全 文 ：热带亚热带植物学报 2016, 24(4): 406 ~ 412
Journal of Tropical and Subtropical Botany

收稿日期: 2015-10-21 接受日期: 2016-01-05
基金项目: 国家自然科学基金面上项目(51279011)资助
This work was supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (Grant No. 51279011).
作者简介：张琪(1985~ )，男，博士，主要从事淡水藻类分类及系统发育研究。E-mail: zhangqiwx@sina.com
* 通信作者 Corresponding author. E-mail: liugx@ihb.ac.cn




中国淡水共球藻纲新记录属种——土佐牧野藻
(Makinoella tosaensis Okada)

张琪 1, 宋会银 1,2, 郑凌凌 1, 宋立荣 1, 刘国祥 1*
(1. 中国科学院水生生物研究所，武汉 430072；2. 中国科学院大学，北京 100039)

摘要：报道分别从湖北省武汉市内和云南省西双版纳小水池中分离培养的两株绿藻，对其进行了形态和 18S rDNA 基因序列
分析，编号分别为 FACHB-1783 和 FACHB-1784。这两株绿藻具独特的四边形群体形态，通常为 4 或 16 个细胞，细胞为宽
椭圆形至不规则卵圆形、细胞壁两端无增厚，叶绿体多数、片状，具蛋白核。结合形态和分子系统发育分析，确定这两株绿
藻为我国 1 种淡水共球藻纲新记录属种——土佐牧野藻(Makinoella tosaensis Okada)。基于 18S rDNA 基因的系统发育研究表
明这两株绿藻与分离自韩国的土佐牧野藻基因序列相似度可达 99.6%~99.9%，并且以较高的支持值与土佐牧野藻聚在一起。
关键词：共球藻纲；卵囊藻科；土佐牧野藻；新记录
doi: 10.11926/j.issn.1005-3395.2016.04.007

Makinoella tosaensis Okada, A New Recorded Genus and Species of
Freshwater Trebouxiophycean Algae from China

ZHANG Qi1, SONG Hui-yin1,2, ZHENG Ling-ling1, SONG Li-rong1, LIU Guo-xiang1*
(1. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China)

Abstract: Two strains of green algae with No. FACHB-1783 and FACHB-1784 were isolated from small ponds in
Wuhan, Hubei Province and Xishuangbanna, Yunnan Province, respectively. Their morphology and 18S rDNA
sequences were studied. The typical coenobia of two strains are tetragonally arranged in flat, usually 4–16-celled.
Cells are broad ellipsoid to irregularly oval, without polar thickenings. Numerous chloroplasts are discoid, each
with a pyrenoid. Based on morphological and molecular phylogenetic evidences, the two strains were identified as
Makinoella tosaensis Okada, which was considered as a new recorded genus and species of freshwater
trebouxiophycean algae from China. The 18S rDNA sequence of the strains showed high similarity (99.6%-99.9%)
with those of M. tosaensis Okada from Korea. The phylogenetic analyses based on 18S rDNA sequence showed
that all strains of M. tosaensis Okada clustered into a clade with high support values.
Key words: Trebouxiophyceae; Oocystaceae; Makinoella tosaensis Okada; New record

牧野藻属 (Makinoella Okada)隶属于绿藻门
(Chlorophyta)共球藻纲 (Trebouxiophyceae)小球藻
目(Chlorellales)卵囊藻科(Oocystaceae)，是一类较
罕见的卵囊藻科成员。卵囊藻科类群是常见于静水
和流水中的淡水浮游植物类群[1]。卵囊藻科成员具
有一些共同的特征，如细胞通常呈球形、椭球形或
纺锤形，细胞壁多层，以似亲孢子方式繁殖[2]。这
一类群最显著的超微结构特征是细胞壁多层且每
层平行的纤维素质纤维垂直于相邻的细胞壁层[3–4]。
Komárek 将上述细胞壁特征作为卵囊藻科区别于球
第 4 期 张琪等: 中国淡水共球藻纲新记录属种——土佐牧野藻(Makinoella tosaensis Okada) 407


