全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (2): 189~196　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0488 189
收稿 2014-12-03　　修定 2014-12-24
资助 国家自然科学基金(31401314和31171536)。
* 通讯作者(E-mail: jxxia@isa.ac.cn; Tel: 0731-4619769)。
同源四倍体拟南芥的耐锌性及其机理
任冲, 徐国云, 李明娟, 崔延春, 王曼玲, 夏新界*
中国科学院亚热带农业生态研究所, 亚热带农业生态过程重点实验室, 长沙410125
摘要: 锌(Zn)是植物生长发育所必需的微量元素, 但其过量积累也会对植物产生毒害作用。通过对同源四倍体拟南芥进行
高浓度锌处理, 发现四倍体拟南芥对锌具有高耐受性和低积累性的特点。在高浓度锌胁迫条件下, 同源四倍体的根长和生
物量较野生型对照均有明显增加, 并且谷胱甘肽(GSH)的含量也明显升高。定量实时PCR (qRT-PCR)分析表明, 一些锌胁
迫响应基因的表达水平发生了显著改变。以上结果表明, 锌胁迫响应基因表达水平的改变以及GSH含量的升高可能在四
倍体拟南芥的耐锌过程中发挥重要作用。
关键词: 同源四倍体拟南芥; 耐锌性; 基因表达; 谷胱甘肽
Zinc Tolerance and its Mechanism in Autotetraploid Arabidopsis thaliana
REN Chong, XU Guo-Yun, LI Ming-Juan, CUI Yan-Chun, WANG Man-Ling, XIA Xin-Jie*
Key Laboratory of Agro-Ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of
Sciences, Changsha 410125, China
Abstract: Zinc (Zn) is an essential micronutrient for plants, but it becomes toxic when accumulated in excess.
An autotetraploid Arabidopsis thaliana treated with high concentration of Zn was found to be Zn-tolerant with-
out Zn-hyperaccumulation. The root length and biomass of autotetraploid plants exhibited increases upon ex-
cess Zn exposure, compared to wild-type plants, and the contents of total glutathione (GSH) were observed to
be increased as well in autotetraploid plants. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis of the expression
profiles of autotetraploid plants revealed the alterations of some Zn stress-responsive genes in their expression
levels. The obtained results suggested that altered expressions of Zn-responsive genes and increased GSH con-
tent may play a major role in the Zn tolerance of autotetraploid Arabidopsis.
Key words: autotetraploid Arabidopsis; zinc tolerance; gene expression; glutathione
Zn是植物体内必不可少的微量元素之一, 具有
重要的生理功能和营养作用 (龚红梅和李卫国
2009)。Zn是很多酶及蛋白质催化作用或结构的辅
助因子, 能够影响DNA的复制、转录、翻译以及光
合作用等(Luciano等1998; Kramer 2005)。因此, 维
持植物细胞内锌离子(Zn2+)的稳态具有重要意义。
缺Zn会引起植物的生理病害, 导致植物蛋白质合成
减少, 淀粉合成受阻等(Broadley等2007); Zn积累过
