全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (7): 925~930　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0055 925
收稿 2014-02-11　　修定 2014-05-28
资助 国家自然科学基金 (91317312)、教育部博士点基金
(20094407110004)、国家级大学生创新创业训练计划项目
(201210574055)和华南师范大学学生课外科研一般课题立
项(13SKGB03)。
* 通讯作者(E-mail: liling@scnu.edu.cn; Tel: 020-85211378)。
过表达AhAREB1影响GA代谢调控拟南芥的株型
李健湄1, 李逸豪1, 林莹莹1, 黄志刚2, 李玲1,*
1华南师范大学生命科学学院, 广东省植物发育工程重点实验室, 广州510631; 2湖南农业大学植物激素与生长发育湖南省重
点实验室, 长沙410128
摘要: 与野生型相比, 过表达AhAREB1的拟南芥植株茎节间的生长受抑制, 花序轴短和分枝数多。普遍认为植株的矮化可
能与植物体内促进生长的激素作用的异常有关。本文测定了过表达AhAREB1植株体内激素GA3、IAA和ABA含量, 并通过
外施ABA、IAA和GA3观察植株表型变化及检测相关基因表达, 研究AhAREB1在植物株型方面的作用。结果表明, 与野生
型植株相比, 过表达AhAREB1拟南芥植株内源ABA、IAA和GA含量均升高, 外施GA3可使植株的表型恢复至野生型水平,
推测AhAREB1通过影响GA代谢失活及降低其生理活性水平而引起株型矮化。
关键词: AhAREB1; 拟南芥植株; 矮化; GA代谢; 基因表达
Overexpression of AhAREB1 Affected Plant Type of Arabidopsis Regulated by
GA Metabolism
LI Jian-Mei1, LI Yi-Hao1, LIN Ying-Ying1, HUANG Zhi-Gang2, LI Ling1,*
1Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, College of Life Sciences, South China Normal
University, Guangzhou 510631, China; 2Hunan Provincial Key Laboratory of Phytohormones and Growth Development, Hunan
Agricultural University, Changsha 410128, China
Abstract: Compared with wild-type, overexpression of AhAREB1 in Arabidopsis caused the dwarfing plant
with inhibiting internode growth, shortening rachis and growing more branches. It’s generally believed that the
dwarfing plant is caused by abnormal metabolism and effect of endogenous phytohormone. Hence, in order to
recognize the role of AhAREB1 in regulating the plant type, our study assayed the endogenous phytohormone of
over expression AhAREB1 plant. Meanwhile, we observed the phenotype of the plant after spraying exogenous
ABA, IAA and GA3, tested relevant genes. The results showed that the contents of ABA, IAA and GA were
increased in overexpressions of AhAREB1 transgenic Arabidopsis and the phenotype could be restored to wild-
type level after spraying GA3. We presumed that the dwarfing plants may caused by the inactivation of GA
metabolism and low-level physiological activity of GA affected by AhAREB1.
