全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (2): 173~180 173
收稿 2011-10-09　　修定 2011-12-05
资助 国家重点基础研究发展计划(2009CB118500)和国家自然
科学基金(30571125和30671451)。
* 通讯作者(E-mail: gaohy@sdau.edu.cn; Tel: 0538-8245985)。
CuCl2胁迫对烟草BY-2悬浮细胞死亡的诱导
孙学娟, 刘美君, 高辉远*, 杨程, 张子山, 孟庆伟
山东农业大学生命科学学院, 作物生物学国家重点实验室, 山东泰安271000
摘要: 本文以不含叶绿体的烟草BY-2悬浮细胞系为实验材料, 研究了CuCl2胁迫对BY-2细胞呼吸速率、呼吸途径以及细胞
内H2O2和ATP含量的影响。结果表明: 0.5 mmol·L
-1 CuCl2胁迫明显导致了烟草BY-2细胞的死亡, 引起了胞内H2O2爆发和
ATP含量下降, 严重抑制了BY-2细胞的总呼吸和交替氧化酶途径(alternative oxidase pathway, AOX)。此外, CuCl2对BY-2细
胞的线粒体电子传递具有即时的抑制作用。加入外源腺苷(ATP合成的底物)显著抑制了CuCl2胁迫引起的ATP损耗, 并阻止
了细胞死亡。上述结果表明CuCl2 胁迫导致的ATP损耗在CuCl2诱导烟草BY-2细胞死亡过程中起重要的作用。
关键词: 烟草BY-2悬浮细胞; CuCl2胁迫; ROS爆发; ATP损耗; 呼吸速率; AOX途径
Cell Death Induced by CuCl2 Stress in Tobacco BY-2 Cells
SUN Xue-Juan, LIU Mei-Jun, GAO Hui-Yuan*, YANG Cheng, ZHANG Zi-Shan, MENG Qing-Wei
State Key Lab of Crop Biology, College of Life Sciences, Shandong Agricultural University, Tai’an, Shandong 271018, China
Abstract: The tobacco BY-2 cells without chloroplast were used in this study to explore the mechanism of the
cell death induced by CuCl2. The effects of CuCl2 stress on the respiration rate and alternative oxidase pathway
were studied in tobacco BY-2 cells treated with 0.5 mmol·L-1 CuCl2. The results showed that 0.5 mmol·L
-1
CuCl2 led to remarkable cell death, overproduction of reactive oxygen species, a rapid depletion of ATP, signifi-
cant declines in respiration and in alternative oxidase pathway (AOX) in tobacco BY-2 cells. Moreover, the ad-
dition of exogenous adenosine with CuCl2 significantly inhibited ATP depletion and prevented cell death. The
data presented here demonstrated that the ATP depletion played an important role in CuCl2-induced cell death in
the tobacco BY-2 cells.
