全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (7): 1125~1132　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0215 1125
收稿 2015-04-14　　修定 2015-06-01
资助 云南省自然科学基金重点项目(2015FA029)和植物分子遗
传国家重点实验室。
* 共同第一作者。
** 通讯作者(E-mail: biochem@mail.kib.ac.cn; Tel: 0871-
65223210)。
毛萼香茶菜二萜合酶IeCPS的立体特异性研究
杜刚1,3,*, 龚海艳1,*, 高娟1, 付小莉1, 卢山2, 曾英1,**
1中国科学院昆明植物研究所, 植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室, 昆明 650201; 2南京大学生命科学学院,
南京210093; 3中国科学院大学, 北京 100049
摘要: 对映-贝壳杉烷型二萜是药用植物香茶菜抗菌抗肿瘤的核心组分, 其生物合成的酶分子机制尚未完全明了。前期我
们克隆并鉴定了毛萼香茶菜二萜合酶柯巴基焦磷酸合酶基因IeCPS1和IeCPS2。本文通过与拟南芥对映-贝壳杉烯二萜合
酶AtKS配对进行偶联反应, 以及GC-MS鉴定酶联反应产物, 证实毛萼香茶菜二萜合酶IeCPS1和IeCPS2的立体特异性为对
映型(ent-CPS)。
关键词: 二萜合酶; 柯巴基焦磷酸合酶; 酶偶联反应; 毛萼香茶菜; 生物合成
Analysis on Stereospecifity of Diterpene Synthases IeCPS from Isodon eriocalyx
DU Gang1,3,*, GONG Hai-Yan1,*, GAO Juan1, FU Xiao-Li1, LU Shan2, ZENG Ying1,**
1State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of
Sciences, Kunming 650201, China; 2School of Life Sciences, Nanjing University, Nanjing 210093, China; 3University of Chinese
Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract: Ent-kaurane diterpenoids, isolated from the Chinese medicinal herbs, Isodon L., are principle com-
ponents showing potent bioactivities of antitumor and anti-autoimmune inflammation. Despite a large number
of ent-kaurane diterpenoids isolated from Isodon plants, little is known about the enzymatic machinery
involved in their biosynthesis. IeCPS1 and IeCPS2 encoding copalyl diphosphate synthases (CPS) were previ-
ously cloned from the I. eriocalyx leaves and functionally characterized. Here we verified that IeCPS1 and
IeCPS2 were ent-CPSs that produced CPP of ent-stereochemistry, by GC-MS analysis of enzymatic products
from coupled reactions with a known Arabidopsis ent-kaurene synthase stereospecific for ent-CPP.
