全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (4): 359~363 359
收稿 2012-01-30　　修定 2012-02-28
资助 国家林业局948技术引进项目(2008-4-30)、云南省自然科
学基金面上项目(2009CD073)和云南省中青年学术技术带
头人后备人才培养项目(2010CI016)。
* 通讯作者(E-mail: yymbamb@163.com; Tel: 0871-5150250)。
小叶龙竹(Dendrocalamus barbatus)愈伤组织诱导及植株再生
王娟1, 毕玮1, 普晓兰1, 陈芳2, 彭桂莎1, 杨宇明2,*
1西南林业大学, 国家林业局西南生物多样性保育重点实验室, 昆明650224; 2云南省林业科学院, 昆明650201
摘要: 以小叶龙竹种子为外植体, 通过研究MS培养基中不同植物生长调节剂浓度组合对外植体愈伤组织诱导和不定芽分
化的影响以及不同配比对生根的作用, 建立了稳定的繁殖再生体系。试验结果表明愈伤组织诱导的最适培养基为MS+2,4-D
5.0 mg·L-1; 不定芽分化的最适培养基为MS+2,4-D 0.5 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1+KT 0.25 mg·L-1; 小苗的最适生根培养基为
1/2MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.4 mg·L-1。建立的繁殖再生体系将为进一步利用分子生物学技术对竹类植
物进行遗传改良奠定基础。
关键词: 小叶龙竹; 愈伤组织诱导; 植株再生
Callus Induction and Plantlet Regeneration of Dendrocalamus barbatus Hsueh
et D. Z. Li
WANG Juan1, BI Wei1, PU Xiao-Lan1, CHEN Fang2, PENG Gui-Sha1, YANG Yu-Ming2,*
1State Forestry Administration Key Lab of Biodiversity Conservation in Southwest Region of China, Southwest Forest University,
Kunming 650224, China; 2Yunnan Academy of Forestry, Kunming 650201, China
Abstract: In this study, calli were induced from seed explants of Dendrocalamus barbatus. According to the
research of the effects of different kinds and concentrations of plant growth regulator combination in MS medi-
um on callus induction and bud differentiation and the influence of different regulator on rooting effect, a stable
regeneration system was set up. The result indicated that the best medium for callus induction contained MS
basal medium supplemented with 2,4-D 5.0 mg·L-1; the feasible medium for adventitious shoots differentiation
from callus was MS+2,4-D 0.5 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1+KT 0.25 mg·L-1; and the best medium for seedling
rooting was 1/2MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.4 mg·L-1. The establishment of regeneration sys-