Key words: tobacco BY-2 cells; CuCl2 stress; ROS burst; ATP depletion; respiration rate; AOX pathway
近年来随着工业化、三废的排放、矿产的开
发和利用、污水灌溉以及农药、除草剂和化肥的
使用等, 重金属对土壤的污染日趋严重, 许多地方
土壤中的铜离子含量已超出植物可正常利用的范
围。不少学者的研究表明, 过量的铜抑制植物的
生长发育, 影响光合作用, 导致叶绿素降解等(Bac-
couch等1998; Rooney等2006, 2007), 还有学者观察
到铜胁迫能改变植物体内的抗氧化系统, 导致植
物体内活性氧(reactive oxygen species, ROS)过量
产生, 致使ROS的产生量超出超氧化物歧化酶(su-
peroxide dismutase, SOD)和过氧化物酶(peroxidase,
POD)等抗氧化系统的清除能力(刘登义等2002; 储
玲等2004; Chamseddine等2009)。此外, Meharg
(1994)的研究表明, 铜能够通过Fenton型Haber-
weiss反应增加ROS的产生, 导致ROS过量积累、引
起代谢紊乱。Pádua等(1999)的研究则表明, 少量
的铜可以诱导悬铃木细胞内AOX蛋白的合成, 并
减少细胞内ROS的产生。显然, 铜对植物体内ROS
的产生的影响是个复杂过程, 它会因为铜的不同
浓度或不同植物而表现不一样的规律。虽然有不
少学者已经研究了铜胁迫对植物的影响, 但是对
铜胁迫造成植物细胞死亡原因尚缺乏深入研究。
迄今为止, 已有大量的研究致力于寻找逆境
胁迫导致的植物和动物细胞死亡的关键因素(Lin
等2006; Yin等2006; Watabe和Nakaki 2007)。Cheng
等(2011)的研究证明ROS爆发在AT毒素诱导的烟
草细胞死亡中起着关键作用。但是Wang等(2008)
和Sasabe等(2000)的研究表明ROS爆发不是寡聚糖
和INF1激发子诱导烟草悬浮细胞细胞死亡的关键
因素。另外, 由于ATP是细胞代谢所需的直接能
量, 且它本身也是一种很重要的信号分子, 因此ATP
植物生理学报174
的代谢在细胞生长发育过程中具有重要的作用。
有报道指出ATP损耗可能是苯甲基腺苷(benzylad-
enosine)诱导烟草BY-2 细胞死亡的关键因素(Mle-
jnek等2003); 还有研究指出, 与ROS相比, ATP损耗
在呼吸抑制剂所诱导的人体多巴胺细胞的程序化
死亡(PCD)过程中起更重要的作用(Watabe和Naka-
ki 2007)。迄今为止, 对于逆境胁迫导致细胞死亡
的关键因素还存在争议, 而且对CuCl2胁迫诱导植
物细胞死亡的机理尚未见报道。
线粒体是逆境胁迫的主要攻击位点之一(Jones
2000; Lam等2001), 且线粒体作为能量和物质代谢
的枢纽, 在植物物生长代谢过程中有重要作用。
所以从呼吸角度研究CuCl2胁迫对植物的毒害机理
有重要意义。为了研究线粒体产生的ROS和ATP
在CuCl2胁迫诱导的细胞死亡中的作用, 我们选用
了不具有功能性叶绿体的烟草BY-2悬浮细胞系作
为实验材料, 用BY-2悬浮细胞作为研究材料可以
避免光合作用过程介导的ROS和ATP的产生对细
胞死亡的影响, 将研究重点集中在CuCl2胁迫对细
胞呼吸途径的影响和呼吸作用介导的ROS产生和
ATP合成对细胞死亡的影响, 其研究结果有助于加
深人们对呼吸作用在CuCl2胁迫诱导的细胞死亡中
作用的认识。
材料与方法
1 烟草BY-2细胞的培养和CuCl2胁迫处理
烟草(Nicotiana tabacum Linn) BY-2悬浮细胞
在改良的LS培养基中于27 ℃、135 rpm黑暗条件
下培养(Linsmaier和Skoog 1965)。以处于生长对
数期(3-d)的烟草BY-2悬浮细胞为实验材料, 细胞
在处理前过滤至新配制的培养基中, 进行预培养
等待处理。
本实验采用0.5 mmol·L-1 CuCl2 (本文各种处
理所用的浓度均为培养液中的最终浓度)对处于对
数期的烟草BY-2悬浮细胞进行胁迫处理。以未经
任何处理的对数期烟草BY-2悬浮细胞为对照。
2 烟草BY-2细胞生长及细胞死亡率的测定
经CuCl2胁迫0、1、3、5和7 d后, 烘干烟草
BY-2细胞, 称量干重, 以干重的增长量表示细胞的
生长速率。每个处理重复3次。
分别称取0.5 g对照和处理的烟草细胞, 在室
温下, 用0.025% (W/V)埃文斯蓝中染色5 min, 接着
用100 mmol·L-1 CaCl2 (pH 5.6)缓冲液冲洗至无
色。死亡的细胞不能把埃文斯蓝排除在细胞外部,
因此细胞核被染成蓝色, 相反, 活细胞核不被染