Key words: diterpene synthase; copalyl diphosphate synthase; coupled enzymatic reaction; Isodon eriocalyx;
biosynthesis
唇形科香茶菜属(Isodon)植物具有抗菌、消
炎和祛无名肿毒之功效, 是我国民间广泛使用的
药草。在河南, 当地医生用冬凌草(I. rubescens)防
治食道癌和贲门癌, 收效显著。如今, 主要用冬凌
草制成的抗菌、消炎和抗肿瘤药物已进入医药市
场; 此外, 以产自云南的多年生草本植物毛萼香茶
菜(I. eriocalyx)研制开发的抗菌消炎药“咽康舒”、
以溪黄草(I. serra)等香茶菜属植物研制开发的药
品也相继面市(孙汉董等2001)。我国自上世纪70
年代成立河南省冬凌草协作组并鉴定抗癌活性成
分冬凌草甲素(oridonin, 又名rubescensin A, 图1)以
来, 已有不少学者对该属植物进行了基础和应用
开发研究, 发现20余个二萜化合物具有潜在的开
发应用价值(Sun等2006), 其中, 抗癌化合物毛萼乙
素(eriocalyxin B, 图1)的药用前景令人瞩目(Kong
等2014; Lu等2013; Wang等2007)。
毛萼乙素与冬凌草甲素都属于对映-贝壳杉
烷型二萜(ent-kaurane diterpenoids)。从生源和化
学结构上分析, 对映-贝壳杉烷型二萜同赤霉素
(gibberellin, GA)、甜菊苷(stevioside)、水稻防卫
素二萜、以及丹参酮(tanshinone)等二萜化合物的
生物合成途径都要经过类似于CPP (labdadienyl/
copalyl diphosphate)的双环焦磷酸酯中间体(Peters
2010)。模式植物拟南芥和水稻的赤霉素生物合成
研究表明(张迎迎和何祖华2010; 杨海燕等2010),
在二萜合酶(diterpene synthase, diTPS)的催化下,
植物生理学报1126
线性前体分子焦磷酸香叶基香叶酯(geranylgeranyl
diphosphate, GGPP)接连发生两步环合反应(图1),
即首先在 I I型d i T P S对映 -柯巴基焦磷酸合酶
(ent-copalyl diphosphate synthase, ent-CPS)的作用
下发生第一次环合反应形成双环中间体对映-CPP
(ent-copalyl diphosphate, ent-CPP), 然后经由I型
diTPS对映-贝壳杉烯合酶(ent-kaurene synthase,
ent-KS)催化的第二次环合形成四环二萜对映-贝
壳杉烯(ent-kaurene), 紧接着第19位碳(C-19)被对
映-贝壳杉烯氧化酶氧化为羧基, 再经过包括氧化
在内的不同后修饰反应, 最终形成130多个赤霉素
类化合物(Sakamoto等2004; Yamaguchi 2006)。赤霉
素是植物体内普遍存在的植物激素, 根据赤霉素
的生物合成途径, 可以推测香茶菜对映-贝壳杉烷
型二萜生物合成从GGPP起始的前两步环合反应
在酶催化机理上与赤霉素的相同, 即GGPP依次在
ent-CPS和ent-KS的催化下连续发生两步环合形成
对映-贝壳杉烯, 之后经过立体选择性各不相同的
氧化反应分别生成化学多样性极为丰富的赤霉素
和香茶菜对映-贝壳杉烷类二萜化合物(图1)。
图1 赤霉素和香茶菜对映-贝壳杉烷型二萜的生物合成
Fig.1 Biosynthetic pathway for GA and Isodon ent-kaurane diterpenoids
虚线表示未知酶反应。
酶催化的立体化学特异性决定了酶在生物合
成中可能参与的特定代谢通路 , 对于二萜合酶
diTPS尤其如此, 因为diTPS既参与初级代谢如赤
霉素的生物合成, 也在次级代谢中扮演主角(Gong
等2014)。例如, 水稻表达的3个CPS基因包括Os-
CPS1、OsCPS2和OsCPS4, 其中OsCPS1和OsCPS2
编码的酶催化GGPP生成ent-CPP, 与下游不同的I
型diTPS配合, 分别负责赤霉素和防卫素(oryzalides
A-C, oryzalexins A-F, phytocassanes A-E)的生物合
成(Cho等2004; Otomo等2004; Prisic等2004; Saka-