状绿藻其他科的依据[5]。超微结构和分子证据都表
明卵囊藻科是共球藻纲中 1 个单系的自然类群[2]。
基于独特的四边形群体形态以及细胞排列方式，建
立了牧野藻属[6]。土佐牧野藻(Makinoella tosaensis
Okada)是牧野藻属的模式种，也是此属的唯一物
种，目前仅在日本、韩国和斯洛伐克有报道[6–8]。
2012-2013 年，我们在湖北省武汉市和云南省
西双版纳的小池塘中分别采集、分离和培养了两株
球状绿藻，对其进行形态观察，同时结合 18S rDNA
基因序列构建系统发育树确定其分类学地位，确定
这两株球状绿藻均为土佐牧野藻，为我国卵囊藻科
绿藻的新记录属种。通过形态比较和分子系统发育
分析，本文还讨论了土佐牧野藻在卵囊藻科中的系
统发育位置。

1 材料和方法

1.1 采集、分离和培养
藻株分别采集自湖北省武汉市武汉动物园内
的人工池塘(时间：2013 年 6 月 10 日，地点：30°32′
28″ N, 114°14′27″ E)和云南省勐腊县西双版纳热带
植物园的小池塘(时间：2012 年 7 月 12 日，地点:
21°55′12′′ N, 101°16′38′′ E)。用毛细管吸取少量水样
滴于载玻片上，在显微镜下确认含有目标藻细胞后
加适量 BG11 培养基[9]稀释，反复吸取-镜检-稀释,
直到水滴中只含单个目标藻种细胞，再转移至含有
BG11 培养基的 96 孔板中静置培养，光暗周期
12 h/12 h，光照强度 40 μmol m–2s–1，培养温度 25℃。
20 d 后镜检藻种生长状况。将获得的单种扩大至
50 mL 三角瓶中培养，藻种保藏于中国科学院淡水
藻种库(FACHB-collection)，分离自武汉和西双版纳
的藻株编号分别为 FACHB-1783 和 FACHB-1784。

1.2 形态观察
取少量新鲜藻细胞，在 Leica DM5000 型显微
镜下观察形态，并用 Leica DFC320 型 CCD 采集图
像，并进行微分干涉(Differential interference contrast,
DIC)和相差(Phase contrast, PH)照相。

1.3 DNA 提取、PCR 扩增和序列测定
采用 CTAB 方法[10]提取这两株藻的基因组。用
于 18S rDNA 扩增和测序的引物分别为 18S-F: 5′-AA-
CCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′和 18S-R: 5′-TGAT-
CCTTCTGCAGGTTCACCTACG-3′[11]。50 μL 的 PCR
反应体系：25 ng 模板基因组 DNA，10×缓冲液 5 μL，
2.5 mmol L–1 的 dNTP 4 μL，20 μmol L–1 的引物各
1 μL，Taq DNA 聚合酶(TaKaRa ExTaq) 1.25 U，以
灭菌双蒸水补足。18S rDNA 的 PCR 反应条件：94℃
预变性 5 min, 94℃变性 1 min，55℃退火 50 s，72℃
延伸 1.5 min，32 个循环；72℃延伸 5 min。扩增产
物用 Axygene 凝胶回收试剂盒回收、纯化，并送北京
华大基因科技有限公司进行测序。序列提交至 NCBI，
获得 GenBank 登录号为 KP318979 和 KP318980。