色。然后, 细胞用4 mL 1%的十二烷基磺酸纳(SDS)
(50%甲醇配成)在 50 ℃下保温0.5 h后, 加入2 mL
蒸馏水稀释, 然后细胞悬浮液在10 000×g条件下离
心10 min, 用UV2500分光光度计(岛津, 日本)在600
nm处测定离心后上清液的吸光值计算细胞死亡
率, 以测定的吸光度数值的大小来代表细胞的相
对死亡率(Levine等1994), 以高温(100 ℃)处理1 h
后细胞的死亡率为100%, 其它处理细胞的死亡率
换算成高温处理细胞死亡率的百分数。
3 烟草BY-2细胞膜伤害度的测定
烟草BY-2细胞经CuCl2胁迫0、3、6、9和12 h
后, 接着于10 000×g条件下离心10 min, 用DDS-307
型电导仪(精科雷磁, 上海)测定上清液的初电导
(S1)。然后, 将细胞置沸水浴10 min, 冷却至室温,
放置20 min, 测终电导(S2)。计算相对电导度(L)=
S1/S2, 由胁迫而产生的细胞电解质外渗称为伤害
度, 其伤害度(%)=(Lt-Lck)×100/(1-Lck)。其中Lt和
Lck分别为处理细胞和对照细胞的相对电导度。
4 烟草BY-2细胞线粒体的提取及细胞和线粒体中
总呼吸速率和AOX途径呼吸速率的测定
首先用提取液[0.4 mol·L-1甘露醇、1 mmol·L-1
EGTA、10 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 7.4)、0.1% (W/
V) BSA和1% (W/V) PVP-40]研磨烟草BY-2细胞, 接
着于2 500×g离心10 min, 上清液再于18 000×g离心
12 min, 将沉淀于甘露醇缓冲液[0.4 mol·L-1甘露
醇、10 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 7.4)和1 mmol·L-1
EGTA]中重新悬浮以获得线粒体粗提液(Millar等
2001)用于实验。为保证实验的一致性, 每次都使
用10 mg·mL-1蛋白的线粒体粗提液进行线粒体呼
吸测定。线粒体蛋白质含量的测定参照Bradford
(1976)方法。
用Oxytherm氧电极(Hansatech, 英国)按照
Cheng等(2011)的方法来测定烟草BY-2细胞和线粒
体的总呼吸速率及AOX呼吸途径。所有的呼吸速
率值均于(25±0.02) ℃恒温条件下测定, 测定液的
温度由Oxytherm氧电极的半导体控温装置控制。
在细胞/线粒体中加入40 mmol·L-1 KCN (终浓度)
孙学娟等: CuCl2胁迫对烟草BY-2悬浮细胞死亡的诱导 175
抑制细胞色素呼吸途径后, 测定的细胞/线粒体的
剩余呼吸速率为AOX途径呼吸速率(Robson和Van-
lerberghe 2002)。
在测定线粒体呼吸时 , 缓冲液中须加入10
mmol·L-1电子传递链复合体II的底物琥珀酸钠。
5 烟草BY-2细胞内H2O2浓度及ATP含量的测定
经CuCl2胁迫后, 取3 g烟草BY-2细胞用5 mL
5% (W/V)三氯乙酸(TCA)磨样, 接着在12 000×g条
件下离心10 min (Patterson等1984)。上清液用于H2O2
的测定, H2O2的测定采用Patterson等(1984)方法。
1 mmol·L-1腺苷(Sigma, 美国)与CuCl2一起加
入到烟草BY-2细胞悬浮体系中以抑制由CuCl2胁
迫所引起的ATP损耗。ATP含量和细胞死亡率均
于CuCl2胁迫后12 h测定。胞内ATP含量采用ATP
生物体发光检测试剂盒测定(Peng等2009)。2 g烟
草BY-2细胞于2 mmol·L-1 MgSO4溶液中裂解, 30 ºC
水浴保温10 min。裂解液于12 000×g离心, 上清液
用于ATP含量的测定。ATP含量以对照中含量的
百分数表示。
实验结果
1 CuCl2胁迫对烟草BY-2细胞生长的抑制作用
随着时间的延长, 对照细胞的干重逐渐增加,
然而CuCl2胁迫的BY-2细胞的生长完全受到了抑
制(图1)。7 d后, 对照细胞的干重已经增长到处理
前的2.8倍, 达到0.515 g; 而CuCl2胁迫的干重仅为
处理前的0.6倍, 只有0.121 g。
2 CuCl2胁迫对烟草BY-2细胞死亡率和对细胞膜
伤害的影响
随着CuCl2胁迫时间的延长, 烟草BY-2细胞的
死亡率逐渐增加。CuCl2胁迫3、6、9和12 h时, 烟
草BY-2细胞死亡率比对照分别增加了17.7%、
36.4%、49.1%和69.7% (图2-A)。而随着时间的延
长, CuCl2胁迫对BY-2细胞膜的伤害度也逐渐增加,
到12 h时细胞膜伤害度增加到对照的30% (图2-B)。