Key words: AhAREB1; Arabidopsis plant; dwarfing; GA metabolism; gene expression
研究报道植株的株型与赤霉素(gibberellin,
GA)缺陷(Shun等2008; Griffiths 等2006)、脱落酸
(abscisic acid, ABA)代谢(Hong等2005; Yamamuro
等2002)及生长素(indole-3-acetic acid, IAA)的极性
运输(Dai等2006)有关。GA的种类众多, 其合成反
应中, GA20ox和GA3ox具有促进GA转化成有生物
活性的GA种类, GA2ox则通过β-羟基化作用将活
性GA转化成无活性GA种类(Hedden和Kamiya
1997)。
ABA响应元件结合蛋白(ABA responsive
element binding protein, AREB), 与ABRE顺式作用
元件特异性结合, 激活ABA下游基因的表达。转
录因子参与激素信号网络调控, 调节植物生长发
育与胁迫反应(胡鹏伟等2013; Ji等2013)。课题组
前期研究从耐旱花生品种‘粤油7号’中克隆得到
AhAREB1基因 , 该基因属于碱性亮氨酸拉链类
( b Z I P )转录因子 , A B A处理和干旱胁迫诱导
AhAREB1基因表达异源表达AREB的拟南芥植株
提高了对ABA的敏感性及对干旱的耐受(Hong等
2013)。我们发现AhAREB1转基因拟南芥株系中表
植物生理学报926
达量较高的植株出现矮化、花序轴短和分枝数多
(Li等2013)。本文以2个AhAREB1表达量不同的株
系为实验材料, 通过分析内源植物激素水平和外
施植物生长调节物质观察植株表型恢复程度, 探
讨AhAREB1基因引起株高变化的原因, 为深入研
究AhAREB1基因的功能提供依据。
材料与方法
1 植物材料与培养
野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana L.) Was-
sileskija (WS)、过表达AhAREB1转基因株系3-8和
2-2由广东省植物发育工程重点实验室保存。
将野生型拟南芥WS、转基因拟南芥株系2-2
和3-8的种子消毒后, 置于1/2MS培养基上, 春化2 d
后, 于光照培养箱环境培养5 d左右, 将幼苗移至土
中培养, 温度20~22 ℃, 湿度70%, 长日照条件(光
照16 h, 黑暗8 h, 光照强度220 μmol·m-2·s-1)培养
4周。
2 方法
2.1 植物生长调节物质处理及株高等表型测定
挑选培养4周生长状况一致的WS、2-2和3-8
植株, 土培, 分别喷施等量1 μmol·L-1 GA3 (上海生
工公司产品)、1 μmol·L-1 IAA (上海生工公司产品)
和10 μmol·L-1 ABA (上海生工公司产品), 以ddH2O
对照, 隔天重复喷施1次, 2周后测定株系株高、花
序轴长度与分支数。
2.2 内源激素含量测定
取已培养4周的拟南芥WS、2-2和3-8植株, 进
行植物激素的提取及HPLC测定。准确称取新鲜
样品1 g左右, 加入预冷的80%甲醇10 mL, 在弱光
下冰浴中研磨成匀浆, 与4 ℃冷藏箱中浸提过夜,
倒出上清液, 残渣加入2 mL预冷的80%甲醇后漩涡
震荡2 h, 合并浸提液, 以4 000 r·min-1 (4 ℃)离心20
min, 合并得上清液进行真空冷冻离心浓缩除去
甲醇, 加入8 mL 7.7086 g·L-1醋酸铵(pH9.0)复溶,
27 000 r·min-1离心20 min, 上清液经过聚乙烯聚吡
咯烷酮(PVPP)柱和二乙基氨基乙基交联葡聚糖凝
胶(DEAE sephadex A-25)柱, 以C18 Sep-Paks小柱
(Classical, Waters公司)分别收集细胞分裂素类激
素和酸性激素, 以50% HPLC用甲醇洗脱后测定
(Yue等2012; Peng等2013)。
2.3 基因表达量检测
通过实时定量PCR检测已培养4周的拟南芥
WS、2-2和3-8植株(整株)的AhAREB1及基因
GA3ox1、GA20ox1、GA20ox2和GA2ox1的表达量,
所用引物见表1。TaKaRa公司的反转录试剂盒进
行RNA提取和cDNA合成。使用ABI公司7500荧光
定量PCR仪进行表达量检测。扩增程序为94 ℃预
变性30 s; 94 ℃变性5 s, 60 ℃退火延伸34 s, 40个循
环。采用Excel和SPSS 13.0统计软件, 所有的数据
用均数±标准差表示, 多组均数之间使用Levene统
计方法进行方差齐性检验后, 进行方差分析(ANOVA),