moto等2004; Xu等2007); 而OsCPS4编码的酶则催
化GGPP生成syn-CPP (图1), 和相应的diTPS组成另
外的代谢通路形成oryzalexin S和具有防卫/化感双
重功能的momilactones (Nemoto等2004; Otomo等
2004; Wilderman等2004; Xu等2004)。此外, 药用
植物丹参(Salvia miltiorrhiza)负责丹参酮生物合成
的SmCPS酶催化GGPP生成normal型(9S,10S)-CPP
(CPP, 图1), 后者在SmKSL (kaurene synthase-like)酶
的作用下发生环合反应形成松香烷型(abietane-type)
二萜骨架, 丹参SmCPS和SmKSL酶催化的立体化
学特异性在被子植物中还是首次报道 (Gao等
2009)。前期研究中, 我们采取同源基因克隆法从
毛萼香茶菜叶片获得了3条II型二萜合酶CPS的同
源基因, 分别命名为IeCPS1、IeCPS2和IeCPS2a,
通过大肠杆菌异源表达和GC-MS鉴定催化活性,
证明IeCPS1和IeCPS2的重组蛋白能够催化GGPP
形成产物柯巴醇(copalol, 来自经碱性磷酸酶水解
的CPP), 但GC-MS标准谱库没有列入特定构型的
柯巴醇, 因此其立体构型并未确定(Li等2012)。缺
乏立体特异性研究的酶化学证据, 也就难以确定
IeCPS的酶功能及其参与的代谢通路。
本文用异源表达的IeCPS1和IeCPS2分别与拟
南芥I型二萜合酶对映-贝壳杉烯合酶(ent-型AtKS)
配对进行酶偶联反应, 添加CPS酶底物GGPP, 酶联
杜刚等: 毛萼香茶菜二萜合酶IeCPS的立体特异性研究 1127
反应产物通过气相色谱-质谱联用仪(gas chroma-
tography-mass spectrometry, GC-MS)鉴定为对映-
贝壳杉烯, 说明偶联反应中的IeCPS酶催化GGPP
产生了ent-CPP, 后者被ent-型特异的AtKS催化形
成对映-贝壳杉烯产物。从而证实香茶菜IeCPS1和
IeCPS2酶催化的立体特异性为对映型, 是对映型
柯巴基焦磷酸合酶(ent-CPS)。以上酶化学证据进
一步表明, IeCPS1和IeCPS2很可能参与香茶菜对
映-贝壳杉烷型二萜的生物合成。
材料与方法
1 实验材料、仪器和试剂
从柳杉叶子精油制备的对映-贝壳杉烯标准
品由台湾大学森林资源系张惠婷馈赠(郑森松等
2006)。GGPP (geranylgeranyl diphosphate)购自
Sigma, 镍离子螯合层析介质(Ni-NTA agrose)购自
Qiagen。反转录试剂盒SuperScriptTM III First-
strand Synthesis system for RT-PCR购自Invitrogen,
内切酶购自Fermentas (MBI), PCR试剂及克隆试剂
盒购自宝生物工程(大连)有限公司(Takara), 引物
合成及测序由上海生工生物公司完成。
气相色谱-质谱联用仪型号为Agilent HP6890/
5973。
2 实验方法
2.1 拟南芥AtKS基因的克隆和异源表达
拟南芥(Arabidopsis thaliana L.) Columbia-0生
态型植株幼苗总RNA经过反转录得到1st cDNA, 根
据AtKS基因(GenBank登录号NM_106594.3)序列合
成特异的上游引物5′ AGTCGTCAAGGCTAATTC-
GT 3′和下游引物5′ CAAACCTCTTCTTGTTCTGA
3′, 以1st cDNA为模板进行PCR扩增, 胶回收PCR产
物连接到pMD18T载体(Takara), 测序验证序列正
确的质粒用于构建表达质粒。
AtKS的N端质体信号肽长度为29个氨基酸,
设计去除信号肽的上游引物5′ CGGATCCGCTAA-
CAATGTGAGCTT 3′ (下划线表示BamHI酶切位
点) 和下游引物5 ′ CCCTCGAGTCAAGTTA-
AAGATTCT 3′ (下划线表示XhoI酶切位点), 用高
保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase (Takara)扩
增不含信号肽编码区的AtKS基因, 连接到大肠杆