3 CuCl2胁迫对烟草BY-2细胞总呼吸速率和AOX
途径呼吸速率的影响
CuCl2显著地抑制烟草BY-2细胞总呼吸速率
(图3-A)及AOX呼吸途径(图3-B)。经过CuCl2胁迫
图1 CuCl2胁迫对烟草BY-2细胞生长的影响
Fig.1 Effect of CuCl2 on growth of tobacco BY-2 cells
实验数据为3次独立测定的平均结果, 下图同此。
图2 CuCl2胁迫对烟草BY-2细胞死亡率和细胞膜伤害度的影响
Fig.2 Effect of CuCl2 on death of tobacco BY-2 cells and damage of cell membrane
植物生理学报176
12 h后, 烟草BY-2细胞总呼吸速率和AOX途径比
对照分别下降了88.9%和90.4%。
4 CuCl2胁迫对线粒体总呼吸速率和AOX途径呼
吸速率的影响
为排除上游碳代谢对细胞呼吸的影响, 我们
测定了细胞线粒体的总呼吸速率(图4-A)和AOX
途径的呼吸速率(图4-B)。图4为不同条件下细胞
线粒体耗氧动态曲线, 图中直线斜率越大, 表明呼
吸速率越大。如图4-A所示, 加入CuCl2后, 直线
斜率立即下降, 表明CuCl2即时抑制了线粒体的总
呼吸速率, 抑制程度达到30.4%。图4-B显示, 加
入CuCl2后, 即时抑制了AOX途径的呼吸速率, 抑
制程度达到24.5%。这些结果说明在呼吸底物不
变的情况下, CuCl2对于烟草BY-2细胞线粒体的
总呼吸和AOX途径呼吸都具有即时的直接抑制
作用。
图4 CuCl2胁迫对烟草BY-2细胞线粒体总呼吸速率和AOX途径呼吸速率的影响
Fig.4 Effects of CuCl2 on respiratory and AOX pathway capacity in mitochondria of tobacco BY-2 cells
图中箭头表示加入标记物质的起始时间。图中数字代表计算出的线粒体呼吸速率。
图3 CuCl2胁迫对烟草BY-2细胞细胞总呼吸速率和AOX途径呼吸速率的影响
Fig.3 Effects of CuCl2 on respiratory and AOX pathway capacity in tobacco BY-2 cells
孙学娟等: CuCl2胁迫对烟草BY-2悬浮细胞死亡的诱导 177
5 CuCl2胁迫及外加腺苷对烟草BY-2细胞胞内产
生活性氧的影响
线粒体电子传递链泄漏出来的电子与胞内分
子氧反应可以导致超氧阴离子的产生, 随后在细
胞中转化为H2O2 (Fleury等2002)。由于H2O2是活
性氧中最稳定的一种, 所以我们通过监测H2O2的
变化来反映CuCl2处理后烟草BY-2细胞ROS的变
化。与对照相比, 在CuCl2胁迫0.5 h时, 烟草细胞内
的H2O2水平增加到了对照水平的5.9倍, 达到峰值;
在处理1 h后, H2O2含量已经接近对照水平(图5)。
而在CuCl2胁迫的同时外加1 mmol·L
-1腺苷显
著抑制了烟草BY-2细胞内H2O2的爆发, 处理0.5 h
时, 烟草细胞内的H2O2含量与对照细胞没有显著
性差异(图5)。 CuCl2胁迫引起的ATP损耗, 当同时加入外源腺苷
和CuCl2时, 胞内ATP含量增加到对照细胞的89%
(图7-A)。同时加入外源腺苷也完全抑制了CuCl2
胁迫诱导的细胞死亡, 单独加腺苷时, 细胞死亡率
与对照基本一致。当同时加入外源腺苷和CuCl2
时, 细胞死亡率比CuCl2胁迫时降低了82.9% (图
7-B)。这说明CuCl2胁迫导致的ATP损耗是诱导烟
草BY-2细胞死亡的关键原因之一。
讨　　论
现已知道, Cu2+胁迫能够严重抑制植物的生长
(廖国礼和吴超2006), Cu2+对植物生长的抑制既可
以通过抑制光合作用造成(柯文山等2007), 也可能
是呼吸被抑制的结果。为了排除Cu2+对光合作用
的影响, 我们选择了没有叶绿体的烟草BY-2细胞,
从呼吸角度分析铜胁迫抑制细胞生长的机理。结
果表明在没有光合作用的前提下, Cu2+胁迫能够显
著抑制BY-2细胞的生长(图1), 这种抑制作用主要
是通过抑制呼吸作用所造成的, 因为呼吸作用是
细胞能量代谢和物质代谢的枢纽 , 呼吸受抑后 ,
ATP合成受阻(图6), 细胞的各种代谢紊乱, 进而抑
制细胞的生长。而加入外源腺苷后抑制了细胞死
亡(图7)的这一事实证明了Cu2+胁迫导致的ATP合
成受阻是造成BY-2细胞死亡的重要原因。
逆境胁迫对细胞呼吸作用的抑制, 既可以通
过抑制呼吸底物的供应也可以通过抑制呼吸电子
传递来完成(Dudkina等2006)。为了深入探讨Cu2+
对呼吸的抑制作用, 我们排除了呼吸底物的干扰,
图5 CuCl2及外加腺苷对烟草BY-2细胞内H2O2浓度的影响
