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彩云兜兰的离体快速繁殖



全 文 :植物生理学通讯 第 45卷 第 10期,2009年 10月 1011
收稿 2009-08-28 修定  2009-09-17
资助 国家科技支撑计划课题(2008BAC39B05)和广东省农业
攻关(2009 B0202010 09)。
* 通讯作者(E-mail: duanj@scib.ac.cn; Tel: 020-37252978)。
彩云兜兰的离体快速繁殖
曾宋君 1,2, 陈之林 1, 吴坤林 1, 段俊 1,*
1中国科学院华南植物园, 广州 510650; 2中国科学院研究生院, 北京 100039
In vitro Propagation of Paphiopedilum wardii Summerh
ZENG Song-Jun1,2, CHEN Zhi-Lin1, WU Kun-Lin1, DUAN Jun1,*
1South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China; 2Graduate University of Chinese
Academy of Sciences, Beijing 100039, China
1 植物名称 彩云兜兰(Paphiopedi lum wardi i
Summerh)。
2 材料类别 种子。
3 培养条件 种子萌发培养基: (1) 1/2MS+1 g·L-1活
性炭; (2) 1/2MS+100 mL·L-1椰子乳+1 g·L-1活性炭;
(3) VW+100 mL·L-1椰子乳 +1 g·L-1活性炭。原球
茎或类原球茎增殖培养基: (4) 1/2MS+0.5 g·L-1活
性炭 +50 mL·L-1椰子乳 +TDZ 0.5 mg·L-1 (单位下
同)+NAA 0.5; (5) 1/2MS+0.5 g·L-1活性炭+50 mL·L-1
椰子乳 +TDZ 1.0+NAA 0.5。原球茎或类原球茎
分化培养基: (6) 1/2MS+1 g·L-1活性炭 +6-BA 0.2+
NAA 0.5; (7) 1/2MS+1 g·L-1活性炭+6-BA 0.1+NAA
1.0。生根与壮苗培养基: (8) 1/2MS+2 g·L-1蛋白胨 +
1.5 g·L-1活性炭 +NAA 1.0+50 mL·L-1椰子乳; (9) 2
g·L-1花宝1号+2 g·L-1蛋白胨+1.5 g·L-1活性炭+ NAA
1.0+50 mL·L-1椰子乳; (10) 2 g·L-1花宝 1号 +2 g·L-1
蛋白胨+1.5 g·L-1活性炭+ NAA 1.0+50 mL·L-1椰子
乳 +50 g·L-1香蕉汁。以上培养基均附加 20 g·L-1
蔗糖、6.5 g·L-1琼脂固化, pH 5.2~5.4, 培养温度为
(25±2) ℃, 光照强度 30~40 μmol·m-2·s-1, 光照 12 h·d-1。
4 生长与分化情况
4.1 材料的无菌处理 收取彩云兜兰人工授粉250 d
的黄绿色荚果, 在4 ℃的冰箱中冷藏20 d后在超净
工作台上用75%酒精的棉球擦拭干净蒴果表面, 用
75%酒精中浸泡 30 s, 再用 0.1%升汞消毒 15 min,
无菌水冲洗 5次。用无菌滤纸吸干蒴果表面水分,
剪除上下两端, 纵向切开蒴果, 将浅褐色粉末状的
种子散落到培养基(1)、(2)和(3)上。
4.2 种子萌发 在光照条件下, 培养基(1)、(2)中, 种
子 20 d左右时膨大; 40 d左右时转绿形成原球茎,
萌发率约为 60%; 60 d时约 90%的原球茎上端出
芽(图 1), 培养基(2)中分化出的小苗生长状况比(1)
好, 说明椰子乳对彩云兜兰种子的萌发率影响不大,
但能促进小苗的生长。在培养基(3)中种子 15 d左
右膨大; 35 d左右转绿形成原球茎, 萌发率约为
70%; 50 d左右原球茎上端出芽, 但培养基(3)萌发
