全 文 ：热带亚热带植物学报 2016,24(1)：40 ~ 49
Journal of Tropical and Subtropical Botany

收稿日期: 2015-04-07 接受日期: 2015-06-27
基金项目: 福建农林大学科研创新团队项目(cxtd12013)资助
This work was supported by the Science Research Innovation Team Project of Fujian University of Agriculture and Forestry (Grant No. cxtd12013).
作者简介: 郑鸿昌(1987~ )，男，硕士，现在福建省永安市农业局工作，从事花卉遗传育种与生物技术研究，E-mail：zhenghongchang@vip.qq.com;
刘涛(1990~ )，男，在读硕士研究生，研究方向为花卉遗传育种与生物技术研究，E-mail：Liv_s@outlook.com
* 对本文贡献等同，并列第一作者。
** 通信作者 Corresponding authors. E-mail: pdm666@126.com; guixinchen@126.com


夜香树均一化全长cDNA文库的构建及EST分析

郑鸿昌1a,2*, 刘涛1a*, 吕恃衡1a, 陈建军1a, 何水林1b, 潘东明1a**, 陈桂信1a**
(1. 福建农林大学, a. 园艺产品贮存保鲜研究所; b. 作物科学学院, 福州 350002；2. 福建省永安市农业局，永安 366000)

摘要：为构建高质量的夜香树(Cestrum nocturnum)均一化全长cDNA文库，以其花朵为材料，采用DSN均一化技术与改进的
SMART技术相结合，将连接产物进行脱盐浓缩后电转化进行构建。结果表明，未脱盐连接产物的转化效率为1 µL连接产物
有7000个菌落，理论重组率为96%；脱盐后，提升为4.1×106个菌落，理论重组率为98%；蓝斑也有插入片段，实际重组率应
为100%；插入片段大小平均为1.6 kb。随机挑取500个单克隆(含50个蓝斑)测序，共获得464条EST，单一序列(unigene)为426
条，占91.8%，其中片段重叠群26个，单基因400个，冗余率仅为8.1%，表明构建文库的均一化效果较好，可满足后续功能
基因的筛选和基因信息的研究。
关键词：夜香树；均一化 cDNA 文库；EST
doi: 10.11926/j.issn.1005-3395.2016.01.006

Construction of Normalized Full-length cDNA Library and EST Analysis
from Cestrum nocturnum L.

ZHENG Hong-chang
1a,2*
, LIU Tao
1a*
, LÜ Shi-heng
1a
, CHEN Jian-jun
1a
, HE Shui-lin
1b
, PAN Dong-ming
1a**
,
CHEN Gui-xin
1a**

(1a. Institute of Storage Science and Technology of Horticultural Products; 1b. College of Crop Science, Fujian Univesity of Agriculture and Forestry, Fuzhou
350002, China; 2. Agriculture Bureau of Yong‘an City, Yong‘an 366000, Fujian,China)

Abstract: In order to construct high-quality normalized full-length cDNA library of Cestrum nocturnum L., the
library from its flowers was established successfully by combined modified SMART technology, DSN digestion
with desalting of ligation product. The results showed that transformation efficiency of the ligation product
without desalting was 7000 colonies per microliter, and theoretical recombination rate was 96%, whereas, the
transformation efficiency increased up to 4.1×10
6
colonies per microliter, and theoretical recombination rate was
98% after the ligation product desalting. Actually, blue colonies also contained the insert fragments, and, the
recombination rate was to 100%. The average size of inserts in the library was about 1.6 kb. Five hundred
colonies including 50 blue colonies were randomly picked for sequencing from the library, 464 effective
sequences were obtained including 426 unigenes (accounting for 91.8%), which were composed of 26 contigs and
400 single genes, redundant rate was only 8.1%. So, it was suggested that the quality of the normalized cDNA
library was better than that of ordinary cDNA libraries, which could be used for further research of screening of
functional genes and their related information.
Key words: Cestrum nocturnum; Normalized cDNA library; EST
第 1 期 郑鸿昌等：夜香树均一化全长 cDNA 文库的构建及 EST 分析 41

