全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 4期，2009年 4月 363
收稿 2009-01-04 修定 　2009-02-05
资助 国家自然科学基金(30 4 60 0 1 6)、云南省自然科学基金
(2006C0030M)和云南省教育厅基金(06Y117B)。
* E-mail: zhongguang_li@163.com; Tel: 0871-5517394
钙和钙调素对机械刺激诱导的烟草悬浮培养细胞耐热性的调控
李忠光 *, 龚明
云南师范大学生命科学学院, 昆明 650092
提要: 机械刺激(mechanical stimulation, MS)可提高烟草悬浮培养细胞的钙调素(calmodulin, CaM)活性, 诱导烟草悬浮培养细
胞耐热性的形成, 外源 Ca2+可加强, 而Ca2+螯合剂 EGTA、质膜Ca2+通道阻塞剂 La3+和胞内Ca2+通道阻断剂钌红(RR), 以
及CaM拮抗剂氯丙嗪(CPZ)和三氟拉嗪(TFP)则削弱这种耐热性的形成。这些暗示Ca2+和CaM参与MS诱导的烟草悬浮培
养细胞耐热性形成的调控。
关键词: 烟草悬浮培养细胞; 机械刺激; 耐热性; 钙; 钙调素
Involvement of Calcium and Calmodulin in the Mechanical Stimulation-induced
Heat Tolerance in Tobacco (Nicotiana tabacum L.) Suspension Culture Cells
LI Zhong-Guang*, GONG Ming
School of Life Sciences, Yunnan Normal University, Kunming 650092, China
Abstract: Mechanical stimulation (MS) obviously enhanced calmodulin (CaM) activity in tobacco (Nicotiana
tabacum) suspension cells, induced the heat tolerance in tobacco suspension cells. The MS-induced heat toler-
ance in tobacco suspension cells was strengthened with exogenous Ca2+ treatment, but weakened by Ca2+
chelator EGTA, plasmamembrame-channel blocker La3+, intracellular channel blocker ruthenium red (RR) and
calmodulin antagonists chlorpromazine (CPZ) and trifluoperazine (TFP), respectively. These results suggested
that Ca2+ and CaM were involved in the regulation of MS-induced heat tolerance in tobacco suspension cells.
Key words: tobacco suspension cells; mechanical stimulation; heat tolerance; calcium; calmodulin
植物在整个生长发育过程中并不是一帆风顺
的, 总会同时或相继遭受一个或一个以上的生物或
非生物的逆境胁迫, 以风吹、雨淋、触摸、创伤
等为代表的机械刺激(mechanical stimulation, MS)
贯穿着植物的整个生长发育过程。MS可矮化植
物, 促进茎的横向加粗, 延缓植物的生长发育过程
(Braam和 Davis 1990; Engelberth 2003; Braam