tem lays a foundation for the further use of molecular biology techniques for the genetic improvement of bam-
boo plants.
Key words: Dendrocalamus barbatus; callus induction; plant regeneration
竹类是一次性开花植物, 开花周期长而不稳
定, 开花后可能结实也可能不结实, 但都将死亡。
因此, 人们还不能对竹类植物进行有规律的稳定
的有性繁殖, 在大多数情况下散生竹是以竹鞭, 丛
生竹以分篼、埋秆、埋节或扦插等方式进行营养
繁殖, 且在绝大多数情况下不知道这些个体或居
群的生物学年龄和母本来源, 故难以像其他种子
植物一样在个体水平上进行良种选育或遗传变异
的实验研究。运用现代分子生物学手段对竹类植
物开展选优、改良和育种技术研究, 不仅是从基
因水平上获得适合产业化利用优良竹种的唯一选
择, 也是研究其重要经济性状的基因调控机理的
必然途径。竹类植物组织培养是基因工程育种的
基础, 愈伤组织诱导和体细胞胚胎再生植株已成
为竹子遗传改良的技术关键(顾小平等2006; 张敏
等2007), 只有研究和建立完善的再生体系和稳定
高效的遗传转化体系, 才能对竹类植物进行分子
育种或基因改良。国内外自上世纪80年代以来不
断有学者报道竹类植物组织培养的研究(Rao等
1985; Rout和Das 1994, 1997), 概括起来有3种途径:
第1种是以芽繁芽实现竹种在试管里的大量繁殖
(张光楚等1993; 何巨擘等2011); 第2种是通过愈伤
组织途径, 获得再生植株(Jullien等1994; Saxena和
Dhawan 1999; 阙国宁和诸葛强1994; 袁金铃等
2009); 第3种是通过悬浮培养, 形成细胞团, 获得再
植物生理学报360
生植株, 但目前尚处于探索阶段(吴益民等2000; 姚
娜等2011)。只有通过竹类植物愈伤组织和悬浮细
胞培养才能为通过体细胞诱变、细胞融合、外源有
益基因的导入等途径培育新品种提供基础平台。
中国作为竹子生产与利用大国, 但竹类的繁
殖仍以分植法为主, 在愈伤组织诱导和体细胞胚
胎再生植株方面却鲜有成功的实例。小叶龙竹
(Dendrocalamus barbatus)为禾本科(Poaceae)竹亚
科(Bambusa)牡竹属, 为大型合轴丛生竹, 秆高
15~18 m, 粗10~25 cm, 主要分布在云南南部、越
南、缅甸和老挝北部, 海拔360~1 100 m的热带和
南亚热带区域(李德铢和薛纪如1988, 1989)。由于
竹笋品质佳, 秆材纤维长, 材质细致, 材性优良, 是
产区最重要优质的笋用、建材、编制和纸浆用竹;
同时梢头弯或微下垂, 竹秆光滑, 生长迅速, 两年
便可成林, 姿态优美, 为优良的景观用竹, 是我国
南部热带地区最具发展前景的大型经济竹种之
一。国内外对小叶龙竹的研究仅限于对染色体数
目(李秀兰等2001)、沿海沙地小叶龙竹林凋落物
分解及养分归还动态(郑郁善等2008)、广东小叶
龙竹竹炭性能(张文标等2008)、小叶龙竹的纤维
特性(杨清等2008)、小叶龙竹花序和果实的补充
描述(杨汉奇和孙茂盛2011)以及通过种胚以芽繁
芽方式进行小叶龙竹的快速繁殖与离体保存(何巨
擘等2011)等研究, 小叶龙竹通过愈伤组织的诱导
建立再生体系的研究尚未见报道。本研究以小叶
龙竹种子为外植体, 对诱导愈伤组织及其植株再
生进行研究, 以期为竹类植物遗传改良、有益外
源基因导入等现代分子生物学遗传改良方法提供
稳定的遗传转化体系奠定基础。
材料与方法
1 试验材料
小叶龙竹(Dendrocalamus barbatus Hsueh et D. Z.
Li)种子于2009年采自云南勐腊县。以种子为外植
体, 接种于诱导愈伤组织培养基中。
2 材料消毒
无菌材料是组织培养的关键, 接种前对外植
体材料进行3种消毒实验, 筛选出最佳的无菌消毒
法。处理1: 用0.3%高锰酸钾溶液浸种消毒12 h; 处
理2: 用30%漂白剂加2滴吐温浸种消毒1~2 h; 处理3:
用30%漂白剂加2滴吐温浸种消毒4 h以上。处理
后, 放入超净工作台, 用0.1% HgCl2溶液并加2滴吐
温不停振荡, 使材料消毒10 min, 取出后用无菌水
