全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 10期，2009年 10月986
收稿 2009-08-15 修定 　2009-09-10
资助 广东省自然科学基金(04 3 00 5 8 8)、教育部博士点基金
(20040564004)和国家自然科学基金(30600380)。
致谢 美国拟南芥种子中心(A BR C)提供 a u x 1 -7、a x r 1 -3、
tir1-1、etr1-1、ctr1-1、ein2-1 和 ein3-1 突变体种子;
Hidehiro Fukaki和 Catherine Bellini博士提供 slr-1和
A RF 1 7 过表达系种子。
* 共同通讯作者( E -m a i l : j i n x w a n g @ s c a u . e d u . c n ,
hliao@scau.edu.cn; Tel: 020-85280156)。
生长素、乙烯和一氧化氮对拟南芥下胚轴插条形成不定根的调节
王金祥 *, 陈碧丽, 廖红 *, 严小龙
华南农业大学资源与环境学院, 根系生物学研究中心, 广州 510642
提要: 研究生长素、乙烯和一氧化氮(NO)对拟南芥下胚轴插条形成不定根的调节, 以及生长素和乙烯信号转导成员在IAA
促进不定根形成中的作用的结果表明: 拟南芥切条以 IAA和硝普钠(NO供体)单独处理7 d后的不定根形成均受到促进, 其
中以50 μmol·L-1 IAA和1 μmol·L-1 SNP的促进作用为最强, 乙烯的促进作用不明显; 生长素运输和信号转导以及乙烯信号转
导相关突变体对 IAA促进生根作用的敏感性比野生型有所下降, 特别是 IAA14功能获得型的突变体。IAA和NO在促进不
定根形成中有协同效应。
关键词: 拟南芥不定根; 下胚轴插条; 生长素; 乙烯; 一氧化氮
Regulation of Auxin, Ethylene and Nitric Oxide on Adventitious Rooting in
Arabidopsis Hypocotyl Cuttings
WANG Jin-Xiang*, CHEN Bi-Li, LIAO Hong*, YAN Xiao-Long
Root Biology Center, College of Natural Resources and Environment Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou
510642, China
Abstract: Arabidopsis hypocotyl cuttings were employed to study effects of auxin, ethylene and nitric oxide
(NO) on adventitious rooting. The functions of auxin and ethylene signaling players cooperated with indole
acetic acid (IAA) in adventitious rooting were also investigated. The results showed that treatment with either
IAA or sodium nitroprusside (SNP, donor of NO) on Arabidopsis cuttings for 7 days could stimulate adventi-
tious root formation, and the optimal concentration is 50 μmol·L-1 and 1 μmol·L-1, respectively; while ethylene
played little role in rooting. Compared with wild type, sensitivity of auxin transportation and signal transduction
and ethylene signaling-related mutants to stimulatory effect of IAA on rooting was reduced, especially gain-of-
function of mutated IAA14 (SLR). NO had synergistic role with IAA in adventitious rooting.
Key words: Arabidopsis adventitious root; hypocotyl cutting; auxin; ethylene; nitric oxide
植物不定根的形成受植物激素的调节。在根
原基的发生阶段, 生长素可促发早期根原基的形成,
乙烯也参与调节不定根的形成(Bollmark和Eliasson