夜香树(Cestrum nocturnum L.)又叫夜香花、夜
光花、木本夜香树、夜丁香，是茄科(Solanaceae)
夜香树属植物，直立或近攀援状灌木，高 2~3 m，
全体无毛；枝条细长而下垂[1]。作为一种典型的长
短日照香花植物，夜香树几近家喻户晓，在我国南
方地区栽培广泛。夜香树独特生物习性及其在药
物、园林等方面的应用，使其具有一定的研究价值。
包含特定组织或器官mRNA信息的cDNA文
库是研究基因结构、功能、操纵的有力工具之一[2]。以
构建cDNA文库为基础的表达序列标签技术(Expressed
sequence tag, EST)，其包含的信息，如全基因组序
列、转录组、蛋白质组、代谢物组等，有助于对
基因的结构及其演变、基因表达的分析、新基因
的发现及功能鉴定、功能基因组等的研究[3–4]。目前，
cDNA文库构建和EST分析相结合的方法已经在一
些植物上得到应用，如木奈(Prunus salicina)、铁皮
石斛 (Dendrobium officinale) 、青杄云杉 (Picea
wilsonii)、‗巴西蕉‘(Musa acuminata L. AAA group,
‗Brazilian‘)等[5–8]，说明其在果树、花卉、作物等各
类植物上具有一定的通用性，对于后续的研究也有
着深远的意义。目前对夜香树的研究，如生理、组织
培养、代谢物等[9–12]，较少涉及分子水平，但其对于
揭示物种的特性和本质来说是必不可少的。
本研究以盛花期的夜香树花朵为材料，将
SMART技术与DSN均一化技术相结合，构建了夜香
树芳香期均一化全长cDNA文库，并进行了EST测序
和分析，并用Blast2 go在线软件对测序结果进行注
释和归类分析，找出与夜香树花香和生物钟相关的基
因，为后续夜香树的分子水平研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料
2010 年 9-10 月夜间 8:30-12:00 从福建农林大
学旧行政楼花园中的夜香树(Cestrum nocturnum)植
株上，选取开花并释放浓香的花朵，去除雌雄蕊后，
将其包于锡箔纸内并做好标记，立即用液氮速冻，
存于-80℃超低温冰箱备用。

1.2 试剂
试验所用Creator SMART cDNA Library Constrution
jtsb93 639138)购自Clontech公司；dNTP (Cat. No.
R0192)购自Fermantas公司; SuperScript II (RNase H-,
Cat. No. 18080-044)、DH10B感受态细胞(Cat. No.
12033-015)、SOC培养基(Cat. No. 15544-034)购自
Invitrogen公司；Spectra/Por 7半透膜(Cat. No. 132117)
购自Spectrum Laboratories; VSWP杂交膜(Cat. No.
VSWP02500)购自Millipore公司 ; Trimmer Direct
cDNA normalization Kit (Cat. No. EA001)、DSN
(Duplex-specific Nuclease, Cat. No. EA001)购自
Evrogen公司; Taq DNA聚合酶(Cat. No. 201205)购
自Qiagen公司; RNase A (Cat. No. DB0473)购自
BioBasic公司。其他试剂均为进口或试验室制备。

1.3 方法
总RNA提取 取0.1 g花朵放入已消毒并加入
液氮的研钵中，研磨至细的粉末，采用改良的Trizol
(invitrogen, Cat. No. 15596-018)法提取总RNA。由于
夜香树花朵中含有多糖，氯仿抽提后，按抽提液꞉
异丙醇꞉5 mol L–1 NaCl=4꞉3꞉3混匀；冰浴30 min；在
4℃17000×g下离心30 min；去除上清，加入75%乙
醇1 mL清洗2次；在4℃7500×g下离心5 min，去除
上清，沉淀于室温晾干；最后用10 µL无RNase水溶
解沉淀，取1 µL样品进行电泳检测，用紫外分光光
度仪测定夜香树花朵总RNA的浓度与纯度。
逆转录反应 引物改良：将 Creator
SMARTcDNA Library Constrution Kit中5′端引物中
T碱基变为U，其3′端进行磷酸化修饰，改良后5′端
和3′端逆转录引物序列分别为5DSH1: 5′-GCCAUU-
ACGGCCUAGUUACGGGGp-3′，3DSH2: 5′-GTAA-
TACGACTCACTATAGGGCGTCATCTATGTCGG-
GTGGGCCGAGGCGGCCT15VN-3′。逆转录改良:
将Creator SMART cDNA Library Constrution Kit中
的一步法改为两步法。第一次逆转录：取1~5 μg总
RNA (约4.3 µL)，加入50 μmol L–1 5′端逆转录引物
0.3 µL、50 μmol L–1 3′端逆转录引物0.4 µL，混匀并离
心；在PCR仪上72℃变性2 min；迅速放于冰上冷却
2 min，离心；依次加入：5×Fist-strand Buffer (Clontech,
Cat. No. S2315) 2 µL、0.1 mol L–1DTT (Clontech, Cat.
No. S2316) 1 µL、10 mmol L–1 dNTP 1 µL、200 U µL–1
SuperScript II (RNase H-) 1 µL，在PCR仪上42℃反
应1 h，放冰上备用。第二次逆转录：取50 μmol L–1
5′端逆转录引物0.2 µL，补水至5 µL，在PCR仪上72℃
变性2 min；立即在冰上冷却2 min，离心，将其转
入第一次反应管中；依次加入5×Fist-strand Buffer
2 µL、0.1 mol L–1 DTT 1 µL、10 mmol L–1 dNTP mix
1.35 µL、100×BSA (10 mg mL–1, NEB, Cat. No.
42 热带亚热带植物学报 第 24 卷