Fig.5 Effects of CuCl2 and addition of exogenous adenosine
on H2O2 contents in tobacco BY-2 cells
6 CuCl2胁迫对烟草BY-2细胞胞内ATP含量的影响
CuCl2胁迫后, 烟草BY-2细胞内ATP含量逐渐
降低, 在胁迫了3、6、9和12 h 后, 与对照细胞胞内
ATP含量相比, 处理细胞的胞内ATP水平分别降到
了对照的88.6%、65.1%、48.7%、22.1% (图6)。
CuCl2胁迫对细胞呼吸作用的抑制(图3)与
CuCl2胁迫导致的ATP损耗的结果相一致, 而且细
胞呼吸是胞内ATP产生的主要途径 , 这就说明
CuCl2胁迫对细胞呼吸的抑制可能是导致胞内ATP
含量下降的原因之一。
7 CuCl2胁迫诱导的ATP损耗在细胞死亡中的作用
加入外源腺苷到细胞悬浮液中可以有效阻止
图6 CuCl2胁迫对烟草胞内ATP相对含量的影响
Fig.6 Effects of CuCl2 on relative content of ATP
in tobacco BY-2 cells
植物生理学报178
研究了在外加底物琥珀酸钠的条件下, CuCl2胁迫
对线粒体呼吸的直接影响。CuCl2胁迫能够快速地
抑制烟草BY-2细胞线粒体的呼吸作用的事实(图
4-A)表明CuCl2胁迫可能通过某种方式阻断线粒体
的电子传递链, 进而影响细胞呼吸, 最终导致烟草
BY-2细胞的生长受阻。
植物在正常生长条件下, 呼吸电子传递主要
通过细胞色素途径进行, 但处于环境胁迫下由于
呼吸底物和ADP的限制导致了植物细胞色素途径
活性的下降, 许多研究表明在环境胁迫(低温、干
旱、盐胁迫等)下AOX呼吸途径活性显著增强, 因
此认为AOX呼吸途径的增强与植物对环境胁迫的
适应性相关。AOX途径作为一种非磷酸化途径,
不会因ADP的缺乏而限制AOX呼吸途径的进行,
它可以快速的氧化还原性物质(NADPH和NADH)
而不受线粒体跨膜质子梯度及ADP/ATP比值的影
响(Yoshida等2007), 并可以减少细胞内ROS的产生
(Feng等2008)。Robson和Vanlerberghe (2002)的研
究证明, 在缺失AOX的转基因烟草细胞中, 在不同
逆境的诱导处理之后, AOX的缺失会导致这些细
胞对死亡的发生有更高的敏感性。本实验中CuCl2
胁迫对AOX途径具有明显的抑制作用(图3-B、图
4-B), CuCl2胁迫对AOX途径的抑制作用降低了
AOX对细胞的保护作用, 使细胞发生死亡的可能
性提高, 这与烟草BY-2细胞经过CuCl2胁迫后导致
的死亡率升高相吻合。所以AOX途径被抑制可能
是导致烟草BY-2细胞的生长受阻的原因之一。
我们发现在CuCl2胁迫细胞30 min后, H2O2含
量急剧增加, 增加到了对照水平的5.9倍, 形成ROS
的爆发, 在胁迫1 h左右后, H2O2含量已经与对照水
平接近并且一直保持到测定结束(图5)。但细胞死
亡率却随着时间的延长而加剧(图2-A), 这说明细
胞的死亡并不是H2O2持续积累所导致的直接氧化
结果。但是我们不能排除ROS的爆发可能与细胞
死亡有一定的关系。有文献指出, ROS爆发能够参
与多种信号转导途径如MAPK信号转导过程(Jon-
ak等2002; Kovtun等2000)。Cheng等(2011)的研究
表明, ROS爆发与AT毒素所诱导的烟草BY-2细胞
程序化死亡有密切的关系。此外, Bethke和Jones
(2001)的研究也表明ROS爆发是赤霉素诱导的大
麦糊粉细胞死亡的关键因素。CuCl2胁迫0.5 h后,
H2O2的爆发可能作为一种信号启动细胞死亡相关
的机制。ROS爆发在启动细胞死亡过程中的详细
机制是个非常复杂信号转导网络系统(Apel和Hirt
2004), 本实验的数据还不足以说明ROS爆发在
CuCl2胁迫诱导烟草BY-2细胞死亡方面的精确作
用。关于CuCl2胁迫后的H2O2爆发是否参与了
BY-2细胞死亡的启动, 还有待于进一步研究。
我们通过外加腺苷来探讨ATP损耗在诱导烟
草BY-2细胞死亡中的作用。结果表明: 加入外源
腺苷后几乎完全抑制了铜胁迫所诱导的烟草BY-2
细胞中ATP损耗的发生, 并且阻止了铜胁迫诱导的
图7 CuCl2胁迫下外源腺苷对烟草BY-2细胞胞内ATP相对含量和细胞死亡率的影响
Fig.7 Effects of addition of exogenous adenosine on the intracellular ATP level and cell death
in tobacco BY-2 cells under CuCl2 treatment
孙学娟等: CuCl2胁迫对烟草BY-2悬浮细胞死亡的诱导 179