1990; Lobiecke和 Sauter 1999)。业已查明, 一氧
化氮(nitric oxide, NO)作为一种细胞间和细胞内信
使分子参与调控植物的多种生理过程, 近10年来的
研究表明, NO 在种子萌发、根和叶的生长和发
育、抗病和防御反应、细胞程序性死亡和植物响
应非生物胁迫的生理过程中均起作用(Crawford和
Guo 2005)。生长素诱导的黄瓜不定根形成依赖于
NO, 作为NO供体的硝普钠(sodium nitroprusside,
SNP)对不定根的形态和结构的影响近似于吲哚类
生长素(Pagnussat等 2003)。Steffens等(2006)
报道, 乙烯而非生长素在调节深水水稻(deepwater
r ice)节上形成的不定根中起中心作用, 赤霉酸
(gibberellic acid, GA)与乙烯之间有协同效应, 而脱
落酸(abscisic acid, ABA)与赤霉酸之间则有拮抗作
用。表明深水水稻不定根的形成受激素之间相互
作用的调节。植物激素的相互作用一直是植物发
育生物学研究中的热点之一, 但迄今对生长素、乙
烯和一氧化氮三者单独或结合使用对拟南芥下胚轴
中的不定根形成的影响还不清楚。本文就此问题
作了一些探讨。
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材料与方法
试验材料为拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)
Columbia野生型和 axr1-3、aux1-7、tir1-1、slr-1、
arf17、etr1-1、ctr1-1、ein2-1和 ein3-1突变体
(遗传背景均为 Col-0)。其中 aux1-7、axr1-3和
tir1-1分别是生长素运输和信号转导成员AUX1、
AXR1和TIR1失去功能的突变体(Bennett等 1996;
Leyser等 1993; Ruegger等 1998); slr-1是 IAA14功
能获得型的突变体(Fukaki等2002); arf17是T-DNA
插入导致ARF17过表达的突变体(Sorin等 2005);
etr1-1、ctr1-1、ein2-1和 ein3-1分别是乙烯信号
转导成员 ETR1、CTR1、EIN2和 EIN3失去功能
的突变体(Bleecker等1988; Kieber等1993; Chao等
1997; Alonso等 1999)。
培养基为 1/2MS培养基, 含大量元素、微量
元素、1%蔗糖和琼脂, 用 1 mol·L-1的 KOH或 1
mol·L-1的HCl调pH至5.7, 高压灭菌后在超净台上
倒平板。 I A A、1 - 氨基环丙烷 - 1 - 羧酸 ( 1 -
aminocyclopropane-1-carboxylic acid, ACC)和硝普
钠(SNP)为SIGMA公司产品, 用过滤方法除菌。挑
选饱满健康的拟南芥野生型和相关突变体种子, 在
无菌操作台上用无菌水浸泡 20 min, 再用 70%酒
精消毒 5 min, 接着用次氯酸钠浸泡 5 min, 然后用
无菌水洗 5次, 每次 1~2 min。消毒过的种子播种
到装有适量水和湿润滤纸的培养皿里, 用锡箔纸包
好培养皿, 放入 4 ℃的冰箱中暗培养 4 d以打破种
子休眠。萌发的种子用毛笔播种到 1/2MS培养基
上, 放入培养箱中照光 5~ 6 h (光照强度为 7 0
μmol·m-2·s-1), 再用双层锡箔纸包好遮光培养 3~4 d,
下胚轴长至 2 cm后切成插条。用灭菌过的小刀片
切掉拟南芥苗的根部后, 只保留子叶以下1.5 cm左
右的下胚轴, 然后用毛笔将下胚轴插条播种到加有
不同水平和不同激素的 1/2MS培养基上。置于培
养箱中光下培养 7 d, 光暗周期为 16 h/8 h, 温度为
22 ℃/18 ℃, 光照强度为 70 μmol·m-2·s-1。拟南芥
下胚轴的不定根在光下培养至第3和第4天时即突
出表皮。所有试验均是在光下培养至第 7天时于
NIKON显微镜下统计不定根数, 凡明显突出表皮的
不定根均计算在内。
每个试验至少重复 3次, 结果用 SAS 8.2统计
软件分析, 文中数据均是平均值 ±SE, Duncan’s多
重比较检验, 图中不同字母表示差异显著性(P<
0.05)。
结果与讨论
1 IAA对拟南芥下胚轴插条形成不定根的影响
I AA 促进拟南芥不定根的形成, 在 0 ~ 5 0
μmol·L-1 IAA范围内, 随着 IAA浓度的升高其促进
生根的作用增强; 50 μmol·L-1 IAA的促进作用最强,
IAA浓度超过50 μmol·L-1时, 不定根的数量即减少,
表明 50 μmol·L-1是 IAA促进拟南芥不定根形成的
最适浓度(图 1)。
图 1 IAA对拟南芥下胚轴插条形成不定根的影响
Fig.1 Effect of IAA on formation of adventitious root in