2005)。有研究表明, MS 可提高黄瓜的抗病性
(Zhao等 2005a, b; Wang等 2006)、番茄的耐冷性
(Keller和Steffen 1995)以及拟南芥的抗生物和非生
物胁迫耐性(Walley等 2007)。我们前期的研究结
果也表明, MS可提高烟草悬浮培养细胞的耐热性
(李忠光和龚明 2008), 但这些耐性的形成是否与
Ca2+和 CaM有关, 迄今尚未完全弄清楚。本文以
烟草悬浮培养细胞为材料, 证实MS预处理可提高
烟草细胞的耐热性, 并且Ca2+和CaM在MS诱导的
烟草悬浮培养细胞耐热性形成中起调控作用。
材料与方法
烟草(Nicotiana tabacum L.)品种‘Bright Yellow’
的愈伤组织来源于其幼嫩的茎髓, 悬浮细胞的具体
培养方法见前文(李忠光等 2005)。
培养 5 d 的烟草悬浮培养细胞从转速 1 2 0
rpm、26 ℃的摇床中转到转速为 150 rpm、26 ℃
的另一摇床中进行MS处理 40 min, 于转速为 120
rpm、26 ℃下恢复培养 4 h后, 转入相同转速的摇
床中于 43℃下进行热胁迫 7 h。分别用磷酸二酯
酶法(黄号栋等 2003)和苔盼蓝染色法(de Pinto等
1999)测定细胞的 CaM活性和存活率。
探讨Ca2+和CaM对MS诱导的耐热性效应时,
培养 5 d的烟草悬浮细胞在MS处理前 15 min分
别用终浓度为 10、5、1、1、0.1和 0.1 mmol·L-1
的 CaCl2、EGTA、LaCl3、钌红(ruthenium red,
RR)、氯丙嗪(chlorpromazine, CPZ)和三氯拉嗪
(trifluo perazine, TFP)处理, 按上述方法测定热胁迫
后烟草悬浮细胞的存活率。
植物生理学通讯 第 45卷 第 4期，2009年 4月364
所有实验均重复 3次, 每次实验的测定重复 2
次, 图中数据均为平均值 ±标准误。
实验结果
1 MS对烟草悬浮培养细胞CaM活性的影响
培养 5 d的烟草悬浮细胞经过MS处理并恢复
4 h后, 转入高温下胁迫 7 h。与未经MS处理的对
照相比, 经MS处理的烟草悬浮细胞提高了其CaM
活性, 恢复 4 h后达到最高峰(图 1)。此外, 从图 1
还可以看出, 热胁迫 7 h后, 经MS和未经MS处理
的烟草悬浮培养细胞的CaM活性都有所下降, 但经
MS处理的CaM活性高于不作MS处理的。这些表
明MS可提高烟草悬浮细胞的CaM活性, 而CaM可
能参与烟草悬浮细胞这种耐热性的形成。
3 抑制细胞CaM活性对MS诱导的烟草悬浮细胞
耐热性的影响
MS可提高烟草悬浮培养细胞的CaM活性(图
1), 诱导烟草悬浮培养细胞耐热性的形成(图 2)。
为了进一步阐明CaM参与MS诱导的烟草悬浮培养
细胞耐热性的形成, 在MS处理前, 分别用 CaM拮
抗剂CPZ和TFP预处理后, 二者都不同程度地抑制
MS诱导的烟草悬浮培养细胞耐热性的形成(图 3),
说明CaM参与MS诱导的烟草悬浮培养细胞耐热性
的形成。
2 改变细胞Ca2+水平对MS诱导的烟草悬浮细胞
耐热性的影响
从图2可以看出, 烟草悬浮细胞经MS处理后,
其在高温胁迫下的存活率提高。另外, 在MS处理
前, 分别用Ca2+、EGTA、La3+和RR预处理后, MS
诱导的烟草悬浮培养细胞耐热性可为外源 Ca2+所
加强。相反, Ca2+螯合剂 EGTA、质膜 Ca2+通道
阻塞剂La3+和胞内Ca2+通道阻断剂RR不同程度地
削弱MS诱导的烟草悬浮培养细胞耐热性的形成
(图 2)。这些结果暗示, MS可诱导烟草悬浮培养细
胞耐热性的形成, 而Ca2+参与这种耐热性的形成需
要它跨膜进入细胞和动员胞内 Ca2+库来实现。
图 3 CaM拮抗剂CPZ和 TFP对MS诱导的
烟草悬浮细胞耐热性的影响
Fig.3 Effects of CaM antagonists CPZ and TFP on MS-
induced heat tolerance in tobacco suspension culture cells