1.4 形态发育分析
从 GenBank 下载序列相似的绿藻序列，利用
Clustal X (V 1.8)对基因序列进行比对 [12]，辅以
Bioedit (V 7.0.9.1)手工校正[13]。使用 MEGA5 计算
碱基组成和转换/颠换值[14]。
分别使用最大似然法(ML, Maximum Likelihood)
和贝叶斯法(BI, Bayesian Inference)构建基于 18S
rDNA 序列的系统发育树。ML 树采用 RAxML (V
7.2.6)软件完成[15]，BI 树采用 MrBayes (V 3.1.2)软件
完成[16]。ML 树和贝叶斯树中替代模型的选择采用
jModelTest (V 2.1.5)程序进行分析，按赤池信息量准
则(Akaike information criterion, AIC)标准选择最适
合的替代模型，筛选出最适模型为 TrN+I+G[17]。在
ML 分析中，选择执行快速支持度分析并采用自展
支持(Bootstraps, BP) 进行 1000 次重复检验。在贝
叶斯分析中，采用马尔科夫链蒙特卡洛方法 Markov
Chain Monte Carlo, MCMC)设置 7 条链(6 条热链，1
条冷链)运行 106 次，每运行 100 次获得 1 个进化树，
舍弃老化样本 burnin=1000，并采用后验概率
(Posterior probability, PP)进行重复检验。

2 结果

2.1 形态描述
土佐牧野藻 (图 1)
Makinoella tosaensis Okada, Okada Y. J Jap Bot,
1949, 24: 166–168[6].
定形群体，群体常呈四边形，通常为 4 或 16
个细胞，极少数为 2、8 或 32 个细胞，具明显的、
可见分层的群体胶被(图 1: A~F)。4 细胞的定形群
体呈方形，细胞位于一个平面上，两个细胞形成内
层对，两个细胞形成外层对，相互以近端部相连(图
408 热带亚热带植物学报 第 24卷



图 1 土佐牧野藻的形态。A, B: 典型的 16-细胞群体; C: 4-细胞群体; D: 16-细胞群体, 示胶被; E: 4-细胞群体, 示胶被; F: 4-细胞群体细胞壁; G~H: 长
期实验室培养条件下的群体形态。标尺: A~B, D: 50 μm; C, E~I: 20 μm
Fig. 1 Morphology of Makinoella tosaensis Okada. A, B: Typical 16-celled coenobia; C: 4-celled coenobia; D: 16-celled coenobia, showing mucilaginous
envelopes; E: 4-celled coenobia, showing mucilaginous envelopes; F: Empty 4-celled coenobia, showing the cell wall; G-H: Coenobia under long-term
laboratory conditions. Bars: A, B, D: 50 μm; C, E-I: 20 μm

1: C, F)。4 细胞定形群体通过垂直于定形群体平面
的方式分裂，从而形成矩形、卵圆形或不规则形状
的 16 细胞聚合定形群体(Syncoenobia) (图 1: B, D)。
成熟的 4细胞定形群体和聚合定形群体细胞呈菱形
排列，并且群体内部具有一定空隙。除细胞幼年阶
段或似亲孢子形成阶段之外，定形群体内部空间通
常为矩形或长菱形(图 1: E)。常为 16 个细胞的聚合
定形群体通常可以破裂母细胞壁的方式释放出 4细
胞定形群体。具有胶被的 4 细胞定形群体大小为
60~70 μm×50~60 μm，16 细胞的定形群体大小为
80~100 μm×60~80 μm。
细胞呈宽椭圆形至不规则卵圆形，稍不对称,
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细胞 12~26 μm×8~16 μm，在似亲孢子形成阶段 18~
30 μm×12~18 μm。细胞壁明显，表面平滑，没有覆
盖物或显著的两端增厚。叶绿体 8~16 个或更多, 亮
绿色，周生，片状。每个叶绿体都具有一个显著的
具淀粉鞘的蛋白核(图 1: C, I)。
定形群体多数以形成4个(少数2个)似亲孢子的
方式进行繁殖。子代细胞长期保留于显著膨大的母
细胞壁中，最后会通过细胞壁胶化的方式释放出来。
淡水浮游种类，通常发现于池塘或小水池等小
水体中，常与其它蓝藻、绿藻或鞭毛藻类伴生。此
物种为牧野藻属的模式种，也是目前此属仅有的 1
个物种。本研究发现此物种在我国湖北(武汉)和云
南(西双版纳)均有分布。在长期培养条件下，土佐
牧野藻细胞更宽圆，细胞单生或形成 2~32 个细胞
的群体且细胞排列规律不太明显(图 1: G~I)。

