均有表达，但表
达水平不同，其中茎的表达最高，花的较强，根、叶、
花蕾的表达水平中等，果实的较弱(图 4: A)。为了
更进一步探讨 SlmiR393 与靶基因之间的表达水平
是否存在互补的关系，通过定量 PCR 技术对靶基
因在番茄中的组织特性表达模式进行分析，结果表
明，SlTIR1、SlTIR1-like1 和 SlAFB 基因存在不同
的组织时空表达模式，SlTIR1 在叶和花中的表达
水平高，超表达 SlTIR1 导致了叶形态结构发生改变
及出现单性结实的表型，这与 Ren 等[12]的报道结果
一致。SlTIR1-like1 在花中的表达强烈，在根、茎、叶、
花蕾中的表达次之，果实中仅有微弱表达。SlAFB
在茎中的表达较高，其他组织中的表达水平略低
(图 4: B, C, D)。这些结果表明，SlmiR393 积累水
平与靶基因的表达量在所有组织中并不完全成负
相关，其中 SlTIR1 在叶和茎中、SlTIR1-like1 在花蕾、
SlAFB 在花和叶中出现互补的关系。
2.5 SlmiR393植物表达载体的构建及鉴定
将目的片段切胶回收，正向克隆到 pLP35S 超
表达载体，命名为 pLP35S-pre-SlmiR393 (图 5)。以
pLP35S-cx 和 Pre-SlmiR393-R 为引物，对菌落进行
PCR 鉴定。从图 6 可见，1 号和 4 号单菌落能扩
增出 835 bp 的目的条带，与预期结果相符，说明目
的片段已成功正向插入植物表达载体 pLP100-35S，
即获得重组质粒 pLP35S-pre-SlmiR393。将初步验
证正确的重组质粒进行测序，结果表明获得的序列
完全正确。
第2期 139
图 6 重 组 子 菌 落 PCR 鉴 定。1,4：阳 性 克 隆； M：Trans 2000 DNA
Marker。
Fig. 6 Verification of positive clones by PCR. 1,4: Positive clones; M:
Trans 2000 DNA Marker.
3 讨论
目前，植物中已发现和分离了许多 miRNA[13]。
基于 miRNAs 序列的保守性和特殊结构，生物信
息学方法已成为一种最直接、快速、简便的鉴定
miRNAs 的方法。随着番茄基因组数据库的完善，
有助于采用生物信息学方法对番茄 miRNAs 进行
初步预测和鉴定。尽管生物信息学方法能够快速
预测到保守的 miRNAs，但仍存在一定的局限性，
如预测错误、信息不全等现象。因此，对预测到的
miRNAs 进行实验验证是很有必要的。
不同植物的 miR393 具有高度保守性，可以更
好地寻找到物种间靶标的同源基因。通过生物信
息学预测和 5′ RACE 技术相结合，在拟南芥和水
稻中鉴定出 miR393 的靶标基因是生长素的受体
TIR1 / AFB 基因家族[5,7]。在已知的番茄基因组序
列中，通过序列比对，我们认为 SlmiR393 靶基因也
是编码生长素受体 F-box 蛋白家族的成员。本研
究采用 5′ RACE 技术证实，番茄 SlmiR393 介导靶
基 因(SlTIR1、SlTIR1-like1 和 SlAFB)的 mRNA 剪
切降解，并且剪切位点符合大多数植物 miRNAs
对靶基因的剪切常常发生在结合序列中间位置的
一般性规律[2]。这些结果表明不同植物中 miR393
对目标基因的识别位点是保守的，由此我们推测
miR393 功能在不同植物也具有一定的相似性。
miRNAs 对靶基因具有剪切作用，使不同靶
基因之间的表达水平表现出相斥的特点。因此，
大多数植物 miRNAs 的表达模式与靶基因的表达
模式是相反的。在拟南芥中，miR398 与其靶基
因 CSD1 和 CSD2 在不同组织、发育阶段的表达模
式都表现出相反关系[14]。此外，玉米(Zea mays)中
miR166 和靶基因 leaf1 之间也存在相斥表达的现
象[15]。但拟南芥的成熟 miR393 与靶基因的表达
模式不存在典型的互补关系[16]。本研究中，番茄
SlmiR393 并没有像其他物种中的 miRNA 与其靶
基因表达水平呈现出相反的现象。只是在番茄某
个特定组织、发育时间出现这样相斥表达的现象。
由此我们推断 SlmiR393 可能在特定的组织或时期
内介导特定的靶基因 mRNA 的剪切降解，而不是
下调所有的靶基因表达。尽管如此，靶基因作为番
茄生长素信号途径中重要的组分，也可能在转录水
平上受到其它因素的影响。
由于很多植物 miRNA 都具有多个基因座位，
运用正向遗传筛选法很难找到完全功能缺失的
miRNA 突变体。尽管拟南芥中发生了 T-DNA 插
入突变 miR164b (miR164b-1)，但表型并没有很明
显的缺陷，因为成熟的 miR164 至少是由 3 个基因
座位所编码形成的[17]。因而，阐明植物的 miRNAs
功能都是通过超表达编码 miRNA 的前体序列，或
对靶基因 mRNA 上的剪切位点进行突变等方法来
实现的[18]。在转基因植物体内超表达 miRNA 前体
基因，使得内源的成熟 miRNA 积累水平增强，反而
图 5 SlmiR393 基因植物表达载体的构建图。miR393：SlmiR393 前体基因；GUS：GUS 基因；35S-P：CaMV 35S 启动子；35S-T：CaMV 35S 终止子；
NOS-T：NOS 终止子。
Fig.5 Construction of SlmiR393 plant expression vector. miR393: Precursor sequences of SlmiR393; GUS: GUS gene; 35S-P: CaMV 35S promoter;
35S-T: CaMV 35S terminator; NOS-T: NOS terminator.
林冬波等：番茄SlmiR393基因超表达载体的构建及其靶基因鉴定
140 第21卷热带亚热带植物学报
降低了靶基因的 mRNA 的表达丰度。这样的转基
因植株中就出现类似靶基因功能丧失的突变表现。
目前，使用这种方法研究番茄中 miRNA 的具体功
能也有一些报道。超表达 SlmiR156 的转基因植株
表现出腋芽增多、叶片变小、植物矮化等特征[19]；
番茄中超表达 SlmiR169 具有提高抗干旱胁迫的能
力[20]。另外，番茄中通过分别超表达 SlmiR4376 和
定点突变靶基因 ACA10 mRNA 上的剪切位点，番
茄的花形态特征发生变化，且果实产量降低[21]。这
些结果表明，植物 miRNA 超表达能够揭示它们具
体的功能。因此，本研究构建了 SlmiR393 植物超
表达载体 pLP35s-pre-SlmiR393，并通过农杆菌介
导的叶盘法转化番茄，旨在得到超表达的转基因植
株，这对于了解 SlmiR393 基因在番茄生长素信号
转导中的作用具有重要的意义。
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