烟草细胞死亡率的升高(图7)。这个结果表明铜胁
迫所诱导的ATP损耗在诱导烟草BY-2细胞死亡过
程中起至关重要的作用。Chivasa等(2005)在烟曲
霉毒素B1诱导拟南芥细胞死亡的研究中也得出了
相似的结论, 即ATP损耗在B1诱导拟南芥细胞死亡
过程中起着关键作用。但是值得关注的是, 加入
外源腺苷后不仅后显著抑制了ATP的损耗, 同时还
抑制了ROS的爆发(图5)。这说明ROS的爆发是由
ATP损耗所造成的。但是本研究的结果还不足以
证明ATP的损耗是导致BY-2细胞死亡的直接原因,
因为ATP的损耗还可能通过诱导ROS的爆发间接
启动BY-2细胞死亡。
总之, 我们的研究结果表明CuCl2胁迫能够显
著抑制细胞生长, 增加细胞死亡率, 诱导ROS爆
发。CuCl2胁迫抑制线粒体呼吸及所诱导ATP损耗
在BY-2细胞死亡过程中起至关重要的作用。关于
CuCl2胁迫诱导BY-2细胞死亡的详细机制, 还需做
更多深入的研究。
参考文献
储玲, 刘登义, 王友保, 李影, 刘慧君(2004). 铜污染对三叶草幼苗生
长及活性氧代谢影响研究. 应用生态学报, 1 (15): 120~122
刘登义, 王友保, 张徐祥, 司琴(2002). 污灌对小麦幼苗生长及活性
氧代谢的影响. 应用生态学报, 13 (2): 179~182
廖国礼, 吴超(2006). 资源开发环境重金属污染与控制. 长沙: 中南
大学出版社
柯文山, 熊治廷, 柯世省, 金则新(2007). 铜毒对海州香薷(Elsholtzia
splendens)不同种群光合作用和蒸腾作用的影响. 生态学报,
27 (4): 1368~1375
Apel K, Hirt H (2004). Reactive oxygen species: metabolism, oxida-
tive stress, and signal transduction. Annu Rev Plant Biol, 55:
373~399
Baccouch S, Chaoui A, El Ferjani E (1998). Nickel toxicity effects on
growth and metabolism of maize. J Plant Nutr, 21: 577~588
Bethke PC, Jones RL (2001). Cell death of barley aleurone protoplasts
is mediated by reactive oxygen species. Plant J, 25 (1): 19~29
Bradford MM (1976). A rapid and sensitive method for quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-
dye binding. Anal Biochem, 72: 248~254
Chamseddine M, Wided BA, Guy H, Marie-Edith C, Fatma J (2009).
Cadmium and copper induction of oxidative stress and antioxi-
dative response in tomato (Solanum lycopersicon) leaves. Plant
Growth Regul, 57: 89~99
Cheng DD, Jia YJ, Gao HY, Zhang LT, Zhang ZS, Xue ZC, Meng QW
(2011). Characterization of the programmed cell death induced
by metabolic products of Alternaria alternata in tobacco BY-2
cells. Physiol Plant, 141: 117~129
Chivasa S, Ndimba BK, Simon WJ, Lindsey K, Slabas AR (2005).
Extracellular ATP functions as an endogenous external metabo-
lite regulating plant cell viability. Plant Cell, 17: 3019~3034
Dudkina NV, Heinemeyer J, Sunderhaus S, Boekema1 EJ, Braun H
(2006). Respiratory chain supercomplexes in the plant mitochon-
drial membrane. Trends Plant Sci, 11 (5): 232~240