B9001S) 0.2 µL、200 U µL–1 SuperScript II (RNase
H-) 1.2 µL和100 mmol L–1 MnCl2 20.45 µL，混匀,
离心；在PCR仪上42℃反应1 h；加入25 mmol L–1
NaOH 2 µL，混匀，在PCR仪上68℃反应30 min, 离心，
置冰上备用。
逆转录产物的纯化 将逆转录产物在0.8%
无EB琼脂糖凝胶中电泳；切取0.5~5 kb之间的胶条，
装入10K MWCO Spectra/Por 7半透膜中，电泳1 h,
将正负极对调，电泳45 s；挤出胶条，取出半透膜
内的透析液，加入等体积酚꞉氯仿꞉异戊醇(25꞉24꞉1,
pH 6.0~7.2, Ambion, Cat. No. AM9730)，轻轻摇匀；
于4℃15493×g下离心20 min；取上相，加入等体
积氯仿，轻轻摇匀；于4℃15493×g下离心20 min, 取
上相；加入0.1倍体积的3 mol L–1 NaAc (pH 5.2),
0.01倍体积的糖原(20 mg mL–1)，摇匀；再加入2.5
倍体积的无水乙醇，放-20℃过夜；于4℃16800×g
下离心1 h，去上清，加入75%乙醇1 mL–1洗1次；于
4℃ 7500×g下离心5 min，去上清，沉淀室温下晾干，
用40 µL 1×TE (pH 8.0)溶解沉淀。
全长ds-cDNA的合成 采用改进Creator
SMART cDNA Library Constrution Kit的方法，并根
据Piao[13]、Dai [14–15]的研究结果，将一轮LA-PCR扩
增改为两轮扩增，并设计了有利于长片段cDNA第
二链扩增的引物序列。第一轮：取10 µL纯化的逆
转录产物，上游引物为5DSH：5′-GTAATACGAC-
TCACTATAGGGCGTCATCTATGTCGGGTGGC-
CATTACGGCCTAGTTACGGGp-3′，下游引物为
3DSH2，采用AdvantageTM PCR Kit的方法扩增
100 µL，分装成4管，每管25 µL，热启动PCR反应
程序为：95℃预变性3 min；然后95℃12 s，57℃
30 s，68℃6 min，60℃1 min，68℃8 min，共6个
循环；最后68℃30 min。产物的纯化方法同上，沉
淀用55 µL 1×TE溶解。第二轮：取5 µL纯化的第一
轮扩增产物，引物为P1: 5′-GTAATACGACTCA-
CTATAGGGGC-3′; 采用AdvantageTM PCR kit的方
法扩增25 µL，热启动PCR反应程序为：95℃预变
性3 min；然后95℃12 s，57℃30 s，68℃8 min，
共12~23个循环；最后68℃30 min。从第12个循环
起，取5 µL电泳，以确定合适的循环数，然后进行
大量扩增(100 µL)。产物的纯化同上，沉淀用7 µL无
菌水溶解，取1 µL进行电泳检测。
全长cDNA均一化处理 对Trimmer Direct
cDNA normalization Kit的方法进行改良，将6 µL纯
化的第二轮产物、1.6 µL 10×HYB Buffer、0.1 mol L–1
Tris-HCl (pH 8.0)、10 mmol L–1 EDTA (pH 8.0)、
5 mol L
–1
NaCl、8.4 µL无菌水混匀，2350×g离心,
分装3个PCR管中，分别标上CK (对照)、1/4、1/2，
每管4 µL，2350×g离心；在PCR仪中98℃2 min和
68℃4.5 h，取5 µL 68℃预热的2×DSN Master
Buffer、50 mmol L–1 Tris-HCl (pH 8.0)、50 mmol L–1
MgCl2、10 mmol L
–1
DTT加入杂交管中，用枪轻轻
吹打混匀，迅速放回PCR仪中68℃10 min；按CK、
1/4、1/2的顺序，分别加入1 µL的DSN (Duplex-
specific Nuclease) storage Buffer、50 mmol L–1 Tris-
HCl (pH 8.0)、1/4U DSN和1/2U DSN，迅速用另一
支枪快速吹打10下，马上放回PCR仪中68℃25 min，
注意不要让管冷却, 按CK、1/4、1/2顺序，分别加
入10 µL stop solution (10 mmol L–1 EDTA pH 8.0),
用枪轻轻吹打混匀，2350×g离心，马上放回PCR仪
中68℃5 min，加20 µL无菌水，用枪轻轻吹打，混
匀，2350×g离心，放冰上备用。
全长均一化cDNA扩增 取1 µL DSN处理产
物，引物为P2: 5′-GTCATCTATGTCGGGTG-3′，扩
增反应体系25 µL，扩增程序同第二轮扩增；从第
12个循环起，CK和1/4 DSN管各取5 µL电泳；从第
15个循环起，每隔一定循环数，在CK、1/4 DSN和
1/2 DSN管中，各取5 µL电泳检测，确定DSN处理的
最适浓度和LA-PCR的最佳循环数。以最适浓度
DSN处理的产物为模板，在最佳循环数下，扩增
100 µL全长均一化cDNA。
扩增产物纯化 取50 µL全长均一化cDNA
扩增产物，加入2 µL的蛋白酶K (20 µg mL–1)，轻轻
混匀，离心；在PCR仪上45℃ 20 min，2350×g离心，
转入0.5 mL离心管中，加入70 µL无菌水，混匀；加
入200 µL酚꞉氯仿꞉异戊醇(25꞉24꞉1, pH 6.0~7.8)，颠
倒混匀；于25℃ 17968×g离心20 min；取上相
110 µL，转入新的0.5 mL离心管中，加入110 µL氯
仿，上下颠倒混匀；于25℃ 17968 ×g离心20 min；取
上相80 µL，补水20 µL，加入10 µL 3 mol L–1 NaAc
(pH 5.2)和1.2 µL糖原(20 µg µL–1)，混匀，室温下加
入2.5倍无水乙醇，混匀，于-20℃过夜；次日在
4℃ 17000×g下离心60 min，去上清，沉淀加入1000 µL
的80%乙醇洗1次；4℃ 7500×g离心5 min，去上清, 晾
干沉淀，加79 µL无菌水溶解沉淀。
扩增产物的酶切与回收 取79 µL纯化的全
长均一化cDNA扩增产物，转入到PCR管中，依次加
入10 µL 10×Buffer 2 (NEB, Cat. No. B7002S)、1 µL
100×BSA (10 mg mL
–1
, NEB)和10 µL Sfi I (20 U µL–1,
第 1 期 郑鸿昌等：夜香树均一化全长 cDNA 文库的构建及 EST 分析 43