2.2 序列分析
分离自武汉(FACHB-1783)和西双版纳(FACHB-
1784)的藻株，其 18S rDNA序列长度分别为 1698 bp
(KP318979)和 1685 bp (KP318980)。以莱茵衣藻
(Chlamydomonas reinhardtii Dangeard)为外类群，搜
集其他共球藻纲类群相同基因序列，构建基于 18S
rDNA 基因的系统发育树。在 18S rDNA 基因序列
矩阵中，含有 38 个长度为 1612 bp 的序列，共有
472 个可变位点(Variable site)，其中有 328 个可供简
约分析的信息位点(Parsimony-informative site)、144
个单态位点(Singleton site)。A、T、C 和 G 碱基的
平均含量分别为 24.3%、25.0%、22.6%和 28.1%,
其中 A+T 含量(49.3%)与 G+C 含量(50.7%)几乎相
等，碱基转换/颠换值为 1.76。我们所分离的藻株与
GenBank 中土佐牧野藻序列(AF228691)相似性高达
99.6%~99.9%，这进一步支持了形态学鉴定的结果。
这些土佐牧野藻序列与卵囊藻科近缘种类[湖北延
胞藻(Ecballocystis hubeiensis Liu et Hu)和 Elonga-
tocystis ecballocystiformis Krienitz & Bock]的相似性
为 96.8%~98.4%，遗传距离为 p=0.013~0.030 (表 1)。

表 1 牧野藻及其近缘类群 18S rDNA 序列间的遗传距离(成对未修正的 p-距离) (左下)和相似性(右上)
Table 1 Distance (pairwise uncorrected p-distances) (lower left) and identity (upper right) based on 18S rDNA sequences of Makinoella Okada and its allied taxa

土佐牧野藻
M. tosaensis
AF228691
土佐牧野藻
M. tosaensis
KP318979
土佐牧野藻
M. tosaensis
KP318980
湖北延胞藻
Ecballocystis
hubeiensis JX018185
Elongatocystis
ecballocystiformis
HQ008713
土佐牧野藻 M. tosaensis AF228691 0 99.7% 99.6% 96.8% 98.1%
土佐牧野藻 M. tosaensis KP318979 0.001 0 99.9% 97.0% 98.4%
土佐牧野藻 M. tosaensis KP318980 0.001 0.000 0 96.9% 98.3%
湖北延胞藻 Ecballocystis hubeiensis JX018185 0.030 0.029 0.029 0 96.3%
Elongatocystis ecballocystiformis HQ008713 0.013 0.013 0.013 0.033 0

2.3 系统发育分析
基于不同方法构建的 18S rDNA 系统发育树均
显示共球藻纲(Trebouxiophyceae)类群可以形成几
个分支，分别为卵囊藻科(Oocystaceae)分支(BP/PP=
1.00/1.00)、小球藻科 (Chlorellaceae)分支 (BP/PP=
0.99/1.00)、渡边藻分支(Watanabea-clade, BP/PP=
0.96/1.00)、环藻科(Prasiolaceae)分支(BP/PP=1.00/1.00)、
葡萄藻分支 (Botryococcus-clade, BP/PP=0.96/1.00)
和共球藻科 (Trebouxiaceae)分支 (BP/PP=0.97/1.00)
(图 2)。系统发育分析结果表明，所有的卵囊藻科成
员都聚成一支，形成了单系的卵囊藻科分支，且不
同来源的土佐牧野藻聚在一起，并获得高度支持
(BP/PP=1.00/1.00)。同时，卵囊藻科的代表性类群
卵囊藻属(Oocystis Nägeli ex Braun)不是单系起源
的，土佐牧野藻分支与卵囊藻属类群关系似乎都不
太密切。土佐牧野藻与卵囊藻科的其他一些类群如
湖北延胞藻和 Elongatocystis ecballocystiformis 关系
密切(BP/PP=1.00/1.00) (图 2)。