反复清洗5次, 用无菌滤纸吸干水分, 接种于诱导
培养基, 2周后统计污染率。每50粒种子为1个处
理, 每个处理3次重复。
3 愈伤组织诱导
基本培养基选用MS、N6和B5这3种, 均添加
2,4-D 5.0 mg·L-1。每组10瓶, 每瓶10粒种子, 接种
于诱导愈伤组织培养基中进行暗培养, 1个月后统
计出愈数和出愈率。
在基本培养基筛选试验完成后, 为筛选适宜
的生长调节剂, 设计诱导培养基3组, 即以MS为基
本培养基, 分别添加2,4-D 3.0、4.0和5.0 mg·L-1。每
组10瓶, 每瓶10粒种子。
以上培养基均加入蔗糖30 g·L-1, 水解酪蛋白250
mg·L-1, 琼脂5 g·L-1, pH 5.8。在22~25 ℃下暗培养。
4 愈伤组织的分化
设计培养基3组: (1) MS+2,4-D 0.5 mg·L-1+6-
BA 1.0 mg·L-1+KT 0.25 mg·L-1; (2) MS+2,4-D 1.0
mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1+KT 0.50 mg·L-1; (3)
MS+2,4-D 2.0 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1+KT 1.00
mg·L-1, 培养基均加入蔗糖30 g·L-1, 水解酪蛋白250
mg·L-1, 琼脂5 g·L-1。pH 5.8, 培养温度为(25±3) ℃,
光照时间为14 h·d-1, 光照强度为20~30 μmol·m-2·s-1。
5 生根与移栽
把长至1.5 cm以上的芽从中切离后接种到50 mL
生根培养基中进行生根诱导, 诱导培养基为1/2MS,
附加6-BA 0.5 mg·L-1、NAA 1.0 mg·L-1以及IBA浓度
分别为0.1、0.2、0.4和0.8 mg·L-1, 另加蔗糖20 g·L
和琼脂6 g·L, 将pH值调至5.8, 每瓶接种5个芽。10
瓶为1个处理, 3次重复。5周后, 统计生根的芽数。
试管苗生根后20 d, 把培养瓶打开放到自然光
下炼苗5~7 d后, 先移入河沙的基质中, 最高移栽成
活率可达80%, 1~2个月后换盆到红壤:河沙:腐殖土
为1:1:1和2:1:0.5的基质中, 60 d后统计其成活率与
生长状况。
实验结果
1 不同消毒剂灭菌效果
试验结果见表1: 处理1效果不好, 污染率高达
王娟等: 小叶龙竹(Dendrocalamus barbatus)愈伤组织诱导及植株再生 361
55.3%; 处理2较好, 既能保持种子生活力又能控制
污染率在10%以内; 处理3虽然污染率很低, 但多数
种子丧失生活力, 其萌发率仅为5.3%。因此, 对小
叶龙竹种子最佳消毒处理为用30%漂白剂加2滴吐
温浸种消毒1~2 h, 放入超净台后, 用0.1%的HgCl2
溶液消毒10 min, 取出后用无菌水反复清洗。
2 愈伤组织诱导情况
2.1 不同基本培养基对愈伤组织诱导的影响
合子胚接种在附加2,4-D 5.0 mg·L-1的MS、N6
和B5这3组基本培养中(图1-A), 20 d转接1次, 60 d
表1 不同消毒剂灭菌效果比较
Table 1 Comparison of different sterilizing treatments
处理 消毒方法 接种数/粒 污染数/粒 污染率/% 萌发数/粒
1 0.3%高锰酸钾溶液浸种消毒12 h 150 83 55.3 25
2 30%漂白剂加2滴吐温浸种消毒1~2 h 150 14 9.3 84
3 30%漂白剂加2滴吐温浸种消毒4 h以上 150 8 5.3 8
　　接种在MS+2,4-D 5.0 mg·L-1培养基中。
图1 小叶龙竹愈伤组织诱导及植株再生
Fig.1 The callus induction and plant regeneration of D. barbatus
A: 合子胚诱导愈伤组织; B: 褐化后的I型愈伤组织; C: 增殖II型愈伤组织; D: 增殖III型愈伤组织; E: 生根; F: 炼苗; G: 移栽成活幼苗。
结构及发展趋势可将诱导产生的愈伤组织分为3
种类型。I型愈伤组织, 结构致密粘性、生长缓
慢、质地柔软, 含水率高, 颜色多为灰白色或者褐
色, 无固定形状, 一般以团状存在, 非常容易褐化,
在经过3~5 d的培养后基本都会褐化(图1-B)。II型