多, 同样会对植物造成毒害作用, 表现为根生长抑
制、黄化病、植物减产等(Fukao等2011)。此外, 过
量的Zn会导致植物体内其他必需元素如铁(Fe)、镁
(Mg)等的流失, 从而造成二次伤害(Fukao等2011)。
植物维持体内Zn2+含量动态平衡的机制包括:
控制Zn2+的吸收, 根的外排作用, Zn2+由根向地上部
的运输, 隔离作用以及蛋白质的螯合等(Kramer等
2007; Verbruggen等2009)。近年来, Zn的超富集现
象和相关基因鉴定的研究工作取得了重要的进展,
许多Zn转运蛋白被证实参与了植物耐Zn的过程
(Verbruggen等2009)。在拟南芥中, 最主要的Zn转
运蛋白是ZRT/IRT-LIKE PROTEIN (ZIP)家族, 其
成员如ZIP3、ZIP4和ZIP9的调控受到细胞内Zn2+
水平的影响(Kim等2003; Yang等2010)。ZIP转运蛋
白(ZRT/IRT-LIKE PROTEIN)同样也参与Zn的转
运, 如IRT3 (IRON-REGULATED TRANSPORTER
3)在拟南芥中过表达会引起Zn积累的增加(Lin等
2009)。HMA (P-type heavy metal ATPase)转运蛋白
与Zn在植物体内的运输有关, 如AtHMA4参与Zn
在木质部的装载或卸载, 以及Zn经韧皮部由地上
部往根部的运输过程(Kim等2009; Mills等2005)。
拟南芥的耐Zn能力通常与体内其他离子的浓度密
植物生理学报190
切相关, 尤其是Fe2+浓度(Lin等2009; Shanmugam等
2012)。拟南芥FIT (FER-LIKE IRON DEFICIEN-
CY-INDUCED TRANSCRIPTION FACTOR)基因在
缺Fe条件下的基因调控中起重要作用, 同时也通
过调节ITR1、bZIP、HMA3来参与Zn的去毒化过
程(Jakoby等2004; Yuan等2005)。此外, GSH和植
物螯合肽(phytochelatin, PC)的合成也是拟南芥中
Zn的积累和去毒化过程所必需的(Xiang等2001;
Tennstedt等2009)。除了Zn转运蛋白和金属耐受蛋
白之外, 其他一些信号分子也被证实与植物耐Zn
有关(Xu等2010)。
迄今有超过450种植物(其中0.2%是被子植物)
被发现能够超富集微量元素, 尤其是镉(Cd)、镍
(Ni)和Zn (Verbruggen等2009)。天蓝遏蓝菜(Thlaspi
caerulescens)和圆叶拟南芥(Arabidopsis halleri)是
目前研究最多的两种金属超富集物种。作为拟南
芥的近亲, 圆叶拟南芥具有组成型的Zn富集能力
和耐Zn能力(Macnair 2002), 并且受到外源Zn2+浓
度、QTLs (quantitative trait loci)以及QTLs与环境
互作的影响(Macnair 2002; Sarret等2009; Frérot等
2010)。目前有关同源四倍体拟南芥耐Zn的研究报
道较少, 对同源四倍体拟南芥进行耐Zn研究有助
于了解植物耐重金属的机制, 同时对于拟南芥耐受
其他重金属胁迫的研究也具有一定的参考价值。
本文从表型、生理和分子水平对同源四倍体拟南
芥的耐Zn机理进行了分析, 初步揭示了其可能的
耐Zn机制, 为后续的研究提供了方向和依据。
材料与方法
1 材料与生长条件
供试材料为野生型拟南芥(Arabidopsis thali-
ana L., Columbia 0生态型, 简写为Col-0), 同源四倍
体拟南芥esd (enlarged seed and seedling, Col背景),
由本实验室从野生型群体中筛选、分离获得。试
验材料均置于22 ℃的恒温生长室生长, 湿度60%,
光照条件控制为16 h光照、8 h黑暗, 光照强度220
μmol·m-2·s-1。
2 方法
2.1 试验材料的倍性分析
参照Li等(2012)和曾民环等(2012)的方法进行
试验材料的倍性分析。取10日龄供试材料的真叶
进行样品的制备, 提取细胞核。采用FCS Express
4.0 plus Research Edition software 和Cell Lab QuantaTM
SC Flow Cytometry (Beckman Coulter, USA)完成样
品的分析。
2.2 试验处理
试验种子先用75%乙醇进行表面消毒2~3
min, 后经10% (V/V)的bleach溶液处理30 min, 无菌
水漂洗5次。种子于4 ℃的黑暗中放置3 d进行春
化, 然后点种到1/2MS培养基上进行生长。
测量拟南芥根长和鲜重试验, 将预处理的种
子分别点种到含有0、400、450、500和550