NEB, Cat. No. R0123L)，混匀，2350×g 离心，在 PCR
仪中 50℃酶切 3 h。酶切产物回收方法同上。
扩增产物的连接 将纯化的酶切产物溶于
7.7 µL无菌水，依次加入以下成分：1 µL 10×T4 DNA
Ligase Buffer (Fermentas)、0.5 µL含Sfi I定向克隆位
点的pBlueScript Ⅱ (50 ng µL–1, 由加拿大Bio S & T
公司俞长河博士赠送)和0.8 µL T4-Ligase (5 U µL–1,
Fermentas, Cat. No. EL0011)，混匀，2350×g离心，
放入16℃水浴锅温育过夜(12~16 h)。
连接产物透析脱盐 取4 µL连接产物到
0.025 µm VSWP杂交膜的光面上(光面朝上，粗面朝
下)，用接种铲轻轻转移到有50 mL脱盐缓冲液(加拿
大Bio S & T Inc.俞长河博士提供)的培养皿中，让杂交
膜在液面上漂浮2 h，再用接种铲轻轻转移到有无菌水
的培养皿中，让杂交膜在液面上漂浮1 h，用枪头吸取
其上液滴(8~10 µL)到1.5 mL EP管，再用10 µL无菌水
洗杂交膜1次，将洗液吸回1.5 mL EP管，真空中等强度
下浓缩12 min，获得2.5~3 µL浓缩液。
连接产物转化 取2 µL连接产物和2.5 µL脱
盐浓缩液，分别与20 µL DH10B感受态细胞混匀，
用电激转化枪(BioRad, Gene Pulser Xcell 617BR1
07089)进行电转化；将转化产物转入含有1 mL
37℃预热液体SOC培养基的15 mL离心管中，于
37℃ 120 r min–1摇1 h；每管加入500 µL 50%甘油，
混匀；未脱盐的取3 µL菌液，涂在含氨苄、IPTG、
X-gal的LB平板上，脱盐的取1 µL稀释100倍，再取
3 µL菌液，涂在含氨苄、IPTG、X-gal的LB板上, 放
入37℃恒温培养12~16 h。次日，进行菌落计数，计
算滴度和重组率，重组率=(菌落总数-蓝斑数)/菌落
总数。剩余的菌液倒入1.5 mL离心管中，用酒精干
冰冻20 min，置-80℃备用。
插入片段大小检测 从培养的LB平板上随
机挑取30个菌落(含5个蓝斑)，进行菌落PCR，上下
游引物分别为M13R (5′-GGAAACAGCTATGACC-
ATG-3′)和M13F (5′-GTAAAACGACGCCAGT-3′)，反
应体系25 µL，Taq DNA聚合酶1 U，RNase A
(10 mg mL
–1
)为0.2 µL，热启动PCR反应程序为:
95℃预变性3 min；然后95℃12 s，58℃30 s，68℃
3 min，共30个循环；最后68℃10 min。取5 µL PCR
产物进行电泳检测。
文库测序与EST分析 用高压过的牙签在文
库中随机挑取500个含插入片段的克隆，放置于每孔
装有80 µL 15%甘油的frozen medium的384孔板，以
M13R为引物，委托上海MAP生物技术有限公司进行
测序。对序列(EST)进行BLAST (http://blast.ncbi.nlm.
nih.gov/Blast)，运用Phred程序和Cross-Match软件去
除载体序列和移码突变序列；用WEGO (http://
wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego)进行功能分类，计
算文库的重复率和全长率。

