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春石斛优良品种‘森禾2006’组培快繁体系的建立



全 文 :植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (12): 1363~1367 1363
收稿 2013-08-06  修定 2013-09-18
资助 国家“十二五”支撑计划课题(2011BAD12B02-01)。
* 通讯作者(E-mail: chbly@sohu.com; Tel: 010-62336062)。
春石斛优良品种‘森禾2006’组培快繁体系的建立
贾梦雪1, 徐瑾1, 叶香娟2, 刘芊1, 王喆2, 刘燕1,*
1北京林业大学园林学院, 国家花卉工程技术研究中心, 北京100083; 2浙江森禾种业股份有限公司, 杭州310012
摘要: 本文研究了春石斛‘森禾2006’的拟原球茎(PLBs)诱导、增殖、分化及壮苗和生根, 建立了其组培快繁体系。结果表
明: ‘森禾2006’ PLBs最适诱导培养基为1/2MS+TDZ 0.5 mg·L-1+水解酪蛋白2.0 g·L-1; PLBs增殖培养基为1/2MS+水解酪蛋白
2.0 g·L-1; PLBs分化培养基为1/2MS+KT 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1; 壮苗生根培养基为MS+IBA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+
香蕉泥100.0 g·L-1。
关键词: 春石斛; 拟原球茎(PLBs); 组培快繁; 种苗
Establishment of Rapid Propagation System for Elite Variety of Dendrobium
nobile Lindl. ‘Senhe 2006’ by Tissue Culture
JIA Meng-Xue1, XU Jin1, YE Xiang-Juan2, LIU Qian1, WANG Zhe2, LIU Yan1,*
1National Engineering Research Center for Floriculture, College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University, Beijing
100083, China; 2Zhejiang Senhe Seed Company Limited, Hangzhou 310012, China
Abstract: To achieve the mass-scale multiplication of Dendrobium nobile ‘Senhe 2006’, the optimal media for
the induction, multiplication and differentiation of protocorm-like bodies (PLBs), strengthening and rooting
were studied and the rapid propagation system by tissue culture was established. The results showed that
1/2MS+TDZ 0.5 mg·L-1+casein hydrolysate 2.0 g·L-1 was optimal for PLB induction. 1/2MS+casein hydrolysate
2.0 g·L-1 was the most suitable for PLB multiplication. 1/2MS+KT 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1 was the most
efficient for PLB differentiation. The optimum medium for strengthening and rooting was MS+IBA 0.5 mg·L-1 +NAA
0.1 mg·L-1+banana homogenate 100.0 g·L-1.
Key words: Dendrobium nobile; protocorm-like bodies (PLBs); tissue culture and rapid propagation; plantlets
春石斛是兰科(Orchidaceae)石斛属多年生宿
根花卉, 与卡特兰、蝴蝶兰、万带兰并称为观赏
价值最高的四大观赏兰花(王伟等2009)。我国春
石斛的栽培与研究起步较晚, 目前国内花卉市场