μmol·L-1硫酸锌(ZnSO4)的1/2MS培养基上, 直立生
长10 d后进行测量。
测量拟南芥植株中Zn和GSH的含量, 将预处
理的拟南芥种子点种到1/2MS培养基上生长10 d,
然后转移到含有400和500 μmol·L-1 ZnSO4的1/2MS
新鲜培养基上继续培养3 d, 然后对植株进行Zn和
GSH含量的测定。
用于qRT-PCR分析时, 将在1/2MS培养基上生
长了10 d的拟南芥幼苗转移到含有500 μmol·L-1
ZnSO4的培养基上培养3 d, 然后用于RNA的提取。
2.3 测定方法与数据处理
测量根长时, 对不同浓度ZnSO4处理的所有拟
南芥植株都进行测量。以每5株为一组进行鲜重
的测量。拟南芥中Zn的含量和GSH的含量分别参
照Richard等(2011)和Lee等(2003)的方法进行测
定。采用Excel进行作图, 数据采用Student’s t-test
进行差异显著性分析, 其中P值设定为0.05。
2.4 RNA的提取和qRT-PCR
用Trizol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)
进行拟南芥总RNA的提取。提取到的RNA用DNase
(Promega, Madison, WI, USA) 进一步处理。使用
M-MLV first strand Kit (Invitrogen)合成cDNA第一
链。进行qRT-PCR分析时, 按照Platinum® SYBR®
Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen) 的说明书
进行操作, 使用ABI 7900HT (Applied Biosystems,
Foster City, CA, USA) 进行PCR分析。反应程序为
95 ℃ 10 min, 95 ℃ 15 s, 58 ℃ 30 s, 共40个循环。
各基因的特异性引物见表1, 其中ACT2/ACT8为内
参基因。qRT-PCR相对定量结果使用内参基因的
ΔΔCT法进行处理(黄蔚等2014)。
任冲等: 同源四倍体拟南芥的耐锌性及其机理 191
表1 锌胁迫相关基因表达检测的引物序列
Table 1 Primers used in the analysis of expressions of Zn
stress-responsive genes
引物名称 引物序列(5′→3′)
ACT2/ACT8-F GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG
ACT2/ACT8-R AACGACCTTAATCTTCATGCTGC
IRT3-F GCCCTCACAACCCCGATAG
IRT3-R GCTCCGACACTGTGAGAATTGA
ZIP3-F CGCACCCTAAAATGCAATCC
ZIP3-R AGGCCAGCACCAAGAAGGA
AtHMA4-F CCGGTGCAGATTATTGG
AtHMA4-R TCTACCTTGACGGCTC
AtFIT-F CAGTCACAAGCGAAGAAACTCA
AtFIT-R CTTGTAAAGAGATGGAGCAACACC
AtGSH1-F CTCCGTCAAGCTTGACGAATTTCA
AtGSH1-R CAGATAGCATAAACTCACACCCAA
AtGSH2-F ATGGGCAGTGGCTGCTCTTC
AtGSH2-R GCTGTCCAAGACTCCAAAACC
AtPCS1-F CTCGTTTCAAGTATCCCCCTCAC
AtPCS1-R GCTTCAGGACCACATTCACACTC
实验结果
1 拟南芥多倍体植株的倍性分析
本实验室从野生型拟南芥群体中筛选到一株
自发突变的拟南芥多倍体植株, 为确定该多倍体植
株的倍性, 本试验采用流式细胞仪对其进行了倍性
的鉴定。由图1可以看出, 二倍体野生型拟南芥Col-0
细胞的DNA含量(细胞倍性)为2C (C值表示单倍体
核的DNA含量), 而多倍体拟南芥esd细胞的DNA含
量为4C, 说明本试验中的多倍体材料为四倍体。
2 高浓度Zn胁迫下四倍体拟南芥具有较强的耐Zn性
为了比较二倍体与四倍体拟南芥植株的耐Zn
性, 分别用不同浓度的ZnSO4处理两种植株, 在相
同条件下培养10 d后检测植株的表型, 发现与对照
(CK)相比, 两种植株的生长均受到了不同程度的
抑制, 随着Zn浓度升高, 抑制作用明显增强。与野
生型Col-0植株相比, 四倍体esd植株受抑制程度要
小(图2)。对两种植株进行根长和鲜重的测量发现,
在同等条件下, esd植株的根长和鲜重都要明显大
于野生型植株(表2), 说明其对Zn的耐受性较强。
