全 文 ：热带亚热带植物学报 2003，1 l(2)：177-180
Jounu／of Tropical and Subtropical Botany
中国水仙与欧洲水仙品种 RAPD指纹的研究
陈林姣 田惠桥 武 剑
(厦门大学生命科学学院，福建 厦门 361005)
摘要 ：利用随机 多态性 DNA(RAPD)技术对中国水仙和欧洲红 口水仙共 6个品种进行了分析 。选用了 l2个 10bp弓l
物共扩增出 I 19条 DNA片段。计算各样本间的相似性系数和遗传距离，并采用 UPGMA法对遗传距离进行了聚类分
析。结果表明：中国水仙 3个品种亲缘关系十分密切，红口水仙 3个品种亲缘关系较近，而 中国水仙与红 口水仙 3个 品
种间的亲缘关系较远。建立的水仙 RAPD技术体系可帮助育种亲本 的选配及水仙品种的鉴定。
关键词 ：水仙；RAPD；遗传多样性
中图分类号 ：Q949．718．250．3 文献标识码 ：A 文章编号 ：1005-3395(2003)O2．JD177—04
The Study OH RAPD Fingerprints of Narcissus in China and Europe
CFIEN Lin．j iao TIAN Hui-qiao WU J ian
(School of Sciences，Xiamen Univers ，Xiamen 361005，China)
Abstract：Three cultivars ofNarcissus tazetta vat．chinensis and three cultivars of』v．poeticus have been studied
by RAPD (randomly amplified polymorphic DNA)．Twelve 10-bp arbitrary primers were screened and 119 DNA
bands were am plified，am ong which 84．86％ were polymorphic． Genetic similarities were calculated using simple
matching coefficient，andthe phenogram WaS constructed by usingUPGMA method．Three eultivars ofN．tazetta
vat．chinensis were very closely related，while the three cultivars ofN．poeticus were clustered together，indicating
that there is a distance in relationship between the first three an d the latters． It is suggested that molecular marker
techniqueishelpfulforthebreeding andvarietyidentificationofNarcissus．
Key words： Narcissus；RAPD；Genetic diversity
水仙为石蒜科水仙属 Narcissus植物，约有 40
个 原 生种 ，大 多 数 原产 于地 中海 沿岸 及 欧洲 中
部【】，21，我国仅产 中国水仙 1个变种。水仙花是著名
花卉，具有悠久的栽培历史。据英 国皇家园艺学会
统计，现约有 1万 多个园艺品种，并将其分为十一
大类：喇叭水仙、大杯水仙、小杯水仙 、重瓣水仙、仙
客来水仙 、西班牙水仙 、丁香水仙、多花水仙 、红 口
水仙、原种野生水仙和其它杂种水仙。
中国水仙属于多花水仙类，目前主要有 “金盏
银台”、“玉玲珑 ”、“金三角”三个品种 ，以水仙花
球大、花多、味香而驰名中外口1。然而，数百年来中国
水仙品种稀少，传统的选育方法培育新品种 困难 。
并且，由于长期的无性繁殖 ，中国水仙存在着品种
收稿日期 ：2002-07-22 接受日期：2002-11-04
基金项 目：福建省 自然科学基金 (B0010001)资助
退化、品质下降等 问题 ，严重制约 了这一花卉 的生
产 和 发 展 嗍。为此，本研究以中国水仙 (Narcissus
tazetaL．Var．chinensis Roem．)和欧洲红 口水仙(Ⅳ．
poeticus L．)共 6个 品种为材料 ，通过 RAPD标记分
析它们的遗传多样性和亲缘距离，以便为采用现代
生物工程新技术将 国外水仙优 良的种质引入 中国
水仙、选育新品种提供指导。
1材料和方法
材料 中国水仙 (Narcissus tazeta L．Var．
chinensis Roem．)“金盏银 台 ”、“玉玲 珑 ”、“金三
角”3个品种来源于主产地漳州，欧洲红 口水仙 (Ⅳ．
poeticus L．)“花唱片”、“冰花 ”、“拉丝维加斯 ”3
个品种来 自于荷兰 。用鳞茎水培 ，每个分类群各取
l0个单株植物幼叶混合，提取 DNA。
维普资讯 http://www.cqvip.com
热 带亚热带植物 学报 第 11卷
DNA的提取与纯化 采用丙酮醋酸钾法嘲
提取 DNA；去 RNA后用 24：l的氯仿 -异戊醇抽提
2次，最后溶于 TE中。在 BECKMAN DU640核酸蛋
白分析仪上测定 DNA的纯度和浓度，通过琼脂糖 电
泳检测 DNA的完整性，-20~C保存备用．
DNA扩增 扩增反应在德 国 Biometra UNO
II PCR仪 上 进行 。反 应体 积 25 1，包 含 2：5 1
10~bufer， 2．0 mmollL M gC12， 0．2 mmol／L dNTPs，