的春石斛品种大多数是日本等国外种苗公司的
二、三代种苗(毛碧增等2003), 部分企业通过多年
引种试验 , 选出了一些适宜我国栽培的优良品
种。生产上主要靠扦插繁殖, 其周期长, 繁殖系数
低, 国产的高品质春石斛种苗供不应求(陈文贞和
张孟锦2010), 尚不足以支撑规模化商品生产, 从而
大大限制了春石斛在花卉市场上的推广应用(王华
和付玉兰2012)。春石斛优质种苗的组织培养繁殖
是实现其规模化、标准化生产的有效途径。拟原
球茎(protocorm-like bodies, PLBs)诱导繁殖是春石
斛组培快繁的重要途径之一, 与丛生芽途径相比,
其取材更广泛, 繁殖系数更大, 成苗更快。本研究
以春石斛优良品种‘森禾2006’组培无菌苗的茎尖
为材料, 诱导PLBs产生, 并研究了PLBs增殖、分
化、生根培养基, 建立了组培快繁体系, 为春石斛
优良品种的种苗生产提供技术支撑。
材料与方法
1 材料
春石斛品种‘森禾2006’ (Dendrobium nobile
Lindl. ‘Senhe 2006’)苗高2~3 cm的组培瓶苗由浙江
森禾种业股份有限公司提供。
2 方法
2.1 PLBs诱导培养基的筛选
采用L9(3
4)正交试验设计, 以1/2MS为基本培
养基(蔗糖20 g·L-1, pH 5.4), 设置TDZ (0.1、0.3、
0.5 mg·L-1)、NAA (0、0.1、0.2 mg·L-1)、水解酪蛋
植物生理学报1364
白(0、1.0、2.0 g·L-1)三因素三水平, 共9个处理。
每个处理接种4~6瓶, 每瓶接种1个外植体, 重复3
次。在超净台上切取3 mm无菌苗茎尖, 接入培养
基, 置于120 r·min-1的摇床, 培养50 d后统计诱导
率。PLBs诱导率=[培养50 d后诱导出PLBs的茎尖
个数/(接种数–污染数)]×100%。
2.2 PLBs增殖培养基的筛选
以1/2MS为基本培养基(蔗糖20 g·L-1, 琼脂6.0
g·L-1, pH 5.4), 设置水解酪蛋白0、2.0 g·L-1两个浓度
处理, 考察水解酪蛋白对PLBs增殖的影响。每处
理接种3瓶, 每瓶接种1块PLBs, 重复3次。在超净
台上用电子天平按每瓶0.05~0.1 g称取PLBs, 接入培
养基, 接入PLBs的鲜重记为W1, 培养15 d后称量每瓶
PLBs的鲜重, 记为W2。PLBs增殖倍数=(W2–W1)/W1。
2.3 PLBs分化培养基的筛选
以1/2MS为基本培养基(蔗糖30 g·L-1, 琼脂6.5
g·L-1, pH 5.4), 设置KT (1.0、2.0 mg·L-1)和NAA
(0.1、0.5 mg·L-1)两因素两水平试验, 共4个处理。
每处理接种2瓶, 每瓶接种3块PLBs, 重复3次。在
超净台上用电子天平按每瓶每块约0 .1 g称取
PLBs, 接入培养基, 40 d后统计PLBs分化率。PLBs
分化率=(培养40 d后分化成不定芽的PLBs块数/接
种总块数)×100%。
2.4 无菌苗壮苗和生根培养基的筛选
采用L9(3
4)正交试验设计, 以MS为基本培养基
(蔗糖20 g·L-1, 琼脂6.0 g·L-1, pH 5.4), 设置IBA
(0.1、0.5、1.0 mg·L-1)、NAA (0、0.1、0.5
mg·L-1)、添加物质(1.0 g·L-1活性炭、100.0 g·L-1香
蕉泥、不添加)三因素三水平, 共9个处理。每瓶接
种3株PLBs分化出的无菌苗, 分别于接种时和40 d
后, 观测无菌苗根数, 记为g和g; 用电子天平分别
秤量无菌苗重量, 记为W和W。重复3次。根增加
数=g–g; 鲜重增加量=W–W; 褐化率=(褐化无菌苗
株数/接种总株数)×100%。
以上培养条件均为光照时间14 h·d-1, 光照强
度40 µmol·m-2·s-1, 培养温度(23±2) ℃。
实验结果
1 春石斛茎尖诱导PLBs的适宜培养基
切取‘森禾2006’无菌苗茎尖约3 mm, 接入培
养基中, 进行PLBs诱导培养, 35 d后可见PLBs出现,
诱导50 d后PLBs生长情况见图1-A。不同培养基
上的PLBs诱导率从11.1%~58.3%不等, 其中, 诱导
率最高的培养基为1/2MS+TDZ 0.5 mg·L-1+水解酪
蛋白2.0 g·L-1 (表1); 未诱导出PLBs主要是由于接种
的外植体褐化所致。对正交试验结果进行级差分
析, 诱导率的K值分析结果表明, 培养基中各成分
对PLBs诱导影响作用的大小顺序为NAA>水解酪
蛋白>TDZ, PLBs诱导率随着TDZ及水解酪蛋白浓
度的增加而升高, 以不加NAA的效果最好。
2 诱导春石斛PLBs增殖的适宜培养基
将诱导出的PLBs培养30 d后转移到1/2MS、
图1 ‘森禾2006’茎尖诱导PLBs