Feng HQ, Duan JG, Li HY, Liang HG, Li X, Han N (2008), Alterna-
tive respiratory pathway under drought is partially mediated by
hydrogen peroxide and contributes to antioxidant protection in
wheat leaves. Plant Prod Sci, 11: 59~66
Fleury C, Mignotte B, Vayssière JL (2002). Mitochondrial reactive
oxygen species in cell death signaling. Biochimie, 84: 131~141
Jonak C, Ökrész L, Bögre L, Hirt H (2002). Complexity, cross talk
and integration of plant MAP kinase signaling. Plant Biol, 5:
415~424
Jones A (2000). Does the plant mitochondrion integrate cellular
stress and regulate programmed cell death? Trends Plant Sci, 5:
225~230
Kovtun Y, Chiu WL, Tena G, Sheen J (2000).Functional analysis of
oxidative stress-activated mitogen-activated protein kinase cas-
cade in plants. Proc Natl Acad Sci USA, 97: 2940~2944
Lam E, Kato N, Lawton M (2001). Programmed cell death, mitochon-
dria and the plant hypersensitive response. Nature, 411: 848~853
Levine A, Tenhaken R, Dixon R, Lamb C (1994). H2O2 from the oxi-
dative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resis-
tance response. Cell, 79: 583~593
Lin JS, Wang Y, Wang GX (2006). Salt stress-induced programmed
cell death in tobacco protoplasts is mediated by reactive oxygen
species and mitochondrial permeability transition pore status. J
Plant Physiol, 163: 731~739
Linsmaier EM, Skoog F (1965). Organic growth factor requirements
of tobacco tissue cultures. Physiol Plant, 18: 100~127
Meharg AA (1994). Integrated tolerance mechanisms: constitutive and
adaptive plant responses to elevated metal concentrations in the
environment. Plant Cell Environ, 17: 989~993
Millar AH, Sweetlove LJ, Giege P, Leaver CJ (2001). Analysis of
the Arabidopsis mitochondrial proteome. Plant Physiol, 127:
1711~1727
Mlejnek P, Doležel P, Procházka S (2003). Intracellular phosphoryla-
tion of benzyladenosine is related to apoptosis induction in to-
bacco BY-2 cells. Plant Cell Environ, 26: 1723~1735
Pádua M, Aubert S, Casimiro A, Bligny R, Millag H, Day DA(1999).
Induction of alternative oxidase by excess copper in sycamore
