全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 1期，2009年 1月 6 7
磺胺比色法测定植物组织硝酸还原酶活性的改进
李忠光 *, 龚明
云南师范大学生命科学学院, 昆明 650092
收稿 2008-10-19 修定 2008-11-17
资助 云南师范大学综合性和设计性实验研究项目。
* E-mail: zhongguang_li@163.com; Tel: 0871-5517394
“植物组织硝酸还原酶(NR)活性的测定”是植
物生理学矿质营养一章中必做的实验, 其目的是让
学生掌握植物硝酸还原酶(nitrate reductase, NR, EC.
1.6.6.1)活性测定的原理和技术方法, 进一步了解
NR在植物氮素同化过程中的作用(白宝璋和汤学军
1993; 李合生等 2001; 郝建军等 2007)。但是, 在
实验教学中, 我们感到, 按照几种植物生理学实验
指导书中介绍的方法(白宝璋和汤学军 1993; 李合
生等2001; 郝建军等2007)测定NR活性, 测得的NR
活性很低, 有时甚至检测不出来。因此我们对此方
法的显色液配方、显色时间、三氯乙酸对显色反
应的影响和实验材料的取舍进行了探索, 取得了较
好的实验效果。
1 显色液配方和显色时间的确定
磺胺比色法测定植物组织NR活性的原理, 是
根据NR还原NO3-后所产生的NO2-在酸性条件下
首先与磺胺发生重氮化反应形成重氮盐, 后者再进
一步与α-萘胺发生偶联反应形成粉红色的偶氮化
合物, 通过测定偶氮化合物形成的量来表示硝酸还
原酶活性的大小, 因此常用到磺胺和α-萘胺2种显
色剂。但是, 我们在实验中发现, 按照实验指导书
中的方法用25% HCl (V/V, 即3 mol·L-1)分别配制磺
胺和 α-萘胺 2种显色剂, 表现出溶解度小, 反应速
度慢, 灵敏度低, 显色时间长(实验指导书中为 30
min)等缺点。在用磺胺比色法测定植物组织NR活
性实验中, 酸度是影响重氮化反应和偶联反应的主
要影响因素之一(张志良和瞿伟菁2003), 为了找出
合适的显色液配方, 也就是合适的显色液酸度, 我
们除了用实验指导书中指定的配方, 即用 3 mol·L-1
的HCl分别配制磺胺和α-萘胺2种显色剂外, 还用
相同浓度的H2SO4、H3PO4和HAc分别配制显色液,
并在 25 ℃下测试它们分别与 5 µg·mL-1 NaNO2显
色反应 15 min和 30 min的光密度 A520, 得到表 1的
结果。从表 1可以看出, 随着酸强度的增加, 2个
显色时间的A520都呈现逐渐下降的趋势, 具体表现
为HAc>H3PO4>HCl>H2SO4。此外, 以3 mol·L-1 HAc
为溶剂配制的显色液与5 µg·mL-1 NaNO2显色反应
15 min, 其A520即可达到最大值, 而其余3种需显色
30 min, A520才能达到最大值, 并且它们的A520始终
小于HAc的, 说明用HAc配制的显色液其显色反应
速度和灵敏度都明显高于分别以 H2SO4、HCl和
H3PO4为溶剂配制的。因此, 在植物组织NR活性
测定中, 以 3 mol·L-1 HAc为溶剂配制磺胺和 α-萘
胺2种显色剂, 不仅可提高显色反应的灵敏度, 而且
还可以加快显色反应的速度并缩短显色反应的时
间, 显色反应时间仅为 15 min, 光密度 A520就可达
到最大值, 达到事半功倍的效果。
2 三氯乙酸对显色反应的影响
在用活体法测定植物组织NR活性时, 植物生
理学实验指导书中常用终浓度为 3% (184 mmol·L-1)
的三氯乙酸(TCA)终止酶促反应(李合生等 2001)。
我们在实验中用上述 2种显色液(即以 3 mmol·L-1
HCl或HAc为溶剂分别配制磺胺和α-萘胺)在25 ℃
下分别测试了用蒸馏水或 184 mmol·L-1 TCA配制
的 5 g·mL-1 NaNO2, 以及用 TCA终止酶促反应法
(TCA终止法)测定蜀葵叶片中的NR活性(酶促反应
教学园地 Teaching
表 1 几种配方的显色液对NO2-显色速度和灵敏度的影响

配方
A520
显色 15 min 显色 30 min
实验指导书中的配方 3 mol·L-1 HCl 0.228±0.011 0.467±0.022
改进和新增加的配方 3 mol·L-1 H2SO4 0.182±0.008 0.448±0.017
3 mol·L-1 H3PO4 0.329±0.013 0.561±0.025
3 mol·L-1 HAc 0.648±0.031 0.654±0.030
　　表中数据为重复 3 次的平均值 ± 标准误。