为了进一步说明两种植株耐Zn能力的大小, 对根
长和鲜重进行了相对量的分析, 即相对根长(%)=
(根长x/根长0)×100%, 相对鲜重(%)=(鲜重x/鲜重0)×
100%, 其中x表示培养基中Zn的浓度。结果显示
(图3), 随着Zn浓度的不断增加, esd植株生物量的
减少程度始终小于野生型植株, 进一步说明了四
倍体esd植株的耐Zn能力强于二倍体Col-0。
3 四倍体拟南芥具有较高的Zn和GSH含量
相比于二倍体, 四倍体拟南芥表现出了较强
的耐Zn性, 为了研究四倍体esd植株耐Zn的生理机
理, 我们对esd中Zn和GSH的含量进行了测定。在
正常生长条件下, 野生型及四倍体植株体内的Zn
含量都很低, 且前者的Zn含量要略低于后者。两
种植株的Zn含量均随外源Zn浓度的增加而增加,
图1 流式细胞分析拟南芥Col-0和esd植株的细胞倍性
Fig.1 Nuclear ploidy analysis of Col-0 and esd seedlings by
flow cytometry
图2 锌处理条件下Col-0和esd植株的表型观察
Fig.2 Observation of phenotypes of Col-0 and esd plants under Zn treatment
植物生理学报192
但野生型植株的Zn含量在较高Zn水平条件下要高
于esd植株的Zn含量。在400和500 μmol·L-1 的外源
ZnSO4水平下, Col-0植株的Zn含量分别是esd的1.2
倍和1.1倍(图4-A)。这说明在过量的Zn的条件下,
esd植株对Zn的吸收要少, 从而减少了Zn在体内的
积累, 降低Zn的毒害作用。
植物在重金属胁迫下能够产生GSH等多肽来
进行解毒或维持体内金属离子的平衡(Lee等2003)。
我们对500 μmol·L-1 ZnSO4处理的两种植株进行了
GSH含量的测定, 发现GSH的含量与对照相比有
了显著的增加, 而且esd植株体内的GSH要明显高
于Col-0植株(图4-B)。这表明esd植株在Zn胁迫下
产生了更多的GSH来减轻过量Zn的危害, 从而提
高耐胁迫的能力。
表2 拟南芥根长和鲜重的测量结果
Table 2 Measurements of root length and fresh weight of Arabidopsis
性状 Zn浓度/μmol·L-1
数值 数值范围
Col-0 esd Col-0 esd
根长/cm 0 27.89±0.78 33.77±0.98 20.00~35.00 22.00~42.00
400 14.41±0.39 20.27±0.85 11.00~19.00 14.50~30.00
450 13.90±0.56 18.92±0.89 10.00~21.50 10.00~27.00
500 12.32±0.32 15.71±0.73 9.50~14.50 9.50~22.50
550 12.07±0.33 14.98±0.59 8.50~15.50 9.50~20.00
鲜重/mg 0 7.25±0.28 10.58±0.40 6.10~9.20 9.10~14.40
400 6.28±0.38 9.20±0.32 4.70~8.90 7.20~10.60
450 5.77±0.36 8.93±0.27 4.10~6.90 7.20~10.20
500 5.32±0.22 8.36±0.14 4.10~6.80 7.10~9.80
550 5.11±0.29 8.16±0.14 4.00~6.40 7.20~9.60
　　表中数值为平均值±标准差。
图3 Col-0和esd植株的相对根长和相对鲜重
Fig.3 The relative root length and shoot fresh weight of Col-0 and esd plants
图4 Col-0和esd植株中锌含量和谷胱甘肽含量的分析
Fig.4 Analysis of Zn and GSH contents in Col-0 and esd plants
*代表esd与野生型Col-0差异显著(P<0.05), **代表esd与野生型Col-0差异极显著(P<0.01), 图5同此。
任冲等: 同源四倍体拟南芥的耐锌性及其机理 193
4 四倍体拟南芥中Zn胁迫响应基因表达水平发生
改变
为了探究四倍体拟南芥耐Zn分子机制, 利用
qRT-PCR对一些Zn胁迫响应基因进行了表达分析,
结果表明, 在过量的Zn处理条件下, 与Zn吸收相关
的基因如IRT3和ZIP3的表达量明显降低(图5-A和
B), 而与Zn解毒过程相关的基因如AtHMA4和
AtFIT的表达量则明显升高(图5-C和D)。此外 ,
GSH和PC合成相关的基因如AtGSH1、AtPCS1的