3 讨论

土佐牧野藻(Makinoella tosaensis Okada)于
1939 年最早从日本高知县高知大学校园内的一小
水池中分离，由于其独特群体形态特征，被认为是
卵囊藻科内的 1 新属[6]。为纪念日本著名的植物学
家牧野富太郎(Tomitaro Makino)先生，以牧野先生
的姓氏命名了此属，并以其出生地日本高知县(旧称
土佐 Tosa)作为种加词。随后，Kamiya 又进一步研
究了此物种的生殖方式[18]。除日本外，Hegewald
等[7]首次在韩国一校园内的小水池中发现了此物
410 热带亚热带植物学报 第 24 卷




























图 2 基于共球藻纲 18S rDNA 序列构建的最大似然树。节点上的数值代表分别用最大似然法和贝叶斯法所得当前进化枝的自展支持(BP)和后验概率
(PP)。仅显示高于 50%的支持值。
Fig. 2 Maximum-likelihood tree based on 18S rDNA sequences of Trebouxiophycean. The numbers on the nodes indicate the posterior probabilities/bootstrap
support values based on Maximum Likelihood and Bayesian Inference. Only values >0.50 are shown.

种，并首次研究了其超微结构[19]。土佐牧野藻曾一
度被认为是东亚特有种，但后来在斯洛伐克共和国
布拉迪斯拉发城(Bratislava)的斯洛伐克科学院园区
内的一个小池塘中也发现了此物种。由于在东亚地
区之外发现此物种，从而推测此物种在温带地区具
有更广泛的分布[8]。但是，我们在云南省最南端属
于热带湿润区的西双版纳自治州勐腊县发现了此
物种，这表明这一物种的分布不仅限于温带地区,
而且在热带地区也有分布。本研究不仅首次在中国
发现了此物种，并将其分离、纯化和培养，保藏于
中国科学院淡水藻种库，而且首次在热带地区报道
了此物种的存在。然而，不论是在日本、韩国或斯
洛伐克发现的藻株，还是我们在中国报道的藻株,
都具有相似的生境，即类似于公园池塘的小水体。
土佐牧野藻最初被认为隶属于卵囊藻科
(Oocystaceae)[6]。由于其群体发育特征，将其置于
栅藻科(Scenedesmaceae)，但根据原始文献的描述此
藻具多个叶绿体并缺乏蛋白核，认为此物种也可能
属于黄藻纲[20]。然而，在透射电镜下观察超微结构，
这一物种不仅具有多个叶绿体，而且每个叶绿体内
还具有一个被淀粉鞘包裹的蛋白核[19]。近年来，通
过分子手段进一步证实了土佐牧野藻位于卵囊藻
Chloroidium ellipsoideum FM946012
Heveochlorella hainangensis EF595524
Parachloroidium lobatum HF586461
Watanabea reniformis FM958480
Prasiolopsis ramosa AY762600
Stichococcus chlorelloides AY271675
Myrmecia astigmatica Z47208
Trebouxia aggregata EU123942

Botryococcus braunii AJ581912
Coccomyxa chodatii FJ648512
Elliptochloris bilobata AM422984


Heynigia riparia GQ487225
Chlorella vulgaris FR865658
Didymogenes soliella AB731605
Micractinium inermum AB731604
Hindakia fallax GQ487224

Dictyosphaerium ehrenbergianum GQ477063
Parachlorella hussii HM126550


Oocystis parva JQ315649
O. marssonii AF228688
Lagerheimia genevensis AY122336
Tetrachlorella alternans AF228687
Makinoella tosaensis AF228691
M. tosaensis FACHB-1784 KP318980
M. tosaensis FACHB-1783 KP318979
Elongatocystis ecballocystiformis HQ008713
Ecballocystis hubeiensis JX018185
E. dichotomus
JX018184