P<0.05表示差异有显著性。
表1 突变体基因检测引物序列
Table 1 Primers used in screening mutants
引物名称 引物序列(5→3)
AhAREB1-F GATTTCGGGTCCATGAACATGGATGA
AhAREB1-R TTTGTCTCCTCTCAACCACTTTCTC
18S-F ATTCCTAGTAAGCGCGAGTCATCAG
18S-R CAATGATCCTTCCGCAGGTTCAC
GA20ox1-F TTTCACCGGACGCTTCTCC
GA20ox1-R CGCAAAACCGGAAAGAAAGG
GA20ox2-F CGATCTCTCAAGCCAAGACTCG
GA20ox2-R TCGCTGACGCCATGATTG
GA3ox1-F TCCCGGATTCTTACAAGTGGAC
GA3ox1-R GCCGGAGGAGAAGGAGCA
GA2ox1-F CTTCGCTGGACCTTCATTGAC
GA2ox1-R ACAACCTCTCGTCCTCATTGTCT
实验结果
1 转基因拟南芥植株AhAREB1表达量与表型
利用半定量 R T - P C R检测转基因植株
AhAREB1的表达量, 以18S rRNA作为内参基因, 结
果表明, 株系3-8的AhAREB1基因表达量高于株系
2-2和野生型(图1)。过表达拟南芥的株高皆比野
生型的低, 其中AhAREB1表达量较高的3-8株高为
野生型植株30%; 与表达量较低的2-2植株相比, 植
株高度降低了63% (图2-A), 花序轴长度减短50%
(图2-B), 分支数增多25% (图2-C), 说明AhAREB1表
达量的升高影响着植株的矮化表型。
2 过表达AhAREB1植株内源激素含量及外施GA3、
IAA和ABA对植株表型的影响
与野生型相比, 过表达AhAREB1植株3-8和2-2
李健湄等: 过表达AhAREB1影响GA代谢调控拟南芥的株型 927
内源ABA、IAA及GA含量均升高, 由高到低依次
是: 3-8>2-2>WS, 其中IAA的含量变化最为明显,
图1 转基因拟南芥不同株系AhAREB1的表达
Fig.1 Expression of AhAREB1 in different
transgenic Arabidopsis plants
*代表不同株系与野生型差异显著(P<0.05)。
图2 过表达 AhAREB1拟南芥的株高、花序轴长度和分支数
Fig.2 The height, rachis length and branche number of Arabidopsis plants of overexpressing AhAREB1
*代表不同株系与野生型差异显著(P<0.05)。
图3 过表达AhAREB1拟南芥植株的IAA、ABA和GA3含量
Fig.3 The contents of IAA, ABA and GA of Arabidopsis plants of overexpressing AhAREB1
2-2和3-8植株的含量分别为WS的1.5倍和4倍; 2-2
和3-8植株的ABA含量分别是WS的1.2倍和1.5倍;
GA含量分别是WS的1.1倍和1.4倍(图3)。
分别用ABA、IAA及GA3喷施植株, 在同等的
条件下培养2周后, 检测植株的表型, 发现经GA3处
理的3-8和2-2的株高与花序轴长度恢复, 且与野生
型植株差异不显著。而经ABA及IAA处理的3-8和
2-2的株高没有恢复, 但花序轴长度缩短。经3种激
素的处理, 植株的分支数均没有受到显著影响(图4
和5), 推测过表达AhAREB1植株出现的矮化表型与
GA3含量低相关。
3 过表达AhAREB1植株GA合成及代谢相关基因
表达分析
进一步分析过表达AhAREB1植株的GA合成
与代谢关键酶基因表达, 结果(图6)发现, 过表达
AhAREB1植株GA3ox1、GA20ox2和GA20x1的表达
量在株系3-8和2-2之间无明显差异; 但代谢关键酶
植物生理学报928
GA2ox1基因的表达量存在显著差异, 由高至低依
次是: 3-8>2-2>WS, GA2ox1可促使生理活性GA转
化为非活性GA, 推测过表达植株矮化与其体内生
理活性GA降低相关。
讨　　论
矮化突变体对育种具有重要的价值, 也是研
究植物茎的生长以及激素调控的重要基因资源。
我们发现过表达AhAREB1拟南芥植株2-2和3-8具
有稳定的矮化性状, 其中表达量高的3-8植株矮化
更明显, 说明植株矮化性状可能与AhAREB1的过
表达有关。过表达AhAREB1植株内源GA含量比
野生型高, 外施GA3可使表型恢复, 推测AhAREB1