2 结果和分析

2.1 总 RNA 提取
紫外分光光度法测得夜香树花朵总RNA浓度
约1.5 µg µL–1，OD260/OD280值为1.9，说明其产量和
纯度高、无杂质污染。图1可见28S rRNA和18S
rRNA两条带清晰，亮度比约为2꞉1。图2可见逆转录
产物弥散分布范围较广，说明高丰度的RNA的逆转
录效率较高，弥散有出现亮带，说明RNA比较完整，
没有出现降解，能满足后续建库要求。

2.2 双链 cDNA 合成
反转录的 cDNA 第一链经 LA-PCR 扩增，其产
物呈弥散状(图 3, 4)，大小范围 500~3000 bp，弥散
分布不均匀，高丰度的 cDNA 优先扩增，结果使弥
散中间出现亮带，因此，不同丰度弥散的 cDNA 均
能得到有效扩增。

2.3 DSN 均一化处理
以CK、1/4 U、1/2U DSN酶处理的产物为模板，
经LA-PCR扩增获得均一化全长cDNA (图5)。12次
循环时，对照的扩增产物弥散亮度较高、分布不均，
中间有亮带，说明cDNA未被均一化，高丰度基因
cDNA优先扩增；1/4U处理的扩增产物弥散亮度低，
量少，说明循环次数不够；15次循环时，对照的扩
增产物弥散亮度增强，量增多，向点样孔方向出现
拖尾，说明循环次数过多，1/4U、1/2U处理的扩增
产物弥散亮度都增强但仍不够，说明循环次数不
够；17次循环时，1/4U处理的扩增产物弥散亮度足
够，顶部较平，在0.5~3 kb间分布均匀，无亮带, 未
出现拖尾的迹象，说明DSN活性较合适，均一化效
果较好，1/2U处理的扩增产物很少且弥散很弱，说
明DSN浓度太高。因此，最佳DSN处理活性为1/4U，
LA-PCR扩增的最佳循环次数为17。

2.4 电转化
取2 µL未脱盐连接产物进行电转化，从1500 µL
转化产物中取3 µL涂板，长出28个菌落，其中蓝斑
44 热带亚热带植物学报 第 24 卷



图 4 第二轮 LA-PCR 电泳图。M: DL12216 bp Marker。
Fig. 4 The second round of LA-PCR. M: DL12216 bp Marker.

图 3 6 次循环的 LA-PCR 电泳图。M: DL12216 bp Marker。
Fig. 3 LA-PCR with 6 cycles. M: DL12216 bp Marker.

图 2 夜香树花朵逆转录电泳图。M: DL12216 bp Marker; 1: 夜
香树花。
Fig. 2 Result of the reverse transcriptase. M: DL12216 bp Marker;
1: Flowers of Cestrum nocturnum.

