全 文 ：植物生理学通讯 第 46 卷 第 8 期, 2010 年 8 月 817
收稿 2010-04-07 修定 　2010-07-16
资助 湖南省科技计划项目(200 9FJ319 8)。
* 通讯作者(E-mail: zyh20@hotmail.com, qiaolzheng@
hotmail.com; Tel: 0731-88821565, 0731-88664028)。
拟南芥RopGEFs家族基因在外源脱落酸处理下的表达分析
王会, 金宇騑, 卢曼曼, 葛光君, 向芬, 李杜, 朱咏华 *, 郑巧林 *
湖南大学生物学院生物技术系, 长沙 410082
提要: ABA不同浓度和不同时间处理拟南芥野生型7天龄幼苗, 采用实时荧光定量PCR方法, 分析小G蛋白ROP10和ROP
鸟苷酸交换因子RopGEFs基因的表达水平差异。结果表明, RopGEF7~10, 12及13没有检测到表达, 而RopGEF1~6, 11, 14
及ROP10在ABA处理下表现出不同的应答趋势, 其中RopGEF5基因的表达变化与ROP10的变化相似。推测RopGEF5有
可能在 ROP10介导的ABA信号转导途经中起调控作用。
关键词: 拟南芥; 脱落酸; ROP10; RopGEFs
Expression Analysis of RopGEFs Genes in Arabidopsis thaliana Treated with
ABA
WANG Hui, JIN Yu-Fei, LU Man-Man, GE Guang-Jun, XIANG Fen, LI Du, ZHU Yong-Hua*, ZHENG Qiao-Lin*
Department of Biotechnology, College of Biology, Hunan University, Changsha 410082, China
Abstract: The real-time fluorescence quantitative PCR was carried out to analyze the expression profiles of
ROP10 (Rho-related GTPase from plants) and RopGEFs (guanine nucleotide exchange factor) genes in 7-d
seedlings of Arabidopsis thaliana in response to ABA with different concentrations or periods. The results
showed that the expression of RopGEF7-10, 12 and 13 could not be detected in wild type (Col-4) seedlings.
RopGEF1-6, 11, 14 and ROP10 indicated different expression patterns in response to ABA treatment, while
RopGEF5 showed similar expression profile to ROP10. These results suggested that RopGEF5 might act as a
regulate factor in ROP10-dependent ABA signaling pathway.
Key words: Arabidopsis thaliana; ABA; ROP10; RopGEFs
植物激素脱落酸(abscisic acid, ABA)可调节农
艺上许多重要的植物生长和发育过程, 同时, 还介
导了植物对诸如干旱、高盐、低温等环境胁迫的
生理反应。目前, 对 ABA 信号转导机制的了解较
少。在已知的与 ABA 信号转导有关的成分中, 小
G 蛋白(单体鸟苷酸结合蛋白)引人注目, 植物拥有
其独特的 ROP (Rho-related GTPase from plants)亚
家族(Vernoud 等 2003)。ROPs 作为植物生长发育
过程中重要的“分子开关”, 参与调控多种信号转导
过程(Berken 2006)。拟南芥有 11个ROPs成员, 其
中 ROP10 蛋白是 ABA 应答的特异性负调控因子
(Zheng等2002), 其介导的ABA信号转导机制还不
明确。
为了阐明与ROP10有关的ABA信号转导机制,
首先需要揭示该信号转导通路的组成结构和功能。
鸟苷酸交换因子 RopGEFs (guanine nucleotide ex-
change factor)为 ROPs 的上游调控子, 能使细胞表
面的受体样激酶受胞外信号激活后, 促进非活性
ROPs 转变为活性形式, 介导产生胞内信息(Zhang
和 McCormick 2007)。已知拟南芥基因组编码了
14 个植物特有的 RopGEFs (Berken等 2005), 为确
定是否有RopGEFs作用于ROP10上游以调控ABA
应答, 我们比较分析了 RopGEFs 及 ROP10 基因在
外源ABA处理后的表达情况。初步筛选出可能为
ROP10 上游调控子的 RopGEF, 为更详尽认识
ROP10介导的ABA信号转导通路及作用机制建立
基础。
植物生理学通讯 第 46 卷 第 8 期, 2010 年 8 月818
材料与方法
1 材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚生态型
野生型(wide type, WT) Col-4 为本实验室保存。
种子分别用70%乙醇消毒30 s和10% NaClO消毒