Arabidopsis hypocotyls cuttings
2 生长素运输和信号转导以及乙烯信号转导相关
基因突变对生长素诱导不定根形成的影响
图 2和图 3显示, (1)在不加生长素的条件下,
slr-1突变体形成的不定根数少于野生型, 差异显著;
而 arf17突变体则和野生型相比差异不明显。在 5
μmol·L-1 IAA的条件下, 野生型和arf17突变体形成
的不定根数均明显比不作IAA处理的多, 但两者差
异不明显; 而slr-1突变体的不定根数明显比野生型
的少, 仅为它的 16.8%。经 IAA处理的 slr-1突变
体其形成的不定根数和不作 IAA处理的差异不显
著。这些说明: ARF17表达增强的突变对生长素的
响应不大, 而IAA14蛋白功能获得型的突变则可导
致突变体对 IAA的敏感性下降(图 2)。(2)在不作生
长素处理的情况下, 与生长素和乙烯相关的突变体
和野生型拟南芥不定根形成差异不明显, 外源生长
素均能不同程度地促进野生型和突变体拟南芥不定
根的形成; 与野生型拟南芥相比, axr1-3、aux1-7
和 tir1-1突变体对生长素的响应有些下降, 不定根
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数的增加幅度小于野生型的; 此外 etr1-1、ctr1-
1、ein2-1和 ein3-1突变体对生长素的敏感度也均
有下降, 其中 ctr1-1突变体对生长素敏感度下降幅
度最大(图3), 说明乙烯组成型信号转导是抑制生长
素的信号转导的。
这些结果表明: AXR1、AUX1、TIR1 和
IAA14 (SLR)都参与 IAA调节不定根的形成(图 2、
3)。IAA14蛋白GWPPV基序突变可阻止 IAA14的
有效而及时的降解, 以致 slr-1侧根数明显减少, 甚
至没有侧根形成(Fukaki等2002, 2005; Tan等2007);
本文结果也说明, IAA14也参与调节不定根的形成,
但不同的是, IAA14功能获得型突变不能完全抑制
不定根的形成, 说明不定根和侧根形成的机制有差
别; 乙烯信号转导系统参与生长素对不定根形成的
调节(图3), 这可能与乙烯调节生长素的合成和运输
(Stepanova等 2005)以及生长素信号转导和乙烯信
号转导之间是相互作用的有关。此外, 所有相关基
因突变体都对外源生长素作出一定程度的响应(图
2、3), 这说明拟南芥基因组可能还存在类似的功
能基因。
图 2 IAA对 arf17和 slr-1突变体不定根形成的影响
Fig.2 Effect of IAA on formation of adventitious
root in arf17 and slr-1 mutant
IAA浓度为 5 μmol·L-1。
图 3 IAA对生长素以及乙烯信号转导和运输的突变体不定根形成的影响
Fig.3 Effect of IAA on formation of adventitious root in auxin and ethylene signaling-related mutants
IAA浓度为 5 μmol·L-1。
3 ACC对拟南芥插条不定根形成的影响
图 4显示, 在ACC (乙烯前体)的所试浓度中,
仅 0.1 μmol·L-1 ACC略有促进不定根形成的作用,
但不显著, 随着ACC浓度的增加, ACC即表现出抑
制不定根形成的作用。
4 NO供体硝普钠对拟南芥插条不定根形成的影响
图5显示, 低浓度的SNP对拟南芥插条不定根
的形成有促进作用, 高浓度则有明显的抑制作用; 1
μmol·L-1 SNP的促进作用最明显。当浓度大于 20
μmol·L-1时, 即表现出明显的抑制作用, 特别是 100
和 200 μmol·L-1 SNP下的插条几乎不生根。
最后, 根据前述结果, 考虑到最适 IAA和 SNP
浓度可能掩盖它们在促进不定根形成中的相互作
用, 我们分别用 5 μmol·L-1 IAA、0.1 μmol·L-1 ACC
和 0.1 μmol·L-1 SNP单独或三者组合处理拟南芥下
胚轴插条 7 d (IAA和 SNP促进不定根形成的次佳
浓度分别是 5 μmol·L-1和 0.1 μmol·L-1, 0.1 μmol·L-1
ACC 促进生根作用不显著)。图 6 结果表明, 5
μmol·L-1 IAA促进不定根的效应明显比0.1 μmol·L-1
SNP和 0.1 μmol·L-1 ACC处理的好, 且均达到显著
水平; 和 IAA单独处理的相比, IAA和 SNP组合处
理的以及 IAA、SNP和ACC三者组合的促进不定
根形成的效应明显, 差异显著, IAA与ACC组合处
理的略微有促进, 但不显著; IAA与SNP有协同效应。
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参考文献
Alonso JM, Hirayama T, Roman G, Nourizadeh S, Ecker JR (1999).