图 1 总 RNA 电泳图。M: DL2000 bp Marker。
Fig. 1 Electrophoresis of total RNA. M: DL2000 bp Marker.
图 5 夜香树花朵均一化 cDNA 电泳检测。M: DL15000 bp Marker; CK: 对照, 12 次循环; 1: 1/4U DSN, 12 次循环; 2: 对照, 15 次循环; 3: 1/4U DSN,
15 次循环; 4: 1/2U DSN, 15 次循环; 5: 对照, 17 次循环; 6: 1/4U DSN, 17 次循环; 7: 1/2 U DSN, 17 次循环。
Fig. 5 Detection of normalized cDNA from Cestrum nocturnum flowers. M: DL15000 bp Marker; CK: Control, 12 cycles; 1: 1/4U DSN, 12 cycles; 2:
Control, 15 cycles; 3: 1/4U DSN, 15 cycles; 4: 1/2U DSN, 15 cycles; 5: Control, 17 cycles; 6: 1/4U DSN, 17 cycles; 7: 1/2U DSN, 17 cycles.
2000 bp
1000 bp
M 1
12216 bp

4072 bp
3054 bp
2036 bp

1018 bp

506 bp
M 1
M 1
M 1
12216 bp

4072 bp
3054 bp
2036 bp

1018 bp

506 bp
5000 bp
2500 bp

1000 bp

250 bp
M CK 1 2 3 4 5 6 7 M

12216 bp

4072 bp
3054 bp
2036 bp

1018 bp

506 bp
28S
18S


第 1 期 郑鸿昌等：夜香树均一化全长 cDNA 文库的构建及 EST 分析 45

1个，重组率为96%，按每次14000个菌落转化，推
算出转化效率为7000个菌落 µL–1连接产物；取4 µL
连接产物脱盐并电转化，从1500 µL转化产物中取
1 µL稀释100倍，取3 µL菌液涂板，长出328个菌落，
其中蓝斑7个，重组率为98%，按每次1.64×107个菌
落转化，推算出转化效率为4.1×106个菌落 µL–1连
接产物。可见，脱盐处理使转化效率提高了585倍。
2.5 插入片段大小检测
菌落 PCR 验证结果见图 6，除第 9 泳道空载
外，其余克隆均有插入片段，大小为 0.5~3 kb, 平
均为 1.6 kb 菌落 PCR 验证结果见图 6，除第 9 泳
道空载外，其余克。同时观察到蓝斑也有插入片
段的现象，这与常规蓝白斑筛选结果相悖，具体
原因还有待研究。
图 6 均一化全长 cDNA 文库插入片段大小检测。M: DL12216 bp Marker；1~25: 白斑; 26~30:蓝斑。
Fig. 6 Detection of insert size in normalized cDNA library. M: DL12216 bp Marker; 1-25: White colonies; 26-30: Blue colonies.

2.6 EST 分析与功能注释
随机挑取 500 个单克隆(含 50 个蓝斑)测序，用
Phrap 软件拼接，发现 36 条发生移码突变，占 7.2%；
有效 EST 序列 464 条，占 92.8%，蓝斑也有 EST
插入片段。
重叠群分析结果表明，单一序列为426条，其
中26个片段重叠群占5.6%；400个单基因占94.4%，
冗余率8.1%；NCBI-BLAST比对结果表明，257条
EST序列有显著同源性，且都能通读，说明cDNA
插入片段均为全长，因此全长率为60.3%；未知143
条，占33.6%。
氨基酸同源性比对结果表明，在所测序的 ESTs
编码的氨基酸序列中，与花香形成、生物钟相关蛋
白有 27 个，占 6.3%。与花香形成相关的蛋白包括
醛/酮还原酶家族蛋白、醛糖异构酶家族蛋白、胺氧
化酶、NAC、MYB 和谷氨酰半胱氨酸合成酶等，
与生物钟相关的蛋白有 CDF3 (单车自由度因子 3)，
其中转录因子有 NAC、MYB 等。
将257条ESTs编码的蛋白进行WEGO功能分类
(图7)，大致可分为3大类：(1) 细胞组成, 细胞167
条、细胞器116条、细胞部分167条。 (2) 分子功能,
催化活性126条、结合108条。(3) 生物过程, 代谢过
程145条、细胞过程144条，参与色素形成有46条, 占
16.3%；外界刺激应答有67条，占26.1%；生物调节
有49条，占19.1%；节律过程1条，占0.4%；生殖过
程15条，占5.8%。从表1可知，此次EST测序比对发
现了一些与夜香树开花相关的结构基因和转录因
子基因，分别为花香代谢相关基因、转录因子、生
物钟基因和钙离子结合基因。

3 结论和讨论

本研究构建的文库，未脱盐连接产物的转化效
率为7000个菌落 µL–1连接产物，脱盐后为4.1×
10
6个菌落 µL–1连接产物，提高了585倍，平均插入
片段大小为1.6 kb，冗余率为8.1%，可用于大规模
转录组测序，从而进行更深层次的研究；测序500
个单克隆，其中拼接的426条为有效基因，38条被
组装成26个重叠群，冗余率仅为8.1%；其中257个
为已知基因，插入片段均为全长，占60.3%；143个
为未知基因，占33.6%。这说明DSN均一化处理能
有效降低高丰度基因的频率，提高低丰度基因的频
率，特别是一些稀有表达基因的频率，这部分基因
往往都是功能未知的基因，如夜香树花香相关的转
录因子MYB，蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)和拟南
芥(Arabidopsis thaliana)中已有报道[16–17]；生物钟相
关的基因CDF3等，为新基因的发现及其功能验证
提供有力支持。
全长均一化cDNA文库质量受RNA质量、逆转
录效率、LA-PCR扩增效率、PCR产物分级与回收
3054 bp
2036 bp
1018 bp