Fig.1 PLBs induced from shoot tips of ‘Senhe 2006’
A: PLBs诱导培养50 d; B: PLBs增殖培养20 d; C: PLBs分化培养40 d; D和E: 无菌苗壮苗和生根培养40和70 d。
贾梦雪等: 春石斛优良品种‘森禾2006’组培快繁体系的建立 1365
添加或不添加水解酪蛋白的培养基上进行增殖培
养(图1-B), 培养过程中每20~25 d继代培养一次, 否
则极易分化出不定芽, 影响增殖速率。从表2中可
看出, 添加水解酪蛋白的培养基上PLBs的增殖倍
数为2.67, 与未添加的相比有显著差异, 可见添加
水解酪蛋白可促进PLBs增殖。因此, ‘森禾2006’
PLBs增殖适宜培养基为1/2MS+水解酪蛋白2.0
g·L-1, 增殖倍数约为2.7倍。
化率为27.7%~61.0%。
4 春石斛无菌苗的壮苗生根适宜培养基
将PLBs分化出的高1~2 cm无菌苗接入不同
的生根培养基中, 进行生根培养(图1-D和E)。结
果表明, 在2、4、5号培养基上无菌苗的生根数较
多, 但生根数和褐化率均无显著差异; 在5号培养
基上, 无菌苗鲜重增加量高于2和4号培养基(表
4)。因此, 5号培养基(MS+IBA 0.5 mg·L-1+NAA
0.1 mg·L-1)适宜无菌苗生根和鲜重增加。对正交
试验的结果进行级差分析, 生根数的K值分析结果
表明, 培养基成分中对生根影响作用的大小顺序
为NAA>IBA>添加物, 最佳组合的培养基为: MS+
IBA 0.5 mg·L-1 +NAA 0.1 mg·L-1+香蕉泥100.0 g·L-1
(表4), 适合无菌苗诱导生根。另外, 当培养基中加
有低浓度的IBA和NAA时, 添加活性炭可以明显
抑制褐化发生。
表1 不同浓度TDZ、NAA和水解酪蛋白对‘森禾2006’茎尖诱导PLBs的影响
Table 1 Effects of different concentrations of TDZ, NAA and casein hydrolysate on the
PLB induction from shoot tips of ‘Senhe 2006’
编号 TDZ浓度/mg·L-1 NAA浓度/mg·L-1 水解酪蛋白浓度/g·L-1 诱导率/% 褐化率/%
1 0.1 0 0 36.4ab 27.3bc
2 0.1 0.1 1.0 30.0ab 30.0bc
3 0.1 0.2 2.0 22.2b 55.6bc
4 0.3 0 1.0 30.0ab 30.0bc
5 0.3 0.1 2.0 33.3ab 66.7ab
6 0.3 0.2 0 12.5b 87.5a
7 0.5 0 2.0 58.3a 25.0c
8 0.5 0.1 0 11.1b 66.7ab
9 0.5 0.2 1.0 25.0b 66.7ab
K1 29.4 41.6 19.3
K2 24.9 24.9 28.5
K3 31.4 19.3 37.9
R 6.5 22.6 18.6
  采用Duncan多重比较法, 小写英文字母表示在0.05水平上的差异显著; 表3和表4同此。
表2 添加水解酪蛋白对‘森禾2006’ PLBs增殖的影响
Table 2 Effect of casein hydrolysate on PLB
multiplication of ‘Senhe 2006’
编号 水解酪蛋白浓度/g·L-1 PLBs增殖倍数
1 2.0 2.67±0.05a
2 0 2.00±0.19b
  采用t-检验, 小写英文字母表示在0.05水平上的差异显著。
表3 不同浓度KT和NAA对‘森禾2006’ PLBs分化的影响
Table 3 Effects of different concentrations of KT and NAA on
PLB differentiation of ‘Senhe 2006’
编号 KT浓度/mg·L-1 NAA浓度/mg·L-1 分化率/% 褐化率/%
1 1.0 0.1 72.3a 27.7b
2 1.0 0.5 27.7b 61.0a
3 2.0 0.5 27.8b 44.3ab
4 2.0 0.1 55.7ab 38.8ab
3 诱导春石斛PLBs分化的适宜培养基
将未分化且发育良好的PLBs接入分化培养
基, 培养25 d左右开始陆续出现不定芽(图1-C)。从
表3可看出, 在1号培养基中, PLBs的分化率最高,
为72.3%, 明显高于其他培养基, 且褐化率最低, 为
27.7%。NAA对PLBs分化的影响大于KT, 低浓度
的NAA更利于PLBs的分化。培养过程中, PLBs的
褐化现象较为严重, 不同培养基上, 接种外植体褐
植物生理学报1366
讨  论
已有细胞学观察结果认为PLBs是单细胞起源