Oocystis solitaria AF228686

Eremosphaera viridis AF387154


Chlamydomonas reinhardtii JN903978

0.71/0.56
1.00/1.00
1.00/1.00
1.00/1.00
0.72/0.96
0.71/0.99
0.86/1.00
0.97/1.00
0.98/1.00
1.00/1.00
1.00/1.00
0.99/1.00
0.65/0.76
0.65/0.98
0.99/1.00
0.74/0.56
0.96/1.00
0.97/1.00
1.00/1.00
0.52/0.96
1.00/1.00
1.00/1.00
0.96/1.00
0.61/0.99
0.82/1.00
0.05 Substitutions/site BP/PP
-/0.93
Outgroup
Oocystaceae
Chlorellaceae
Botryococcus-clade
Trebouxiaceae
Prasiolaceae
Watanabea-clade

第 4 期 张琪等: 中国淡水共球藻纲新记录属种——土佐牧野藻(Makinoella tosaensis Okada) 411


科[2]。土佐牧野藻典型的 4 细胞定形群体特征为两
个细胞形成内层对、两个细胞形成外层对，相互以
近端部相连，类似于四球藻属 (Tetrachlorella
Korshikov)；但是，土佐牧野藻营养细胞群体通常
具有独特的矩形或长菱形的内部空间[8,21]。与土佐
牧野藻一样，一些卵囊藻属代表性的物种，如单生
卵囊藻(Oocystis solitaria Wittrock)也具有多个片状
叶绿体且每个叶绿体都具 1 个蛋白核。但是，土佐
牧野藻与单生卵囊藻相比，细胞不呈柠檬形且缺乏
明显的两端增厚[8]。
基于 18S rDNA 序列的系统发育研究表明，卵
囊藻科类群与共球藻纲其他类群关系都不密切，是
单系起源的自然类群。但是，此科中的分类单元数
量可能比之前认为的要少[22]。我们的系统发育研究
也明确支持土佐牧野藻是卵囊藻科的成员，而不是
栅藻科成员。在 Hepperle 等[2]的系统发育研究中,
土佐牧野藻是 1 个单独分支，与其他卵囊藻科类群
都不太密切。我们的系统发育研究支持 Xia 等[23]的
观点，即土佐牧野藻与湖北延胞藻和 Elongatocystis
ecballocystiformis 亲缘关系密切。这三者具有许多
共同的形态特征，例如细胞宽椭圆形或卵形，具含
淀粉鞘的蛋白核，细胞壁厚、平滑，具明显胶被, 两
端通常不增厚。除了叶绿体数量不同外(土佐牧野藻
8~16 个或更多、湖北延胞藻 2~6 个、Elongatocystis
ecballocystiformis 有 1~4 个)，这三者间形态特征最
大不同之处在于野外条件下土佐牧野藻具有独特
的四边形群体形态以及细胞排列方式，湖北延胞藻
为不规则分子的树状群体，Elongatocystis ecballo-
cystiformis 为单生的[23–24]。基于形态和分子系统发
育分析的结果支持在卵囊藻科进化过程中发生了
质体丢失事件的假设，即以单生卵囊藻和土佐牧野
藻为代表的原始卵囊藻科类群的似亲孢子具有多数
叶绿体，而以 Oocystis marssonii Lemmermann 和四
球藻属为代表的一些卵囊藻科类群的似亲孢子仅
具有 1 个质体[2]。
目前，已有不少关于卵囊藻科类群生态和生化
方面的研究报道[25–27]，但是由于缺乏更多分类群的
分子序列，因此卵囊藻科类群的系统发育研究仍有
很多不足。现有的系统发育结果表明卵囊藻科是单
系起源的自然类群，但是此科属种水平的分类单元
是高度不稳定的[24]。也正是由于缺乏更多的分子数
据，包括土佐牧野藻在内的多数卵囊藻科类群的系
统发育位置仍不清楚。未来随着更多分类类群 DNA
分子数据的加入以及更多分子标记的采用，才能进
一步阐明卵囊藻科类群的亲缘关系和系统发育位
置，确定卵囊藻科内属种的定义和界限。

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