1．Oiamol／~Dl物 (以上试剂皆购 自Sangon公司)，0．6
单位的Tag酶 (华美公司)，60tag DNA模板。每次
扩增反应设置不含DNA模板的空白对照。扩增程序
为 ：94℃ 4 rain。预变 性 ，94℃ 15 S，42℃ 30 S，72~C
75 S，45个循环：最后 72℃延伸 7 rain。RAPD产物
经 1-．，AO ／o琼脂糖 电泳 ，以 DNA]EcoR I+HindII
(Sangon公司)作为相对分子量标记。EB染色，于
紫外灯下观察照相 。在 电泳图谱上同一 RAPD位点
有带者记为 l，缺乏记为 0。强带和弱带的赋值均为
l，仅仅那些可重复的带才被记录。
数据分析 任意两样 品间的相似性系数计
算公式为： (口+ +6 +d)，式中：5 为单匹配
系数：a为2个样本均为I的条带总数；b、C为2个
样本分别为 1或0的条带总数：d为2个样本均为
0的条带总数。两样本间的遗传距离 (D)根据以下
公式计算： l— F=2a／(2口+6+c)采用 TuTl八l~JMA
法对遗传距离进行聚类分析，构建亲缘树系图。
2结果
我们从 8O个 l0个核苷酸长的随机引物筛选出
的 l2个重复性较好的引物对 6个样本进行 DNA
扩增。所用引物及检测结果见表 l。 每个引物产生
4一l5条带，共检出 ll9个位点，其中 101位点表现
多态性 ，占总数的 84．86％。图 l示部分随机弓l物扩
增所得 DNA指纹图谱。计算 6个品种间的相似性
系数和遗传距离 (表 2)，采用 切 ( M 法对遗传距
离进行聚类分析，构建树系图 (图 2)。
3分析和讨论
3．i水仙的遗传多样性
本文首次对 中国和 国外 的 6个水仙品种进行
了 RAPD指纹研究，由表 2和 图 2可知，中国水仙
三个品种彼此间相似性系数高达 0．8235-0．916，最
小遗传距离为 0．0714，表明中国水仙 3个品种亲缘
关系十分密切 ，各品种 的遗传背景基本一致 ，多样
性水平颇低 。这与前人的细胞学研究[61、同工酶研
究[71结果相吻合。红口水仙 3个品种彼此间相似性
系数分布在 0．747-0；8992之间，亲缘关系较近。红
口水仙 3个品种在外部形态特征上与中国水仙有
着明显差异，其花单朵，花大，花被白色，副冠黄色，
味淡；而中国水仙一支花葶上有花 3-14朵，花小 ，
有浓郁香味。中国水仙与国外的 3个水仙 品种在
DNA水平上亦表现出较大差异，R_APD扩增所获得
裹 1 引物、矗基序列豆扩增结果
Tablel The∞ I Iccsof12 random primersand
theiramplification results
表2 6个样本闻单匾鼋福似性系数(左下部 l和遗传距离(右上部 l
Table2 Th e singlematchingsimilaritycoeficients(below thediagon~)and
ge ads．a．nees(abovethe出越：on )betwe~aanytwotaxa
点
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 2期 陈林姣等：中国水仙与欧洲水仙 品种 RAPD指纹的研究
2 3 M 4 5 6 2 3 M 4 5 6 1 2 3 M 4 5 6
图 l随机引物 $48(A)，$287(B)，S154(c)，$295(D)，$70(E)，$68(F)的扩增产物
Fig．1 Amplifcationproductsofprimer$48(A)，$287(B)，S|54(c)，$295(D)，s7o(E)，$68(F)
l_6为样品编号，M．分子量标准 ( DNA／EcoR I+I-IindlI)，分子量依次为 21226、5148、2000、1584、1375、947、831bp。
kmes l一6 arenumbersfor samples as showninTable 2；M：Molecularweight standard ( DNA／E~RI+Hind 1I)；MW
are 21226，5148，2000，1584，1375，94 7，and 831 bp，respective ．
0．7 0．6 0．5 0．4 0．3 0．2 0．1 0
图 2 用遗传距离产生的聚类分析树状图 (UPGMA)
Fig．2 Dendroxgram generatedusingUPGMA algorithm to
dustergeneticdistances
l_6为样品编号。LRI~ 1 to 6 arenumbersfor samples
8S showninTable2．
的多态性带 占总数 的 84．86％，其相似性 系数在
0．3 109-0．4538之间，遗传距离在 0．5462-0．6508之
间，表明它们的亲缘关系较远。
3．2 利用 RAPD技术进行水仙新品种选育与品种
亲缘鉴定
RAPD技术自1990年创立以来，以其快速、简
便、高效等优点在植物遗传多样性研究、分子标记
辅助育种、种质鉴定、植物系统分类等方面得到了
广泛应用 1】。在育种工作中，育种材料亲缘关系过
分单一，常常造成育种工作难 以取得突破 ；亲缘关
系太远，杂交不亲和性难 以克服而导致育种失败[1习。
采用 RAPD技术分析育种材料间的亲缘关系，有助
于选择适宜的亲本以提高育种效率。中国水仙各品
种 间遗传多样性水平很低，表明该物种进化过程中
基因突变频率低；并且 ，中国水仙为同源三倍体，自
然情况下很难通过有性生殖过程 同其它物种进行
杂交获得新基因。这可能是中国水仙数百年来少有
创新的内在原因。只有采用现代生物新技术将其它
种质引入中国水仙才有可能取得大的突破 。如 ：将
控制花色的基因转入中国水仙、与欧洲水仙进行体