的体细胞胚(詹忠根2006)。PLBs繁殖途径取材广
泛, 繁殖系数大, 成苗快, 适合石斛的组培快繁。
采用该方法已在铁皮石斛(张启香等2009)、金钗
石斛(陈庭等2005)、霍山石斛(孙廷等2007)、春石
斛(孟金玲2011)等植物的快繁中成功获得组培
苗。春石斛品种不同, 培养基配方差异很大(孟金
玲2011)。因此, 本研究针对春石斛品种‘森禾2006’
进行了PLBs繁殖途径的组培快繁研究。
研究表明, 茎尖更容易诱导出PLBs, 而腋芽容
易形成丛生芽(周辉明等2006)。单独用NAA、
6-BA或TDZ都能诱导出PLBs (侯大强2006; Chung
等2007), TDZ直接诱导形成PLBs的效果比6-BA好,
且所需浓度相对较低(Roy等2007; Sujjaritthurakarn
和Kanchanapoom 2011)。另外, 水解酪蛋白对
PLBs的诱导起重要作用(黄萍萍等2003)。本研究
发现, TDZ在0.1~0.5 mg·L-1浓度范围内, 随浓度升
高PLBs诱导率呈上升趋势, 但对PLBs诱导影响不
显著, 可加大TDZ不同水平间梯度, 以确定最佳适
宜浓度。添加2.0 g·L-1水解酪蛋白诱导效果较好,
而NAA对PLBs诱导表现出显著抑制作用。培养过
程中, 茎尖褐化会严重影响PLBs诱导, 因此, 采取
不同措施, 降低外植体褐化极为重要。褐化发生
受基因型、植物的生理状态、培养基、培养环境
等众多因素的影响(周俊辉等2000)。已有研究表
明, 暗处理(赵伶俐等2006), 添加天然复合物椰乳
(姚丽娟等2006)、香蕉泥(殷丽青等2006)、活性炭
(莫昭展等2009), 抗氧化剂维生素C、柠檬酸、聚
乙烯比咯烷酮(郑超等2013)等措施均可以抑制褐
化发生, 因此春石斛组培快繁中还可以进一步优
化PLBs诱导培养基配方。
研究表明, 春石斛PLBs在不加任何激素的培
养基中增殖效果最好(周辉明等2006), 加入水解酪
蛋白能有效促进PLBs的增殖(侯大强2006), 这与本
研究结果一致。研究中还发现, PLBs接种大小及
转接的周期对增殖影响较明显, 其最佳条件有待
进一步研究。
PLBs分化出的无菌苗长势不均, 生长细弱。
较小的无菌苗转接时, 容易褐化, 严重降低了成苗
率。因此, 进行无菌苗壮苗和生根至关重要。有
研究表明, 低浓度的NAA和IBA对石斛兰生根有较
好的诱导效果(郑宽瑜等2009), 添加香蕉泥对石斛
兰的壮苗和生根有明显促进作用(孔琼等2005; 张
晓申等2007; 谢寅峰等2007)。本研究结果表明, 在
培养基中添加0.5 mg·L-1 IBA和0.1 mg·L-1 NAA, 试
管苗生根效果最好。添加香蕉泥的培养基明显促
进无菌苗的生根, 这与前人的研究结果一致。而
加入活性炭能有效防止无菌苗褐化, 根系更粗壮,
叶色浓绿, 并促进无菌苗鲜重的增加, 与曾宋君等
(1998)的报道一致。因此, 可将二者结合使用, 设
表4 不同浓度IBA、NAA和添加物对‘森禾2006’无菌苗壮苗和生根的影响
Table 4 Effects of different concentrations of IBA, NAA and additives on strengthening and
rooting of in vitro plantlets of ‘Senhe 2006’
编号 IBA浓度/mg·L-1 NAA浓度/mg·L-1 添加物浓度/g·L-1 生根数/条 鲜重增加量/g 褐化率/%
1 0.1 0 活性炭1.0 3.0±0.6ab 0.11±0.01a 0b
2 0.5 0 香蕉泥100.0 3.6±0.6a 0.06±0.01ab 11.1b
3 1.0 0 0 3.0±0.4ab 0.02±0b 55.6a
4 0.1 0.1 香蕉泥100.0 4.0±0.5a 0.05±0.01ab 11.1b
5 0.5 0.1 0 3.9±0.7a 0.10±0.05a 22.2b
6 1.0 0.1 活性炭1.0 2.3±0.5ab 0.06±0.01ab 0b
7 0.1 0.5 0 1.4±0.5b 0.04±0.01ab 11.1b
8 0.5 0.5 活性炭1.0 2.7±0.6ab 0.05±0.01ab 11.1b
9 1.0 0.5 香蕉泥100.0 2.1±0.5ab 0.03±0b 11.1b
K1 2.6 3.2 2.7
K2 3.4 3.2 3.1
K3 2.4 2.0 2.6
R 0.8 1.2 0.5
贾梦雪等: 春石斛优良品种‘森禾2006’组培快繁体系的建立 1367
置不同梯度组合, 进一步探讨其对无菌苗壮苗生
根的作用。
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