菌(Escherichia coli)表达载体pET32a(+)。经测序
确认DNA序列正确后, 将表达质粒转入大肠杆菌表
达菌株BL21 (DE3), 进行融合蛋白的诱导表达。加
入诱导剂IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,
终浓度0.1 mmol·L-1)在20 ℃诱导12 h, 12% SDS-聚
丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳检测重组蛋白的表达量
和可溶性, 融合表达的去信号肽AtKS蛋白分子量
大约为104 kDa。诱导表达菌经过8 000×g、4 ℃离
心5 min收集菌体, 液氮速冻后–80 ℃保存。
参照我们已发表的文章(Li等2012)将香茶菜
IeCPS1全长序列和IeCPS2去信号肽编码区的序列
分别载入pET32a(+), 在大肠杆菌BL21 (DE3)中实
现异源表达 , 加入诱导剂 I P T G (终浓度 0 . 2
mmol·L-1)在15 ℃诱导18 h。融合表达的IeCPS1和
IeCPS2分子量应分别为81和104 kDa。
2.2 重组酶的纯化
从–80 ℃取出保存的诱导菌(50 mL菌液来源)
置冰上化冻, 加入2.0 mL超声缓冲液(20 mmol·L-1
Tris-HCl, pH 7.5或8.5)分成5管, 分别在冰乙醇中间
歇超声破碎3 min, 取20 μL作为含可溶蛋白及包涵
体的全蛋白电泳样品; 然后12 000×g、4 ℃离心10
min收集上清液, 取20 μL作为可溶蛋白电泳样品,
其余上清液中加入300 mmol·L-1 NaCl和2 mmol·L-1
咪唑, 转移到镍离子螯合层析柱(Ni-NTA agarose,
2.0 mL), 与介质混匀后置冰浴缓缓摇晃1 h, 然后依
次用3 mL 洗涤缓冲液(20 mmol·L-1 Tris-HCl, pH 7.5
或8.5, 500 mmol·L-1 NaCl, 50 mmol·L-1咪唑)、3
mL洗脱缓冲液(20 mmol·L-1 Tris-HCl, pH 7.5或8.5,
500 mmol·L-1 NaCl, 200 mmol·L-1咪唑)过柱, 分别
收集流出液并取样电泳; 含有融合表达蛋白的洗
脱液立即用Sephadex G-25 (GE Health)脱盐, 用50
mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液(pH 7.5或8.0)平衡及洗脱;
收集到的蛋白组分经过6 000×g、4 ℃离心浓缩
(Amicon Ultra-15, Millipore)至300 μL左右, 加入甘
油8%、5 mmol·L-1 MgCl2、2 mmol·L
-1 DTT, 立即
进行酶反应或冰浴暂时保存。
上述pH 8.5及8.0的缓冲液分别用于拟南芥
AtKS重组酶的纯化及最后的脱盐处理, 而IeCPS1
和IeCPS2重组酶的纯化过程始终采用pH 7.5的缓
冲液。
2.3 酶偶联反应
5 mL磨口玻璃管内依次加入10 μL GGPP溶液
植物生理学报1128
(1 mg·mL- 1, Sigma)、150 μL IeCPS1或IeCPS2纯化
酶液、以及150 μL AtKS纯化酶液, 轻轻混匀, 用磨
口塞密封管口，30 ℃水浴6 h进行酶反应。
剩余的150 μL酶液分别加入5 μL GGPP作为
单酶反应对照, 同样在30 ℃水浴6 h; 之后往反应
体系中加入10mg碱性磷酸酶(1.7 U·mg-1, Sigma
P-3877), 37 ℃水浴3 h。
往上述酶反应管内加入2倍体积的正己烷萃
取2遍, 经4 000×g、3 min离心分层, 用玻璃吸管将
上层正己烷相转入干净的玻璃管中; 加入0.2 g无
水Na2SO4干燥1 h, 将正己烷相转移到质谱瓶中, 抽
气挥发或吹氮气浓缩至30 μL; 进行GC-MS检测,
上样2.0 μL。同时检测对映-贝壳杉烯标准品。
2.4 GC-MS检测条件
GC: HP-5MS石英毛细管柱(30 mm×0.25
mm×0.25 µm); 柱温起始温度60 ℃, 保持5 min, 程
序升温10 ℃·min-1至260 ℃, 保持50 min; 柱流量为