愈伤组织, 旺盛分裂、结构疏松, 白色透明的细小
颗粒状, 或是含水率极高, 柔软呈絮状, 非常容易
分散。此类愈伤组织容易继代培养, 但几乎丧失
分化能力, 为分化能力较差的愈伤组织(图1-C)。
III型愈伤组织, 生长稍快、复杂多样、色泽鲜亮,
基本为浅黄色或浅黄绿色, 表面较粗糙, 质地坚硬,
由致密的颗粒结节状愈伤组织组成, 含水率低, 在
继代的过程中用镊子拨弄可以分散为颗粒状, 长
期继代仍能分化, 培养过程中基本不会褐化, 能分
化出芽(图1-D)。
愈伤组织的增殖培养主要选用介于II型和III
型的愈伤组织。实验显示以5.0 mg·L-1 2,4-D浓度
出愈最快, 出愈率最高, 且愈伤组织质量良好, 在
暗培养条件下, 4 d即可产生愈伤组织。值得注意
的是培养20 d后, 3种不同浓度2,4-D处理中, 5.0
后进行观察, 3组培养基的诱导率差异较大, B5较
易褐化, 出愈率仅为5%, 且结构松散, 不易分化出
芽; N6出愈率为22%, 愈伤组织水渍, 易褐化; MS
培养基出愈率最高, 达69%, 且愈伤组织致密, 颗粒
状, 能分化出芽, 因此, 是最适宜小叶龙竹愈伤组
织诱导的培养基。
2.2 不同2,4-D浓度对愈伤组织诱导的影响
以MS培养基附加3种浓度2,4-D作为初始培养
基进行愈伤组织诱导实验, 4 d即可见到有愈伤组
织开始产生, 培养至20 d后, 依据其颜色、形状、
植物生理学报362
mg·L-1 2,4-D浓度的出愈率最高, 达82%, 且产生的
愈伤组织属于III型愈伤组织, 色泽浅黄色, 质地坚
硬, 大部分为致密的颗粒结节状愈伤组织, 长期继
代仍能分化, 表现出诱导的愈伤组织结构和颜色
等均优于3.0和4.0 mg·L-1 2,4-D浓度诱导的愈伤组
织(表2)。但培养时间超过一个月时部分愈伤组织
变黄, 粘性大, 且增殖幅度下降。从其出愈率来看,
诱导的前10 d, 5.0 mg·L-1 2,4-D浓度的出愈率为
30%, 到第20天为82%, 增幅达172.6%, 但从第20天
到第30天, 出愈率仅从82%增加至87%, 仅增加
5.0%。因此, 诱导愈伤组织以MS+2,4-D 5.0 mg·L-1
为宜, 但培养20 d左右必须减少2,4-D的用量至
MS+2,4-D 3.0 mg·L-1, 才能保证诱导出的愈伤组织
保持旺盛的生长状态, 避免褐化。
表2 2,4-D对小叶龙竹愈伤组织诱导的影响
Table 2 Effect of 2,4-D on callus induction of D. barbatus
2,4-D/mg.L-1
愈伤组织诱导率/%
愈伤组织诱导情况及性状描述

10 d 20 d 30 d
3.0 12Cc 72Cc 83Bb 出愈慢, 偏黄白色, I型
4.0 23Bb 75Bb 84Bb 出愈慢, 多数愈伤质量好, 但少数愈伤粘性大, 偏灰色, II型
5.0 30Aa 82Aa 87Aa 出愈快, 多数愈伤质量好, 少数愈伤粘性大, 偏黄绿色, III型
　　同一列数字旁大写字母不同表示差异极显著(P<0.01), 小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
表3 不同浓度的2,4-D、6-BA和KT对愈伤组织再生能力的
影响
Table 3 Effects of different concentration of 2,4-D, 6-BA and
KT on regeneration of callus
2,4-D/ 6-BA/ KT/ 接种 分化 分化率/
mg·L-1 mg·L-1 mg·L-1 数/个 数/个 %
0.5 1.0 0.25 50 12 24
1.0 1.0 0.50 50 9 18
2.0 2.0 1.00 50 5 10
3 2,4-D、6-BA和KT不同浓度配比对愈伤组织分
化的影响
分别在培养基中添加2,4-D、6-BA和KT 的不
同浓度配比, 其分化结果见表3。对愈伤组织诱导
不定芽, 培养20 d左右就可见不定芽出现, 40 d后3
个浓度的2,4-D对愈伤组织分化能力存在较大差
异, 2,4-D 0.5 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1+KT 0.25
mg·L-1的愈伤组织的分化率最高, 达24%, 是增殖后
愈伤组织进行分化的最佳培养基。