500 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 M
46 热带亚热带植物学报 第 24 卷

图7 Unigenes GO功能分类
Fig. 7 Gene ontology (GO) functional assignment for the unigenes

表 1 部分 EST 序列的功能注释及与 GenBank 中同源比对
Table 1 Function annotation of partial EST sequences and homologous comparison from GenBank
序号
No.
长度 (bp)
Length
功能注释
Function annotation
同源性
Homology (%)
E
YLX-307 1244 1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶 1-Aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase 70 3.00E-91
YLX-43 1248 糖基转移酶家族蛋白 47
Glycosyltransferase family protein 47
68 3.00E-66
YLXIIC-M17 1173 谷氨酰半胱氨酸合成酶 γ-Glutamylcysteine synthetase 79 1.00E-121
YLX-427 1116 热休克蛋白 60 Heat shock protein 60 80 0
YLX-374 1208 赖氨酸-酮戊二酸还原酶/ Saccharopine 脱氢酶的双功能酶 Lysine-ketoglutarate
reductase/Saccharopine dehydrogenase bifunctional enzyme
68 6.00E-37
YLXIC-D19 1031 MYB 家族转录因子 MYB family transcription factor 80 5.00E-62
YLX-38 1259 NAC2 转录因子 NAC2 transcription factor 69 2.00E-49
YLXIIC-M13 1190 钙调蛋白结合蛋白 Calmodulin-binding protein 72 1.00E-76
YLXIIC-G7 962 半胱氨酸型内肽酶 Cysteine-type endopeptidase 76 1.00E-88
YLX-93 1172 单车自由度因子 3，转录因子 CDF3 (CYCLING DOF FACTOR 3) 77 3.00E-40
YLX-245 647 exocyst 家族蛋白亚基 ATEXO70A1 Exocyst subunit EXO70 family protein A1 78 2.00E-65
YLX-62 1220 苯甲酸合成酶 Anthranilate synthetase 72 2.00E-119
YLXIC-E1 1249 4-香豆酸辅酶 A 连接酶 4-Coumarate: Coenzyme A Ligase 76 1.00E-40
YLX-54 1231 拟南芥 NAC 结构域蛋白 42 Arabidopsis N-acetylcysteine regulatory domain protein 42 75 4.00E-52
YLX-253 1260 醛/酮还原酶家族蛋白 Aldo/Keto reductase family protein 71 4.00E-122
基
因
数