7 min, 无菌水清洗, 于黑暗下 4 ℃春化 4 d。用 0.1%
琼脂悬液悬浮种子后均匀点播在含 0.8% 琼脂的
MS固体培养基表面, 置于22 ℃全日照培养箱中生
长。移栽的植株则放在培养室中于长日照(光照16
h·d-1, 光照强度为 100 μmol·m-2·s-1)条件下生长。
2 方法
2.1 ABA处理 取拟南芥生长 7 天龄幼苗, 根部分
别置于含不同浓度(3、10、102、103、104、5×104、
105 nmol·L-1) ABA 的 MS 液体培养基中, 处理 4 h;
或置于含10 nmol·L-1 ABA的液体培养基中, 分别处
理不同时间(0.5、1、2、4、6、8 h)。以不含 ABA
的 MS 液体培养基处理的材料为对照。选取 40 天
龄拟南芥, 将含不同浓度ABA溶液喷洒在花上, 处
理4 h, 用透气性较好的纸袋罩住植株, 防止溶液挥
发。以不含ABA的蒸馏水喷洒的材料为对照。上
述处理后的幼苗或花以液氮速冻, 保存于-80 ℃冰
箱中用于目标基因的表达分析。
2.2 总RNA的提取 按RNAeasy Mini Kit (Ambiogen
生物技术有限公司)说明书, 分别提取拟南芥幼苗和
花的总 RNA。除去基因组 DNA, 按照 Invitrogen
M-MLV Reverse Transcriptase Instruction说明书进
行反转录, 合成cDNA的第一链, 该合成链作为实时
荧光定量PCR的模板, 用于检测ROP10和RopGEFs
基因的表达水平。
2.3 引物的设计合成 根据拟南芥基因组数据库
(TAIR-Home Page)中ROP10、RopGEFs以及ACT7
的 cDNA 序列, 设计 PCR 引物, 序列见表 1。
2.4 实时荧光定量PCR反应体系和条件 以幼苗或
花的各cDNA样品为模板, 分别用上述各组特异性
引物进行定量PCR反应。反应体系为10 μL: DEPC
水 5.4 μL、10× 缓冲液 1 μL、10 mmol·L-1 dNTPs
0.2 μL、MgCl2 0.8 μL、引物各 0.05 μL、SYBR
Green I 0.25 μL、ROX 0.05 μL、2.5 U·μL-1
JumpStart Taq 聚合酶 0.2 μL、cDNA 模板 2 μL。
其中, ROX 为被动参考染料。反应程序为: 95 ℃
10 min, 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 40个循环。
ACT7的表达水平被用作均一化的内参。未经ABA
处理的材料作为参比样本, 所有检测样品均设置 3
个重复。
表 1 引物序列
Table 1 Primer sequences
引物名称 引物序列(5 → 3) 引物名称 引物序列(5 → 3)
RopGEF1F CGAGAGTTCCAGCAGCTTCTC RopGEF1R AGTAAAATCCTCTACCAGCGACAAC
RopGEF2F CCTAGTGATTGGCCTGTCTTAACC RopGEF2R CAAGGTGCTCATCAGTCTCAATCT
RopGEF3F TTCAATTCATCGTCTGGATCGT RopGEF3R GGTTGAATCGAAATCGTTCTTTAAG
RopGEF4F CTTCGAATTCCGACCAAAATG RopGEF4R AACGTCGAACCGGTGAGATAAT
RopGEF5F GAAAATATGCGTTAATCCGTCAGA RopGEF5R CCTTTTGATGGACTGATGTTGAGT
RopGEF6F TCTCTATGATCTCTGCTTCCTTTTTTC RopGEF6R CCCTCAAACCCGATACAGCTAT
RopGEF7F CACAGACCCACTCACTGCATTT RopGEF7R GAGAACCCTTATTGTTCGATCTGATT
RopGEF8F ATTGTCGTGGAGAACGGAGATT RopGEF8R AATCATTGGAAGGCTGCTCTCT
RopGEF9F CAAAAGACATGTGAACAACTAAAATGA RopGEF9R GAAACAAAACTGGAAGGAAGATAATAGTTA
RopGEF10F AGAAGAAGAAAAACACAAAGAGA RopGEF10R ATCCTAAAACCAATGCCTGCAT
RopGEF11F TGGATGGTTCTGACAATTTGGA RopGEF11R AGGCAAAGAAGGTCGGTCAA
RopGEF12F AGCGTCGAGACCGGTTTAGA RopGEF12R CCGCAGCCGATCTTGAAA
RopGEF13F CCTCCAGCATCCAGCCAAT RopGEF13R TTTCTCTCTTGCCTGAATCTTTCTG
RopGEF14F GATGGGACAGAGACTGGTTGATTT RopGEF14R TTACTCAAACACCACAGTCTACTGCTT
ROP10F GGCCAGTTTGTGATTCTGATAAGTC ROP10R AAACATCAGGGTCACATATACAAACAG
ACT7F ATCCCTCAGVACCTTCCAAC ACT7R ACAAACTCACCACCACGAAC
植物生理学通讯 第 46 卷 第 8 期, 2010 年 8 月 819
实验结果
1 不同浓度ABA处理对拟南芥RopGEFs和ROP10
表达水平的影响
Shin等(2009)报道RopGEF7~9和13只在花中
表达, RopGEF10 和 12 主要在花和根中表达。我