植株内源GA可能为失活性GA, 活性GA含量少, 即
矮化植株为GA缺陷型植株。过表达AhAREB1植
株内源IAA及ABA含量比野生型高, 但分别外施
I A A及A B A植株表型不能恢复 , 表明过表达
AhAREB1植株可能为IAA及ABA不敏感型植株。
已知, 在激素缺陷型突变体内活性激素的生
物合成途径被抑制或阻断, 使体内源活性激素缺
乏或痕量存在, 呈现的矮化表型经外施生长调节
剂后可恢复。激素不敏感型矮化突变体, 是激素
的信号吸收或传递出现障碍。这种矮化表型的突
变体在外施相应的生长调节剂后不能恢复野生型
表型(Clouse等1996)。有报道指出, 矮化植株中
IAA合成相关的基因超量表达, 造成体内大量IAA
的累积, 高浓度IAA抑制生长, 导致了植株矮化(王
新坤等2012)。植株中IAA累积导致GA3含量增加,
而GA3和ABA间存在拮抗作用, 也导致植株高度降
低(Russell 1956)。IAA和GA促进节间伸长生长,
表现为相互增效作用, 可促进植株生长(Frigerio等
2006)。植株中GA代谢提高, 促使生物活性GA转
变为非生物活性产物, 导致植株矮化(Carrera等
2000)。本文2个转基因AhAREB1植株株系中高浓
度ABA抑制了植株的生长, 导致植株矮化; 检测的
总GA含量可能不能代表生物活性GA含量水平。
图4 外施ABA、IAA和GA3的过表达AhAREB1植株表型恢复的观察
Fig.4 Observation of the phenotypic restoration of Arabidopsis plants of overexpressing AhAREB1
after spraying exogenous ABA, IAA and GA3
图5 ABA、IAA和GA3对过表达AhAREB1植株表型的影响
Fig.5 Effects of ABA, IAA and GA3 on the phenotype of
Arabidopsis plants of overexpressing AhAREB1
李健湄等: 过表达AhAREB1影响GA代谢调控拟南芥的株型 929
GA调节植物生长发育通过生物合成和代谢,
调控植物体内生物活性GA的水平, 影响植物生长
发育。已知GA20-氧化酶和GA3-氧化酶促进生物
活性的GA种类合成, 而GA2-氧化酶使生物活性
GA失活(Mitchum等2006)。有报道指出, 在拟南芥
和小麦中过量表达豌豆GA2ox , 导致矮化表型
(Hedden和Phillips 2000; Schomburs等2003)。在莴
苣中过量表达南瓜GA20ox, T2代矮化莴苣中, 内源
性GA1和GA4水平下降, 而GA17和GA25作为南瓜
GA20ox无生物活性的产物, 却大量在矮化莴苣体
内积累(Niki等2001)。矮化的菊花中过表达目的基
因的植株体内GA2ox7和GA失活酶的表达明显上
调, 推测目的基因可能参与了植物的GA介导的发
育过程(Tong等2009)。本研究发现GA20ox1表达
在2个转基因AhAREB1株系间无明显差异 ; 而
GA2ox1表达量都显著高于野生型植株的, 说明抑
制了生物活性C19-GA合成。高表达AhAREB1的
3-8株系GA3ox1表达低于2-2的, GA2ox1的表达量
高, 推测高表达AhAREB1限制生物活性GA合成和
促进生物活性GA失活, 导致矮化表型的程度高。
这与Patrick等(2008)的研究结果是一致的 , 但
AhAREB1调控GA相关基因表达的机制有待后续
研究。
综上所述, 过表达AhAREB1拟南芥具有矮化
的表型, 外施GA3恢复植株的表型。AhAREB1过表
达矮化的表型与GA代谢基因GA2ox1在拟南芥中
表达量升高有关, GA2ox1表达量升高, 可以促进活
性GA向非活性GA的转化, 导致植株呈现出矮化性
状。但AhAREB1过表达与IAA与ABA的关系 ,
ABA、IAA和GA的合成是否相互影响, 除GA2ox1
外其他激素的相关基因是否发挥作用, AhAREB1
调控GA相关基因表达的机制, 还有待后续研究。
图6 过表达AhAREB1拟南芥植株GA合成代谢基因的表达
Fig.6 Expression of genes involving in synthesis and metabolism of GA in
Arabidopsis plants of overexpressing AhAREB1
*代表不同株系与野生型间差异显著(P<0.05)。
植物生理学报930
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