cell suspensions. Plant Physiol Biochem, 37 (2): 131~137
Patterson BD, Macrae EA, Ferguson IB (1984). Estimation of hydro-
gen peroxide in plant extracts using Titanium (IV). Anal Bio-
植物生理学报180
chem, 139: 487~492
Peng XJ, Li FH, Li SQ, Zhu YG (2009). Expression of a mitochon-
drial gene orfH79 from the CMS-HongLian rice inhibits Saccha-
romyces cerevisiae growth and causes excessive ROS accumula-
tion and decrease in ATP. Biotechnol Lett, 31 (3): 409~414
Robson CA, Vanlerberghe GC (2002). Transgenic plant cells lacking
mitochondrial alternative oxidase have increased susceptibility
to mitochondria-dependent and -independent pathways of pro-
grammed cell death. Plant Physiol, 129: 1908~1920
Rooney CP, Zhao FJ, McGrath SP (2006). Soil factors controlling the
expression of copper toxicity to plants in a wide range of Euro-
pean soils. Environ Toxicol Chem, 25: 726~732
Rooney CP, Zhao FJ, McGrath SP (2007). Phytotoxicity of nickel in a
range of European soils :influence of soil properties, Ni solubil-
ity and speciation. Environ Pollut, 145: 596~605
Sasabe M, Takeuchi K, Kamoun S, Ichinose Y, Govers F, Toyoda K,
Shiraishi T, Yamada T (2000). Independent pathways leading to
apoptotic cell death, oxidative burst and defense gene expression
in response to elicitin in tobacco cell suspension culture. Eur J
Biochem, 267: 5005~5013
Wang WX, Li SG, Zhao XM, Du YG, Lin BC (2008). Oligochitosan
induces cell death and hydrogen peroxide accumulation in to-
bacco suspension cells. Pestic Biochem Physiol, 90: 106~113
Watabe M, Nakaki T (2007). ATP depletion does not account for
apoptosis induced by inhibition of mitochondrial electron trans-
port chain in human dopaminergic cells. Neuropharmacology,
52: 536~541
Yin LY, Huang JQ, Li W, Liu YD (2006). Microcystin-RR-induced
apoptosis in tobacco BY-2 cells. Toxicon, 48: 204~210
Yoshida K, Terashima I, Noguchi K (2007). Up-regulation of mito-
chondrial alternative oxidase concomitant with chloroplast over-
reduction by excess light. Plant Cell Physiol, 48: 606~614