实验中我们得到黄绿色的愈伤组织, 但只有
很少植株形成, 于是用2种培养方式来比较愈伤组
织的再生能力。一种方式即按常规方法, 每次都
继代于相同的分化培养基; 另一种方式是在分化
培养基和MS空白培养基上交替培养。继代培养3
个月后比较, 交替继代培养的愈伤组织分化为不
定芽的比例为40%以上, 每次都继代于相同分化培
养基的愈伤组织芽的分化率仅为23%, 交替继代培
养可以在一定程度上较长时间保持愈伤组织的再
生能力。
4 根的诱导与移栽
将丛生芽接种在4组培养基上, 1周后, 在丛生
芽基部产生白色的根原基并开始形成根, 培养至20
d可看到不定根较为集中发生。值得注意的是, 当
大多数根尚未长出时茎叶呈现逐渐变黄的趋势,
但当根长出2 cm长时, 茎叶又逐渐转绿(图1-E)。
生根过程较短, 不到1个月就可以长出大量而粗壮
根系, 呈辐射状展开, 直径大于0.1 cm。不定根生
长很快, 30 d左右可达8~10 cm, 每个芽丛的根系可
达10~15条。
从培养的各个环节看, 小叶龙竹完成丛生芽
诱导后, 根的诱导较容易, 仅需培养3周左右, 平均
根长达5~8 cm, 便可以炼苗。但不同的植物生长
调节剂水平对根的生长有显著影响, 生根实验结
果见表4。随着IBA浓度增加, 根逐渐加粗, 但当
IBA浓度超过0.4 mg·L-1, 芽丛的生根率降低, 并逐
渐衰退, 主要表现为, 产生的芽无法展叶, 而已展
叶的植株体会随着IBA浓度的提高而生长势减弱,
叶片枯黄, 最后萎蔫。
因此, 综合生根率、生根量以及根的形态和
植株的状态, 从试验中得出小叶龙竹的最适生根
培养基为1//2MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+
IBA 0.4 mg·L-1。
王娟等: 小叶龙竹(Dendrocalamus barbatus)愈伤组织诱导及植株再生 363
表4 不同浓度6-BA、NAA和IBA对再生植株生根的影响
Table 4 Effects of different concentration of 6-BA, NAA and IBA on regenerated plantlet inducting root
处理 6-BA/mg·L-1 NAA/mg·L-1 IBA/mg·L-1 20~30 d的生根情况
1 0.5 1.0 0.1 长出5~6条根, 长4 cm以上, 粗壮结实, 呈辐射状生长
2 0.5 1.0 0.2 长出5~8条根, 长4 cm以上, 粗壮结实, 呈辐射状生长
3 0.5 1.0 0.4 长出6~10条根, 长可达5 cm以上, 粗壮结实, 呈辐射状生长
4 0.5 1.0 0.8 长出5~6条根, 长可达5 cm以上, 幼苗叶片枯黄, 最后萎蔫
进入炼苗阶段时, 挑选苗高达到5 cm以上、
生根整齐、苗体健壮的植株移出培养室, 不打开
瓶盖先放在自然散射光下炼苗2~3 d, 待小苗适应
温度、光照等的变化后, 再逐渐掀开瓶盖, 放置
3~5 d便可移栽。
为使根系得到较好的发育, 生根后的试管苗
炼苗7 d左右(图1-F), 将其移栽到纯河沙基质中, 每
周1次用稀释1 000倍的MS培养基大量元素的母液
进行叶面喷洒施肥 , 1个月后移栽成活率可达
80%。1个月后将成活健壮的幼苗换盆到红壤:河
沙:腐殖土=1:1:1和2:1:0.5基质中的成活率分别是
67.30%和54.20% (图1-G)。
讨　　论
以小叶龙竹合子胚为外植体, 通过在MS、B5
和N6这3种基本培养基中添加不同种类及浓度的
植物生长调节剂, 对小叶龙竹进行愈伤组织培养
和植株再生的研究, 从而得到小叶龙竹愈伤组织
的诱导、增殖、分化、生根各个阶段所需要的最
佳培养基和培养条件以及炼苗和移栽的适宜方
法。试验显示, 淡黄致密的愈伤组织有着较强的
植株再生能力 , 但也有的愈伤组织虽然为淡黄
色、结构致密的颗粒状, 在分化过程中仅有绿色
芽点出现, 却不能分化出完整的植株。因此, 在试
验中还需要利用不同水平的2,4-D、水解酪蛋白、
6-BA、KT等进行处理(王海波等1996)。用植物生
长调节剂刺激竹类植物愈伤组织朝着所需要的理
想状态发展, 一方面能使诱导的愈伤组织具有较
强的分化能力, 同时也是解决竹类植物悬浮细胞
培养的关键技术之一。
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