后的小苗生长较差, 如果不及时转瓶, 部分原球茎
和小苗会死亡, 其原因可能是1/2MS培养基比VW
培养基含有更为全面的矿物质有关。
图 1 彩云兜兰的无菌萌发
4.3 原球茎或类原球茎的增殖 将初代培养原球茎
转接到培养基(4)、(5)中, 均能形成类原球茎并有部
分分化出芽, 其中(5)中形成类原球茎的效果明显比
(4)好, 只有少数分化出芽, 而(4)中大部分原球茎分
化出芽, 而只有少数原球茎形成类原球茎。培养基
(5)中, 在 60 d的继代周期内原球茎可增殖到2.5倍
左右; 将(5)中形成的类原球茎再转接到相同的培养
基上培养, 60 d的继代周期内, 类原球茎的增殖倍
数可增殖到3倍左右; 在类原球茎增殖的过程中, 类
原球茎还会同时分化出芽形成类原球茎和芽的混合
体(图 2 )。
植物生理学通讯 第 45卷 第 10期,2009年 10月1012
4.4 原球茎或类原球茎的分化 将原球茎或类原球
茎和芽的混合体转接到分化培养基(6)、(7)中, (7)
的分化效果比(6)好, (6)中在原球茎或类原球茎分化
出芽的同时, 还有较多的类原球茎的形成; 而(7)原
球茎或类原球茎分化出芽的数量较多, 分化率可达
80%以上。
4.5 生根与壮苗 将分化出具有2~3片叶、叶长1.0~
1.5 cm的小苗转入培养基(8)~(10)上培养, 生根率
均可达 100%, 每株有 3~4条根。其中培养基(10)
最适合小苗的生长, 植株生长健壮, 根系正常(图3);
培养基(8)上的植株根系较差, 苗生长也较弱; 培养
基(9)中根系过于粗壮、发达, 苗生长较差。
温度, 7 d内不要浇水, 成活率均可达 95%以上。
30 d左右植株恢复生长, 此时应进行正常水、肥和
农药管理。
5 意义与进展 彩云兜兰属于兰科兜兰属, 原产我
国云南西部和缅甸北部, 其叶片上有深浅蓝绿相间
的网格斑, 花葶直立、花单朵, 花瓣绿白色, 有浅
紫褐色晕, 唇瓣拖鞋状(图4), 花期12月至翌年3月,
正值我国的春节期间, 花期长达 1个月以上, 是一
种值得推广的名贵观赏花卉。由于长期无节制的
乱采滥挖, 彩云兜兰已濒临灭绝, 属于 “野生动植
物濒危物种国际贸易公约 ” (CITES)附录 I的保护
对象而被禁止贸易, 在中国物种红色名录中被列入
极危物种(CR)。彩云兜兰的常规繁殖常采用分株
繁殖, 繁殖系数低, 而其种子无胚乳, 在野外需与真
菌共生才能萌发, 发芽率极低。通过无菌播种和组
织能获得大量种苗用于野外自然回归和商品花卉生
产。同属植物中的杏黄兜兰(陈之林等 2004; 丁长
春等 2005)、硬叶兜兰(陈之林等 2004)、带叶兜
兰(曾宋君等 2006)、同色兜兰(王莲辉等 2008)的
无菌播种和组织培养已有过报道, 但彩云兜兰种子
离体快速繁殖报道尚未见到。
图 2 彩云兜兰的原球茎和类原球茎分化成芽
图 3 彩云兜兰的生根培养
4.6 出瓶移栽 当小苗长至 4~5 cm高时, 将培养瓶
置于温棚中炼苗1周后, 从培养瓶中取出生根苗, 洗
净根部附着的培养基, 洗净晾干水分后, 种植于口
径 5 cm的塑料营养杯中, 置于通风的温室中栽培。
种植基质采用水浸泡过的树皮、陶粒和兰石的混
合基质(1:1:2)中或进口水苔, 种植后喷施 800倍多
菌灵杀菌液。栽培过程中, 注意保持适宜的湿度和
图 4 彩云兜兰母株花朵
参考文献
陈之林, 叶秀粼, 梁承邺, 段俊(2004). 杏黄兜兰和硬叶兜兰的种
子试管培养. 园艺学报, 31 (4): 540~542
丁长春, 虞泓, 刘方媛, 魏兴强(2005). 杏黄兜兰胚培养与快速繁
殖. 植物生理学通讯, 41 (1): 55~56
王莲辉, 姜运力, 余金勇, 罗在柒, 陈景艳(2008). 同色兜兰的组
织培养与快速繁殖. 植物生理学通讯, 44 (6): 1171~1172
曾宋君, 陈之林, 段俊(2006). 带叶兜兰的无菌播种和离体快速
繁殖. 植物生理学通讯, 42 (2): 247