1.0 mL·min-1; 进样口温度250 ℃; 柱前压100 kPa;
分流比10:1; 载气为高纯氦气。
MS: 电离方式EI; 电子能量70 eV; 传输线温度
250 ℃; 离子源温度230 ℃; 四极杆温度150 ℃; 质
量范围35~450; 采用wiley7n.l标准谱库检索进行化
合物定性分析。
结果与讨论
1 拟南芥ent-KS的融合表达
SDS-PAGE电泳检测表明, 去信号肽的拟南芥
对映-贝壳杉烯合酶AtKS在pET32a(+)/大肠杆菌
BL21 (DE3)表达体系中, 以包涵体的形式大量表达
融合蛋白。但是, 随着超声缓冲液pH值从7.5升高
到8.5, 融合蛋白的可溶性明显增加。因此, 选定pH
值为8.5的缓冲液用于拟南芥AtKS重组酶的纯化,
该缓冲液中融合表达的蛋白质表现为部分可溶(图
2)。考虑到pH值过高可能不利于酶反应, 因此脱盐
时更换为pH 8.0的缓冲液, 随后浓缩并立即加入甘
油、MgCl2和DTT等酶反应成分。融合表达的
IeCPS1也是部分可溶, 而IeCPS2则几乎完全可溶(图
2), 与我们之前报道的研究结果一致(Li等2012)。
图2 IeCPS1和IeCPS2在pET32a(+)/大肠杆菌BL21 (DE3)中的表达及重组酶的纯化
Fig.2 Expression of IeCPSs and IeCPS2 in pET32a(+)/E. coli BL21 (DE3) and purification of recombinant fusion proteins
0: 空载体; 1: 全蛋白(含可溶蛋白及包涵体); 2: 可溶蛋白; 3: 穿透液; 4: 洗涤液; 5: 洗脱液(纯化酶)。
2 酶催化的立体特异性
将单酶反应作为对照, 一方面是为了明确异
源表达的IeCPS纯化酶是否具有预期的酶活性, 即
催化GGPP生成CPP, 后者经碱性磷酸酶水解产生
能够被GC-MS检测到的二萜成分柯巴醇。另一方
面, 通过GC-MS检测单个酶与底物GGPP保温是否
能产生只有配对酶偶联反应才能形成的特定产物
对映-贝壳杉烯, 佐证特定产物来自于酶偶联反
应。如图3所示, 重组酶IeCPS2的产物峰(24.59
min)质谱图与标准谱库检索到的柯巴醇质谱图无
论是分子(m/z 290)还是主要子离子(m/z 275、257、
137和109), 都一一吻合, 表明本实验的IeCPS2纯化
酶具有预期的酶催化活性。IeCPS1的产物峰也同
样如此。另外, 所有单酶反应包括AtKS或IeCPS纯
化酶单独与底物GGPP进行酶反应, 都没有检测到
化合物对映-贝壳杉烯。
根据GC-MS的检测结果, 对映-贝壳杉烯标准
品的保留时间在22.92 min, 其主要质谱峰为m/z
杜刚等: 毛萼香茶菜二萜合酶IeCPS的立体特异性研究 1129
已有研究表明, 在相当一部分二萜化合物的
生物合成中, 前体分子GGPP都要接连发生两步环
合/重排反应。其中, 第一次环合反应由II型diTPS
催化GGPP环合形成类似于CPP的双环焦磷酸酯中
间体 , 紧接的第二次环合与(或)重排反应由I型
diTPS负责完成。被子植物和细菌通常利用两个
不同的单功能diTPS通过串联催化完成上述的两
步环合反应(Caniard等2012; Gong等2014; Morrone
等2009; Sallaud等2012; Smanski等2011; Xu等
2014), 而裸子植物(Martin等2004; Vogel等1996;
Zerbe等2012)、苔藓与石松类植物(Hayashi等
2006; Mafu等2011)、以及真菌(Kawaide等1997;
Oikawa等2001)往往采用合二为一的双功能diTPS
催化GGPP的两步环合反应。
GGPP在立体特异性不同的II型二萜合酶CPS
酶催化下, 相应形成立体构型也不一样的CPP产
物, 迄今已被证明相关生物合成二萜合酶的CPP有
3种构型, 分别是ent-CPP、syn-CPP以及normal型
的CPP。其中, ent-和normal型CPS二萜合酶比较常
见, ent-CPS参与诸如赤霉素、甜菊苷(Richman等
1999)、平板霉素(platensimycin; Smanski等2011)
的生物合成; 已证实normal型CPS负责丹参酮生物