N
u
m
b
er
o
f
g
en
es

细胞组成
Cellular component
分子功能
Molecular function
生物过程
Biological process
基
因
比
例

P
er
ce
n
t
o
f
g
en
es

100

10

1

0.1

0.01
257

2

0

WEGO output
第 1 期 郑鸿昌等：夜香树均一化全长 cDNA 文库的构建及 EST 分析 47


效率、DSN 酶处理、转化效率和重复率等因素的影
响，本试验均进行了改进。
总RNA质量的提升 夜香树花朵中多糖含
量较高，其理化性质与RNA相似，提取时会和RNA
共沉淀，抑制多种酶活性[18]，不利于后续试验。高
盐法[18]能有效去除多糖，已成功用于侧柏(Platycladus
orientalis)
[19]、葡萄风信子(Muscari botryoides)[20]和
玉米(Zea mays)[21]胚乳等多糖植物和组织RNA的提
取。本研究采用改进Trizol法，在RNA异丙醇沉淀
过程中加入5 mol L–1 NaCl有效去除了多糖，提取的
RNA经紫外分光光度计检测，纯度高、无污染，能
满足后续试验要求。
逆转录反应效率的提升 通过将逆转录引
物进行改良，提升了逆转录酶的识别效率；反转录
过程通过改良 SMART 技术，使用两步法进行逆转
录反应，使得第一轮未反应完全的模板完成逆转
录，未达到帽子端的 cDNA 继续向帽子端延伸，提
升了全长 cDNA 的比率；Mn2+能提高末端转移酶的
活性[22]，第二轮逆转录反应中加入的 MnCl2，可以
使逆转录酶作用效率更高；BSA 可以保护逆转录
酶，阻止一些物质与酶的作用，从而保持酶的活性，
减少使用量[23]。这一改进大大提高了全长 cDNA 第
一链的比例。
LA-PCR扩增效率的提升 LA-PCR扩增片
段的大小和扩增效率的高低主要取决于引物设计。
Piao等[13]和Dai等[15]采用接头介导的LA-PCR法扩
增长片段cDNA，并从动力学角度分析引物长短和接
头种类对PCR扩增片段大小的影响。Piao等[13]报道,
在LL-SceI接头中，长引物(SceI-L): 5′-GTC-ATCTAT-
GTCGGGTGCGGAGAAAGAGGTAATCC-3′只能扩
增小片段；短引物(SceI-S): 5′-GTCATCT-ATGTCG-
GGTG-3′只能扩增大片段；在LL-Ceu I接头中，长
引物(Ceu I-L): 5′-GTGTAATCTATAACGGTCCTA-
AGGTAGCGAC-3′和短引物(Ceu I-S):5′-GTGTAA-
CTATAACGGTCCTA-3′的扩增结果与LL-Sce I接
头的扩增结果相同，不过扩增片段小于LL-SceI接头
引物。Dai等[14–15]采用相似的方法筛选接头引物,
认为P1 (5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)有
利于长片段cDNA的扩增。但二者的研究都存在问
题：Piao等所用的接头，其酶切位点在植物基因中
极少，且两种酶的酶切效率低下；Dai所用的接头,
其酶切位点在植物基因中虽存在，但会在克隆中损
失部分基因，接头与双链cDNA的连接效率低下,
大大影响文库构建的效率。Piao等[13]更换了接头中
的酶切位点，但扩增结果未变，说明接头引物扩增
效率与接头中的酶切位点无关。
本试验将Dai等的P1引物、Piao等的SceI-S (P2)、
Sfi I A位点串联起来构成6次循环的5′端长引物；将
Dai等的P1引物、Piao等的SceI-S (P2)、Sfi I B位点、
Oligo(dT)串联起来构成6次循环的3′端长引物；通过
LA-PCR扩增，将接头序列引入双链cDNA两端，克
服了接头连接效率低下的问题；最后利用Dai等[15]
的P1引物进行LA-PCR，既有效扩增了长片段
cDNA，抑制了假阳性片段的扩增，又保证了cDNA
的扩增长度，满足了定向克隆的需求，使得cDNA
全长序列的比例得到提高。
PCR产物的处理 通过琼脂糖凝胶电泳、凝
胶回收，可有效去除PCR产物中的酶、离子、dNTP，
控制cDNA片段的大小，使获得的产物纯度更高;
通过半透膜回收能高效获得目的cDNA分子，避免
了使用试剂盒中葡聚糖柱分离造成的长片段cDNA
分子损失问题，提高了回收效果且保证了克隆效率。
均一化全长cDNA的获得 得到全长cDNA
后，通过先杂交后消化，降解了双链cDNA，增加
了低丰度cDNA分子的比例，使得高丰度和低丰度
cDNA分子的比例降低，从而使所有基因的频率都
达到一个平均水平；以DSN处理的产物为模板 ,
以Piao等[13]的Sce I-S (P2)为引物，通过抑制LA-PCR
扩增长片段的cDNA分子，确保扩增产物呈现均匀
弥散且没有亮带。此外，这样处理还避免测序中出
现重复克隆。
转化效率的提升 研究表明，连接产物中的
T4 DNA连接酶、离子和其它有机化合物会显著降
低电转化效率，但具体原因还没有定论。包其郁
等[24]将pUC18质粒分别用水和1×T4 DNA连接酶缓
冲液溶解，然后进行电转化，结果以水为溶剂的比
以1×T4 DNA连接酶缓冲液为溶剂的转化效率要高
10~100倍以上；王福利等[25]以未灭活的和灭活处理
的连接产物分别进行电转化，结果前者的转化效率
为4.4×106，后者为4.8×107，相差10倍。因此推测，
连接产物中T4 DNA连接酶的活性是导致电转化效
率低的主要原因。
本试验通过对连接产物进行脱盐处理、增加转
化产物的培养体积等，使得转化效率得到大幅提高。
脱盐处理后，电转化效率比未脱盐的提高了585倍之
多；使用选择性杂交膜在脱盐缓冲液中长时间透
析，有效去除连接产物中的离子和T4 DNA连接酶，
纯化了产物；低温真空浓缩能够获得纯净的重组质
48 热带亚热带植物学报 第 24 卷

粒DNA分子，大幅提高转化效率。此外，本试验还
采用15 mL离心管代替传统的1.5 mL离心管摇菌,
能够提供足够氧气，促进已转化大肠杆菌的生长,
进而提高转化效率。

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