**表示 P< 0 . 0 1。
图 1 MS对烟草悬浮培养细胞CaM活性的影响
Fig.1 Effect of MS on the activity of CaM in tobacco
suspension culture cells
**表示 P<0.01。
图 2 外源 Ca2+、EGTA、La3+和 RR对MS
诱导的烟草悬浮培养细胞耐热性的影响
Fig.2 Effects of exogenous Ca2+, EGTA, La3+ and
RR on MS-induced heat tolerance in tobacco
suspension culture cells
**表示 P< 0 . 0 1。
植物生理学通讯 第 45卷 第 4期，2009年 4月 365
讨　　论
烟草悬浮培养细胞经过MS处理后, 其CaM活
性提高(图1), 烟草悬浮培养细胞耐热性的形成受到
诱发(李忠光和龚明 2008) (图 2)。并且这种耐热
性的形成可为外源Ca2+处理所强化, 为Ca2+螯合剂
EGTA、质膜 Ca2+通道阻塞剂 La3+、胞内 Ca2+通
道阻断剂 RR、以及 CaM拮抗剂 CPZ和 TFP不同
程度的削弱(图 2和 3)。表明Ca2+和CaM参与MS
诱导的烟草悬浮培养细胞耐热性的形成。
近几年来, 以Ca2+和CaM为核心的钙信使系统
在植物对多种逆境胁迫的感受、传导和适应过程
中起作用(Medvedev 2005; Plieth 2005; McAinsh和
Pittman 2009)。Gong等(1998)用表达水母发光蛋
白的转基因烟草为材料, 发现热激可诱发胞质中
Ca2+水平迅速而短暂升高, 以此作为热激信号诱导
烟草耐热性的形成; 李冰和周人纲(2004)也发现, 小
麦叶鞘组织细胞经 37 ℃热激处理, 可引起细胞质
Ca2+水平的提高, 热激4 min达到最大值, 是未热激
的3倍, 同时他们还发现热激可引起CaM基因的表
达和CaM水平的上升, 促进耐热性的获得。MS可
诱发酵母(Batiza 1996)和肌肉细胞(Calagham 1999)
中Ca2+水平的增加; 在表达水母发光蛋白的转基因
烟草幼苗中发现, 触摸和风吹等MS也可诱发细胞
内 Ca2+水平的快速增加(Trewavas和Knight 1994;
Knight等 2000; Kikuyama等 2001), 并且这种 Ca2+
水平的快速增加可为 RR所抑制, 说明MS诱发的
胞内 Ca2+的增加主要来源于胞内 Ca2+库。而本文
的实验结果则表明, 烟草悬浮培养细胞分别用Ca2+
螯合剂 EGTA、质膜 Ca2+通道阻塞剂 La3+和胞内
Ca2+通道阻断剂RR预处理后, MS诱导的烟草悬浮
培养细胞耐热性的形成受到不同程度的削弱, 说明
这种耐热性的形成不仅需要胞外 Ca2+跨膜进入细
胞, 还需要对胞内 Ca2+库进行动员(图 2)。拟南芥
经触摸、风吹、喷水等MS处理后, 触摸(TCH)基
因的表达受到促进, 并且这些基因大都编码CaM和
CaM类似蛋白(Braam和Davis 1990; Braam 2005);
McCormack和 Braam (2003)已从拟南芥中分离到
6个编码CaM和 50个编码CaM类似蛋白的基因。
Jones和Mitchell (1989)报道, 用MS处理大豆 24 h
后, 下胚轴的生长即受到抑制, 而用 CaM拮抗剂
CPZ和TFP预处理的, 则MS导致的生长抑制即可
得到缓解。本文实验结果也表明, MS可提高烟草
悬浮培养细胞的CaM活性, 并且在高温胁迫过程中
其 CaM活性始终高于未经MS处理的(图 1), 分别
用CaM拮抗剂CPZ和TFP预处理烟草悬浮培养细
胞后, MS诱导的烟草悬浮培养细胞耐热性的形成
即受到抑制(图 3)。这些结果都暗示以, Ca 2+和
CaM为核心的钙信使系统在MS诱导的烟草悬浮培
养细胞耐热性形成中可能起调控作用。
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