EIN2, a bifunctional transducer of ethylene and stress re-
sponses in Arabidopsis. Science, 284: 2148~2152
Bennett MJ, Marchant A, Green HG, May ST, Ward SP, Millner
PA, Walker AR, Schultz B, Feldmann KA (1996). Arabidopsis
AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism.
Science, 273: 948~950
Bleecker AB, Estelle MA, Somerville C, Kende H (1988). Insen-
sitivity to ethylene conferred by a dominant mutation in
Arabidopsis thaliana. Science, 241: 1086~1089
Bollmark M, Eliasson L (1990). Ethylene accelerates the break-
down of cytokines and thereby stimulates rooting in Norway
spruce hypocotyl cuttings. Physiol Plant, 80: 534~540
Chao Q, Rothenberg M, Solano R, Roman G, Terzaghi W, Ecker
JR (1997). Activation of the ethylene gas response pathway
in Arabidopsis by the nuclear protein ETHYLENE-INSEN-
SITIVE3 and related proteins. Cell, 89: 1133~1144
Crawford NM, Guo FQ (2005). New sights into nitric oxide
metabolism and functions. Trends Plant Sci, 10 (4): 195~200
Fukaki H, Nakao1 Y, Okushima Y Theologis A, Tasaka M (2005).
Tissue-specific expression of stabilized SOLITARY-ROOT/
IAA14 alters lateral root development in Arabidopsis. Plant
J, 44: 382~395
Fukaki H, Tameda S, Masuda H, Tasaka M (2002). Lateral root
formation is blocked by a gain-of-function mutation in the
SOLITARY-ROOT/IAA14 gene of Arabidopsis. Plant J, 29:
153~168
Kieber JJ, Rothenberg M, Roman G, Feldman KA, Ecker JR (1993).
CTR1, a negative regulator of the ethylene response pathway
in Arabidopsis, encodes a member of the Raf family of protein
kinases. Cell, 72: 427~441
Leyser HMO, Lincoln C, Timpte C, Lammer D, Turner J, Estelle
M (1993). The auxin-resistance gene AXR1 of Arabidopsis
encodes a protein related to ubiquitin-activating enzyme E1.
Nature, 364: 161~164
Lobiecke R, Sauter M (1999). Adventitious root growth and cell-
cycle induction of deepwater rice. Plant Physiol, 119: 21~29
Pagnussat GC, Lanteri ML, Lamattina L (2003). Nitric oxide and
图 5 SNP对拟南芥下胚轴插条不定根形成的影响
Fig.5 Effect of SNP on formation of adventitious root
in Arabidopsis hypocotyl cuttings
图 6 生长素、SNP和ACC相互作用对拟南芥插条不定根形成的影响
Fig.6 Interactions between auxin, SNP and ACC in regulation of adventitious rooting in Arabidopsis
图 4 ACC对拟南芥下胚轴插条不定根形成的影响
Fig.4 Effect of ACC on formation of adventitious
root in Arabidopsis hypocotyl cuttings
植物生理学通讯 第 45卷 第 10期，2009年 10月990
cyclic GMP are messengers in the indole acetic acid-induced
adventitious rooting process. Plant Physiol, 132: 1241~1248
Ruegger M, Dewey E, Gray WM, Hobbie L, Turner J, Estelle M
(1998). The TIR1 protein of Arabidopsis functions in auxin
response and is related to human SKP2 and yeast Grr1p.
Genes Dev, 12: 198~207
Sorin C, Bussell JD, Camus I, Ljung K, Kowalczyk M, Geiss G,
McKhann H, Garcion C, Vaucheret H, Sandberg G, Bellini C
(2005). Auxin and light control of adventitious rooting in
Ara bidops is require ARGO NAUTE1. Plant Cell, 17:
1343~1359
Steffens B, Wang JX, Sauter M (2006). Interactions between
ethylene, gibberellin and abscisic acid regulate emergence
and growth rate of adventitious roots in deepwater rice.
Planta, 223: 604~612
Stepanova AN, Hoyt JM, Hamilton AA, Alonso JM (2005). A link
between ethylene and auxin uncovered by the characteriza-
tion of two root-specific ethylene-insensitive mutants in
Arabidopsis. Plant Cell, 17: 2230~2242
Tan X, Calderon-Villalobos LI, Sharon M, Zheng CX, Robinson
CV, Estelle M, Zheng N (2007). Mechanism of auxin per-
ception by the TIR1 ubiquitin ligase. Nature, 446: 640~645