合成中的GGPP环合产生normal型CPP (Gao等
2009), 裸子植物形成松脂(rosin)以及银杏内酯
(ginkgolide)也要经过normal型CPP中间体继而发
生第二次环合, 但这两步环合反应是由同一个酶
(双功能)催化完成的(Martin等2004; Schepmann等
2001; Vogel等1996)。目前, 有报道的syn-CPS还非
常之少, 仅见于水稻防卫素二萜生物合成中的Os-
CPS4 (Nemoto等2004; Otomo等2004; Wilderman等
2004; Xu等2004)、以及真菌(Phomabetae)产生抗
肿瘤活性天然小分子aphidicolin时采用的双功能
二萜合酶aphidicolan-16β-ol synthase (Oikawa等
2001)。
酶产物的立体构型决定酶催化的立体化学特
异性。如果产物为新化合物, 则必须直接分离纯
化并通过波谱学以及晶体学进行结构鉴定, 需要
的酶产物量比较大(毫克级)。产物若是已知化合
物, 则要求同标准品比对分析。在缺乏标准品的
情况下, 可以同已知立体化学特异性的酶进行偶
联反应, 实现功能互补并生成绝对构型已知的产
272、257、229、213、187和147等, 比较标准谱库
的对映-贝壳杉烯质谱图, 两者完全一致(图4)。当
纯化的IeCPS1和IeCPS2分别与AtKS配对进行酶偶
联反应, 产物经GC-MS检测发现保留时间为22.88
min的产物峰, 进一步分析其质谱图与对映-贝壳杉
烯标准品的质谱图相吻合, 根据保留时间和质谱确
定该产物为对映-贝壳杉烯(图4)。说明偶联反应中
的IeCPS酶催化GGPP产生了ent-CPP, 后者被ent-型
特异的AtKS酶催化形成对映-贝壳杉烯产物, 从而
证实香茶菜IeCPS1和IeCPS2酶催化的立体特异性
为对映型, 是对映型柯巴基焦磷酸合酶(ent-CPS)。
图3 GC-MS检测IeCPS2酶产物去磷酸化形成的柯巴醇
Fig.3 GC-MS analyses of the dephosphorylated reaction prod-
ucts from GGPP produced by purified recombinant IeCPS2
分子量 290 Da, 保留时间24.59 min。A: 气相色谱图; B: 质谱
图, 其中标注化学结构的为wiley7n.l标准谱库检索到的柯巴醇质
谱图。
植物生理学报1130
物, 从而确定未知酶产物的构型。运用配对酶偶
联法, Gao等(2009)、Keeling等(2010)和Xu等(2007)
分别对丹参、云杉和水稻二萜合酶的立体特异性
进行了鉴定, 并由此推测二萜合酶基因功能的进
化关系。在本实验中, 我们采用酶偶联法将未知
立体特异性的IeCPS同已知ent-型特异的拟南芥
AtKS配对, 添加IeCPS的酶反应底物GGPP, 酶联反
应产物通过GC-MS鉴定为对映-贝壳杉烯, 说明偶
联反应中的IeCPS酶催化GGPP产生了ent-CPP, 后
者被ent-型特异的AtKS酶催化而形成对映-贝壳杉
烯产物, 从而证实香茶菜IeCPS1和IeCPS2酶催化
的立体特异性为对映型, 是对映型二萜合酶(ent-
CPS)。以上酶化学证据进一步表明, IeCPS1和
IeCPS2很可能参与香茶菜对映-贝壳杉烷型二萜的
生物合成, 而IeCPS1还可能参与赤霉素的生物合
成, 因为毛萼香茶菜萌发种子显著表达IeCPS1基
因(Li等2012)。
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图4 GC-MS检测对映-贝壳杉烯标准品及IeCPS1或IeCPS2分别与AtKS酶偶联反应产物
Fig.4 GC-MS analyses of ent-kaurene as an authentic standard and enzyme assay products
from GGPP produced by IeCPS1 or IeCPS2 coupled with AtKS
左边为气相色谱图; 右边是质谱图, 其中标注化学结构的为wiley7n.l标准谱库检索到的对映-贝壳杉烯质谱图。
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