们在拟南芥花中能检测到所有14个RopGEFs的表
达(图 1) , 而在幼苗中只检测到 8 个 Ro pGE Fs
(RopGEF1~6, 11, 14)的表达(图 2)。这与 Shin 等
的报道基本一致, 显示了RopGEFs表达的组织特异
性。
选取 3 个浓度(10、102、103 nmol·L-1)的 ABA
直接喷施拟南芥 4 h 后, 花中 14 个 RopGEFs 基因
及 ROP10 表达量显著降低, 浓度趋势基本一致(图
1), 而ACT7在花中的表达未受ABA的影响(结果未
显示)。可见, 花中 RopGEFs 和 ROP10 的转录水
平受 ABA 调控, 其作用机制有待进一步研究。由
于花中没有找到各 RopGEFs的 ABA应答差异, 且
Zheng等(2002)报道ROP10转录水平在根尖部位受
ABA特异性抑制, 所以我们选择采用幼苗为研究材
料进行详尽分析。
在 ROP10 介导 ABA 信号转导途径的研究中,
不同报道采取了不同的 AB A 处理浓度(0 .3~50
μmol·L-1) (Xin 等 2005; Zheng 等 2002)。为选择最
适宜的ABA处理浓度, 我们分别以从低到高的ABA
浓度(3、10、102、103、104、5×104、105 nmol·L-1)
处理 7 天龄幼苗 4 h, 实时荧光定量 PCR 检测结果
显示, RopGEF4 和 6 表达几乎没有变化, 而其他
RopGEFs的表达随ABA浓度变化显示出不同的变
化趋势(图 2)。ABA 基本抑制 RopGEF1 表达, 诱
导RopGEF2和 11表达。RopGEF3的表达在低浓度
ABA处理时受到抑制, 而ABA浓度达到 100 nmol·L-1
时却开始增加。在ABA浓度低于 10 nmol·L-1的范
围内, 随着浓度的升高, RopGEF5 和 ROP10 基因
的表达量增加; 当ABA浓度高于 10 nmol·L-1时, 随
着浓度的升高, 两个基因的表达量逐渐减少。这一
结果表明10 nmol·L-1是ROP10基因ABA处理的适
宜浓度。
2 ABA处理不同时间对拟南芥RopGEFs和ROP10
表达水平的影响
拟南芥 7天龄幼苗用ABA浓度 10 nmol·L-1分
别处理 0.5、1、2、4、6 和 8 h 后, 各 RopGEFs
的表达趋势不同(图 3)。RopGEF4和 6的表达不受
ABA影响, RopGEF1、3和 14的表达受ABA抑制,
而 RopGEF2、5 和 11的表达却基本受 ABA诱导。
RopGEF5随ABA处理时间的表达模式与ROP10仍
表现出一致性, 即在 ABA 处理 4 h 时, 两个基因的
mRNA 表达量达到最大值, 之后开始下降。
讨　　论
目前已有研究证明, ROP10 蛋白在一共有的
ABA信号转导通路中, 特异性负调控ABA的应答反
应。ROP10的质膜定位是其发挥功能的前提(Zheng
等 2002)。拟南芥基因组编码的 14 个 RopGEFs 也
定位在质膜上, 而且RopGEFs与质膜定位的受体样
蛋白激酶(receptor-like kinases, RLKs)活性复合物
有直接互作(Gu 等 2006; Zhang 和 McCormick
2007)。Trotochaud 等(1999)报道, ROPs 蛋白似乎
也与 RLKs 活性复合物相关。Osakabe 等(2010)已
证明, 一个受体蛋白激酶RPK1参与了ABA信号转
导过程。所以, 我们推测 RLK 有可能作为一个质
膜定位的受体, 通过 RopGEFs 来调控 ROP10。
本文以不同浓度ABA处理拟南芥野生型7天
龄幼苗 4 h, 对其 RopGEFs 和 ROP10 的 mRNA 水
平进行分析。RopGEF7~10, 12 和 13 主要在花中
表达, 因此从可检测到的 RopGEF1~6, 11 和 14 的
mRNA 水平看, RopGEF5 的表达值得关注, 不同
ABA浓度下RopGEF5的表达变化体现出和ROP10
类似的模式。同样, 当我们用 10 nmol·L-1 ABA 处
理幼苗以不同时间, 它们也表现出相似的表达趋
势。这暗示RopGEF5有可能在ROP10介导的ABA
信号转导途经中起调控作用。可通过蛋白质 - 蛋
白质相互作用研究及RopGEF5和ROP10突变体表
型、相关基因的表达水平分析等研究进一步验证
此推论。
Xin等(2005)指出, ROP10 在渗透胁迫和盐胁
植物生理学通讯 第 46 卷 第 8 期, 2010 年 8 月820
图 1 不同浓度 ABA处理拟南芥花后的 ROP10 和 RopGEFs 基因表达
Fig.1 Different expression profiles of ROP10 and RopGEFs genes in A. thaliana flowers
in response to different concentrations of ABA
迫应答中起负调控作用。最近, Shin 等(2009)发现
RopGEF5的表达量在盐和干旱胁迫下显著增加, 热
胁迫时降低。有些非生物胁迫的信号转导过程由
ABA 介导或关联(Chinnusamy等 2004)。这些研究
结果也暗示RopGEF5与ROP10作用, 参与ABA应
答。对其作用机制的阐述还有待进一步研究。
植物生理学通讯 第 46 卷 第 8 期, 2010 年 8 月 821
图 2 不同浓度 ABA处理拟南芥幼苗后的 ROP10 和 RopGEFs 基因表达
Fig.2 Different expression profiles of ROP10 and RopGEFs genes in A. thaliana seedlings