表达量也明显升高(图5-E和F)。由此推测esd植株
的耐Zn能力可能与这些基因表达的变化有关。
讨　　论
有研究表明, 高倍性植物比二倍体植物更能
适应逆境环境(Deng等2012)。与二倍体野生型
Col-0植株相比, 同源四倍体的拟南芥esd植株在过
量的Zn处理条件下表现出了更强的耐逆性, 其根
长与鲜重受影响程度都要明显小于野生型植株。有
报道表明, 植物对金属的超富集现象也是植物耐该
种金属或金属去毒化的一种机制(Frérot等2010)。
本研究测定了Zn处理条件下esd中的Zn2+浓度, 结
果表明其Zn2+积累量比野生型要少, 说明在同源四
倍体中Zn的积累并不是其耐Zn的主要机制。
植物中的GSH和PC是螯合重金属离子的主要
结合肽(Guo等2008), 其中GSH也是合成PC的前体,
在PC合成酶(PC synthase, PCS)的催化下能够合成
PC (Shanmugam等2012)。PC对于Zn的耐受以及
Zn的积累都是必不可少的(Tennstedt等2009)。
GSH在Zn的内稳态中发挥着重要作用, 而且还能
够清除过氧化氢来减轻由过量的Zn积累所引起的
氧化胁迫的症状(Shanmugam等2012; Remans等
2012)。本研究结果表明, 高浓度Zn处理使得esd植
图5 锌胁迫响应基因的表达分析
Fig.5 Expression analysis of Zn stress-related genes
植物生理学报194
株中AtGSH1和AtPCS1的表达被强烈诱导, 总GSH
含量也显著增加。Vernoux等(2000)的研究表明,
GSH的缺乏能够影响根尖分生组织的形成, 从而
使根的形成受阻。当GSH水平降到野生型水平以
下时, 其他分生组织内的细胞分裂也将会减少。
因此, 高水平的GSH可能是促进esd植株的根在Zn
胁迫条件下仍然能够生长的原因。在拟南芥中单
独过表达AtPCS1或者同时过表达GSH1和AsPCS1
都能引起PC含量的增加(Lee等2003; Guo等2008),
说明在esd中PC的含量水平也可能显著上升, 而高
水平的PC和GSH在四倍体esd植株的耐Zn过程中
发挥着重要的作用。
图6 esd植株在过量的锌的条件下可能的维持细胞内锌平衡的调控模型
Fig.6 Putative regulation model of cellular Zn homeostasis in esd plants under excess Zn condition
图中灰色箭头表示被诱导, 黑色箭头表示被抑制; 实线代表直接调控, 虚线表示间接调控。Cy: 细胞质; V: 液泡。
在Zn胁迫下, esd通过改变相关基因的表达来
达到耐Zn的目的。本研究提出了一个调控模型(图
6)来解释四倍体esd植株对Zn的高耐受性。在这个
模型中, Zn的解毒网络主要由Zn的吸收、外流以
及隔离等过程相互协调而组成。由ITR1、ITR3和
ZIP3等主导的Zn的吸收被抑制 , 而由HMA3、
HMA4、ZIP9和MTPA2等介导Zn的外流及液泡的
隔离过程则被促进。IRT3和ZIP3是位于细胞质膜
上控制Zn2+吸收的Zn转运蛋白, esd对Zn的高耐受
性可能与限制Zn2+的吸收有关。然而, MacDiarmid
等(2003)的研究表明, 仅控制细胞内Zn2+的吸收并
不足够。AtHMA4是跨膜金属转运蛋白中的P1B-
ATPases, 它能将过多的金属离子从根部转移到受
损伤更小的地上部, 而且还发挥着Zn2+外流泵的作
用(Mills等2005)。FIT参与的Zn去毒化过程主要由
MTPA2 (metal tolerance protein A2)介导, MTPA2是
位于液泡膜上的Zn转运蛋白, 其表达能够被过量
的Zn所诱导(Arrivault等2006)。FIT表达量的增加,
促使过多的Zn由细胞质向液泡转运, 同时也弥补
了MTP1 (metal tolerance protein 1, 位于液泡膜上
的Zn转运蛋白)表达量降低的不足。值得注意的
是, 同源多倍体中基因的表达很少改变(Pignatta等
2010; Riddle等2010), 但任何微小的改变都可能引
起表型的变化(Li等2012)。这说明在Zn的解毒过
程中也可能存在着关键基因, 编码调控因子对相
关基因的表达进行调控。
综上所述, 同源四倍体的拟南芥植株对Zn具
有高耐受性和低积累性的特点, 其通过改变相关
基因的表达和产生大量的GSH、PC等螯合蛋白类
物质来降低Zn的毒害作用。有关基因之间的具体
调控作用机制以及是否存在特异的Zn解毒途径还
有待进一步的研究。
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