细胞杂交等，可望获得花色丰富、花朵大的水仙花
新品种，本实验室 目前正在开展这方面的工作。另
一 方面，通过 RAPD标记 ，可以获得各样本的特征
谱带 ，如引物 $295(图 1D)扩增 出的约 900bp片
断为中国水仙所具有，红口水仙 3个品种没有 ；扩
增出的约 750bp片断为红口水仙的 3个品种所具
有，而中国水仙 3个品种没有 。根据亲本、远缘杂种
或体细胞杂种的指纹图谱，可以有效鉴定杂种的真
实性 ；也可 以通过建立品种 (组合)的 RAPD指纹
档案，用来鉴定品种纯度。此外，水仙由于长期的栽
1 2 3 4 S 6
维普资讯 http://www.cqvip.com
180 热带亚热 带植物 学报 第 11卷
培与人工选育，加上常常发生 自然杂交和多倍化 ，
以致于水仙属属下分类困难 ，种的数量至今没有统
一 的界限，其亲缘关系更是知之甚少[1】。采用 RAPD
技术对水仙属植物进行分析，不仅可以探讨水仙属
下各分类群的亲缘演化关系，检测种 内的遗传分
化 ，而且还可 以为属、种的分类提供强有力的证据。
本研究所建立的水仙 RAPD技术体系将为水仙种
质鉴定及系统分类等研究提供一种有效的方法和
基础 。
参考文献
【l】HeIdi E M，Juan A，Gunnar B，et a1．Intempecifc variation in
floralfragranceswitlfinthe genusNarcissus (Amarylidaceae)[J]．
Bioehem System Eeol，1997，25(8)：685-706．
【2】WorleyAC，BakerAM ，Thompson J et a1．Floral displayin
Narcissus：variation in flower size and number at the species，
population and individual level【J】．Inter J PI Sei，2000，161：69-79．
【3】GuoW C(郭文场 )，Yang B M (杨柏明)．ZhangzhouNarcusus
【J】．Spec Econ Anita PI(特种经济动植物)，1999，2(1)：39-40．
(in Chinese)
【4】LinHX(林含新)，Lin QY (林妾 英)，XieLH(谢联辉 )．
‘ Virus ofNarcissus andits research progress 【J】． Plant Quam nt
(植物检疫)，1996，10(4)：227-229．(in Chinese)．
【5】Shi SH(施苏华)，ZhangQ(章群)，ChertYQ(陈月琴)，eta1．
A simple method for iso lation of total RNA and DNA from
silicagel·矾ed and fresh leaves ofplantsIJ】．Acts Sei Natur Univ
Sun(中山大学学报)，1996，35(2)：103-105．(inChinese)
【6】Zhuang W J(庄伟建 )，Lin ZL(林 治 良)，Su J w (苏金为)．
Karyotypesan dGiernsaC-bandsoftwolocal cultivarsin Nc~cissus
tazetaL．vat．chinensis Roem【J】．FujianJ Agri Sci(福建农业学
报 )，1999，14(1)：51—57．(inChinese)
【7】Xu RY(许荣义 )，Ye J B(叶季波 )．Studies on peroxidaso
isozymesfromwildChineseNarcissus and cultivated species[J]．J
FujJan Agri Coil(福建农学院学报 )，1993，22(1)：126-128．(in
Chinese)
【8】JiaJH(贾建航)，WangP(王萍)，JinDM (金德敏)，cta1．
application of RAPD markers in diversity detection an d variety
identifcationofporphyra【J】．AetaBot Sin (植物学报)，2000，42
(4)：403-407．(inChinese)
【9】Luo S L(罗素兰 )，Huo PC(贺普超 )，Zheng X Q(郑学勤 )，
et a1．Genetic diversity in wild grapes native to Chinabasedon
randomly amplifiedpolymorphicDNA(ILkPD)analysis【J】．Aeta
Bot Sin(植物学报 )，2ool，43(2)：158-163．(in Chinese)
【i0]Liu xL(刘雄 伦)，Lix(李恂)．Application ofRAPDinplant
geneticsandbreeding【J】．ProgBiolEngin (生物工程进展)，
2000，20(5)：21—24(inChinese)
【11】Jie X M (解新 明)．Application of RAPD in plant systematic
evolution【J】．Bul Biol(生物学通报)，2000，35(4)：l1-13．(in
Chinese)
【12】 Brandham P．Principles and problems in Narcissus hybridization
【J]．Royal Hort Soc，1994，5：37-41．
维普资讯 http://www.cqvip.com