in response to different concentrations of ABA
植物生理学通讯 第 46 卷 第 8 期, 2010 年 8 月822
图 3 ABA (10 nmol·L-1)处理拟南芥幼苗不同时间后的 ROP10 和 RopGEFs 基因表达
Fig.3 Different expression profiles of ROP10 and RopGEFs genes in A. thaliana seedling
in response to 10 nmol·L-1 ABA treatment with different periods
植物生理学通讯 第 46 卷 第 8 期, 2010 年 8 月 823
参考文献
Berken A (2006). ROPs in the spotlight of plant signal transduction.
Cell Mol Life Sci, 63: 2446~2459
Berken A, Thomas C, Wittinghofer A (2005). A new family of
RhoGEFs activates the Rop molecular switch in plants.
Nature, 436: 1176~1180
Chinnusamy V, Schumaker K, Zhu JK (2004). Molecular genetic
perspectives on cross-talk and specificity in abiotic stress
signalling in plants. J Exp Bot, 55: 225~236
Gu Y, Li S, Lord EM, Yang Z (2006). Members of a novel class of
Arabidopsis Rho guanine nucleotide exchange factors control
Rho G TPase-dependent polar growth. Plant Cell , 18:
366~381
Osakabe Y, Mizuno S, Tanaka H, Maruyama K, Osakabe K, Todaka
D, Fujita Y, Kobayashi M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki
K (2010). Overproduction of the membrane-bound recep-
tor-like protein k inase 1, RPK1, enhances abiotic stress
tolerance in Arabidopsis. J Biol Chem, 285: 9190~9201
Shin DH, Kim TL, Kwon YK, Cho MH, Yoo J, Jeon JS, Hahn TR,
Bhoo SH (2009). Characterization of Arabidopsis RopGEF
family genes in response to abiotic stresses. Plant Biotechnol
Rep, 3: 183~190
Trotochaud AE, Hao T, Wu G, Yang Z, Clark SE (1999). The
CLAVATA1 receptor-like kinase requires CLAVATA3 for its
assembly into a signaling complex that includes KAPP and a
Rho-related protein. Plant Cell, 11: 393~406
Vernoud V, Horton AC, Yang Z, Nielsen E (2003). Analysis of the
small GTPase gene superfamily of Arabidopsis thaliana.
Plant Physiol, 131: 1191~1208
Xin Z, Zhao Y, Zheng ZL (2005). Transcriptome analysis reveals
specific modulation of abscisic acid signaling by ROP10 small
GTPase in Arabidopsis. Plant Physiol, 139: 1350~1365
Zhang Y, McCormick S (2007). A distinct mechanism regulating
a pollen-specific guanine nucleotide exchange factor for the
small GTPase Rop in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad
Sci USA, 104: 18830~18835
Zheng ZL, Nafisi M, Tam A, Li H, Crowell DN, Chary SN,
Schroeder JI, Shen J, Yang Z (2002). Plasma membrane-
associated ROP10 small GTPase is a specific negative regu-
lator of abscisic acid responses in Arabidopsis. Plant Cell,
14: 2787~2797