植物生理学通讯 第 45卷 第 1期，2009年 1月6 8
时间到后, 立即把被测液从含有实验材料的反应体
系中取出的方法称为隔离法), 显色 30 min后分别
测定其光密度 A520, 得到表 2的结果。从表中可以
看出, 与以蒸馏水为溶剂配制NaNO2相比, 用TCA
配制(相当于用 TCA 终止酶促反应)明显降低了
A520; 类似地, 用 TCA终止法所测出的 A520也明显
低于隔离法。这些结果说明TCA降低了磺胺比色
法测定NO2-的灵敏度, 其原因可能是外加 TCA后
导致反应体系的酸度变大, 从而影响重氮化反应和
偶联反应的速度(张志良和瞿伟菁 2003; 表 1)。这
些结果表明在植物组织NR活性测定中, 用TCA终
止反应是不适合的, 否则测定结果将明显偏低, 实
验指导书中用TCA终止反应值得商榷。为了更准
确地测定NR活性, 酶促反应结束后, 立即将所测
液从含有实验材料的反应体系中取出(隔离法), 从
而使底物和NR分离, 仍可达到终止酶促反应的目
的。
竺葵(Pelargonium hortorum Bailey)、向日葵
(Helianthus annuus L.)、蓖麻(Ricinus communis
L.)和蜀葵(Althaea rosea Linn.)等植物叶片为实验
材料进行了NR活性的测定, 得到表 3的结果。从
表 3可以看出, 实验指导书中介绍的几种实验材
料的 NR 活性在 4.5~32.6 µg·g-1 (FW)·h-1之间, 平
均值为 14.78 µg·g-1 (FW)·h-1, 而新测定的几种植物
实验材料的NR活性在44~206.6 µg·g-1 (FW)·h-1之间,
平均值为125 µg·g-1 (FW)·h-1, NR活性大约是前者的
8.5倍, 表现出很高的 NR活性。
3 实验材料的取舍
由于不同实验材料中NR活性差别较大, 有的
实验材料甚至检测不出NR活性, 因此在植物组织
NR活性测定中, 选择合适的实验材料成为实验成
功与否的关键。为了筛选出适合于 NR活性测定
的实验材料, 我们结合实验教学实际, 除了用上述
3 mol·L-1 HAc分别配制磺胺和α-萘胺 2种显色剂,
测定实验指导书中介绍的水培 2周的水稻(Oryza
sativa L.)、小麦(Triticum aestivum L.)、玉米(Zea
mays L.)、豌豆(Pisum sativum L.)和烟草(Nicotiana
tabacum L.)等几种植物叶片中的NR活性以外, 还
以校园植物如法国梧桐(Platanus orientalis L.)、天
综上所述, 在植物组织NR活性测定中, 我们
建议广大同行在选用合适的实验材料, 如向日葵、
蓖麻和蜀葵等植物叶片, 尤其以蜀葵叶片为最佳的
基础上, 以 3 mol·L-1 HAc为溶剂分别配制磺胺和
α-萘胺两种显色剂, 不仅可以提高显色反应的灵敏
度, 而且还可以加快显色反应的速度并缩短显色反
应的时间, 达到事半功倍的效果, 对于实验指导书
中用 TCA终止NR酶促反应的方法值得商榷。
参考文献
白宝璋, 汤学军(1993). 植物生理学测试技术. 北京: 科学技术出
版社, 24~25
郝建军, 康宗利, 于洋(2007). 植物生理学实验技术. 北京: 化学
工业出版社, 62~64
李合生, 赵世杰, 张文华(2001). 植物生理生化实验原理和技术.
北京: 高等教育出版社, 125~128
张志良, 瞿伟菁(2003). 植物生理学实验指导(第 3版). 北京: 高
等教育出版社, 42
表 2 TCA对磺胺比色法测定NR活性显色反应的影响

测定内容和方法
A520
3 mol·L-1 HCl 3 mol·L-1 HAc
5 µg·mL-1 NaNO2水溶液 0.467±0.022 0.654±0.030
5 µg·mL-1 NaNO2 TCA溶液 0.354±0.016 0.512±0.024
隔离法 0.538±0.020 0.752±0.026
TCA终止法 0.406±0.018 0.588±0.021
　　表中数据为重复 3 次的平均值 ± 标准误。
表 3 几种实验材料中的NR活性比较
　　　 实验材料 酶活性 /µg·g-1 (FW)·h-1
实验指导书中的实验材料 水稻 14.5±0.3
小麦 26.1±1.0
玉米 52.5±1.5
豌豆 39.2±1.2
烟草 105.6±4.3
改进和新增加的实验材料 法国梧桐 145.2±5.5
天竺葵 264.3±7.5
向日葵 390.6±11.5
蓖麻 570.4±12.1
蜀葵 688.5±15.2
　　表中植物叶片的取材时间为下午 2 点, 数据为重复 3 次的平
均值 ± 标准误。